16SrRNA SOP文件
微生物多样研究—16SrRNA基因功能代谢预测
微生物多样研究—16SrRNA基因功能代谢预测1. 16S rRNA基因功能代谢预测•对于微生物生态学研究，我们最关注的无疑是菌群所具备的代谢功能。
随着数据分析技术的发展，我们现在已能根据已知的微生物基因组数据，对菌群组成的测序数据（典型的如16SrRNA基因的测序结果）进行菌群代谢功能的预测，从而把物种的“身份” 和它们的“功能”对应起来。
•根据菌群代谢功能预测结果，一方面能一窥菌群功能谱的概貌，发挥菌群多样性组成谱测序性价比高的优势；另一方面也能帮助指导后续宏基因组Denovo鸟枪法测序的实验设计，更合理地筛选用于后续研究的样本。
2. PICRUSt功能预测分析PICRUSt（PhylogeneticInvestigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）是由美国哈佛大学的CurtisHuttenhower课题组开发的菌群代谢功能预测工具，通过将现有的16SrRNA基因测序数据与代谢功能已知的微生物参考基因组数据库相对比，从而实现对细菌和古菌代谢功能的预测；预测过程中还考虑了不同物种16SrRNA基因拷贝数的差异，并对原始数据中的物种丰度数据进行校正，使预测结果更准确可靠。
分析的总体思路如下：1.先根据已测微生物基因组的16SrRNA基因全长序列，推断它们的共同祖先的基因功能谱；2.对Greengenes 16SrRNA基因全长序列数据库中其它未测物种的基因功能谱进行推断，构建古菌和细菌域全谱系的基因功能预测谱；3.将测序得到的16S rRNA基因序列数据与Greengenes数据库比对，寻找每一条测序序列的“参考序列最近邻居”，并归为参考OTU；4.根据“参考序列最近邻居”的rRNA基因拷贝数，对获得的OTU丰度矩阵进行校正；5.最后，将菌群组成数据“映射”到已知的基因功能谱数据库中，实现对菌群代谢功能的预测。
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电泳及系统发育分析
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析来自操作步骤成分 水
10×GC Buffer dNTPs 16Sp1 16S p2
基因组DNA Taq酶
贮液浓度 ——
Mg2+ Plus 2.5mmol 10pmol/μl 10pmol/μl 100μg/ml
5U/μl
使用量(20μl体系) 14μl 2μl 0.5μl 1 μl 1μl 1μl 0.5μl
实验一16SrRNA基因的 PCR扩增电泳及系统发
育分析
2020/11/17
实验一16SrRNA基因的PCR扩增电 泳及系统发育分析
实验内容
♣16S rRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析 ♣染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 ♣ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达 ♣ 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性 ♣ 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取
1 AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAGC 61 GGTAAGGCTC CTTCGGGAGT ACACGAGCGG CGAACGGGTG AGTAACACGT GAGTAATCTG 121 CCCTCCACTT TGGGATAAGC CTCGGAAACG AGGTCTAATA CCGAATACGA CCACTTCCTG 181 CATGGGATGG TGGTGGAAAG TTTTTTCGGT GGGGGATGTG CTCGCGGCCT ATCAGCTTGT 241 TGGTGGGGTA ATGGCCTACC AAGGCTTCGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GTGACCGGCC 301 ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGGAC 361 AATGGGCGGA AGCCTGATCC AGCAACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC GGGTTGTAAA 421 CCTCTTTCAG CGGGGACGAA GCGCAAGTGA CGGTACCCGC AGAAGAAGCA CCGGCCAACT 481 ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG TGCGAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA 541 AAGGGCTCGT AGGCGGTTTG TCGCGTCGGG AGTGAAAACA CCGGGCTTAA CTCGGTGCTT 601 GCTTTCGATA CGGGCAGACT AGAGGTATTC AGGGGAGAAC GGAATTCCTG GTGTAGCGGT 661 GAAATGCGCA GATATCAGGA GGAACACCGG TGGCGAAGGC GGTTCTCTGG GAATATCCTG 721 ACGCTGAGGA GCGAAAGTGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACACCG 781 TAAACGTTGG GCGCTAGGTG TGGGATCCAT TCCACGGGTT CCGTGCCGCA GCTAACGCAT 841 TAAGCGCCCC GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC 901 CCGCACAAGC GGCGGAGCAT GCGGATTAAT TCGATGCAAC GCGAAGAACC TTACCTGGGT 961 TTGACATACA CCGGAAAGCT GCAGAGATGT AGCCCCTTTT AGTCGGTGTA CAGGTGGTGC 1021 ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC 1081 TCGTCCTATG TTGCCAGCAA GCCTTCGGGT GTTGGGGACT CATAGGAGAC TGCCGGGGTC 1141 AACTCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAG TCATCATGCC CCTTATGTCC AGGGCTTCAC 1201 GCATGCTACA ATGGCCGGTA CAAAGGGCTG CGATCCCGTG AGGGGGAGCG AATCCCAAAA 1261 AGCCGGTCTC AGTTCGGATT GGGGTCTGCA ACTCGACCCC ATGAAGTCGG AGTCGCTAGT 1321 AATCGCAGAT CAGCAACGCT GCGGTGAATA CGTTCCCGGG CCTTGTACAC ACCGCCCGTC 1381 ACGTCACGAA AGTCGGCAAC ACCCGAAGCC GGTGGCCTAA CCCTTGTGGA GGGAGCCGTC 1441 GAAGGTGGGG CTGGCGTTTG GGACGAAGTC GTAACAAGGT AGCCGTA
16s rrna报告解读
16s rrna报告解读摘要：1.16s rRNA简介2.16s rRNA报告解读方法3.报告结果分析与应用4.报告的局限性与未来发展方向正文：随着分子生物学技术的发展，16s rRNA报告已成为微生物学、生态学等领域的重要研究手段。
16s rRNA是细菌核糖体的一部分，具有种属特异性，可通过高通量测序技术对微生物群落进行定性和定量分析。
本文将介绍16s rRNA报告的解读方法、结果分析与应用，以及报告的局限性与未来发展方向。
一、16s rRNA简介16s rRNA存在于细菌细胞中，负责蛋白质生物合成。
由于不同细菌物种的16s rRNA序列存在差异，可通过测定该序列对微生物进行分类和鉴定。
目前，16s rRNA测序已成为微生物多样性研究的主要手段。
二、16s rRNA报告解读方法1.序列分析：将测序得到的原始数据进行质控、比对、组装等处理，得到序列。
然后，通过序列之间的相似性分析，对微生物物种进行分类和鉴定。
2.生物信息学分析：基于序列数据，进行物种多样性、群落结构、代谢途径等分析。
常用的生物信息学工具包括MetaPhlAn、Kraken等。
3.统计分析：对生物信息学结果进行统计，评估样本间的差异性和相似性，为实验结果提供依据。
三、报告结果分析与应用1.物种多样性分析：通过统计不同物种的序列数量，评估样本中的微生物多样性。
2.群落结构分析：分析不同物种在样本中的相对丰度，揭示微生物群落的组成和变化。
3.功能基因分析：基于代谢途径和基因功能，分析微生物群落的代谢活性。
4.应用：16s rRNA报告可用于医学、环境、农业等领域的微生物学研究，为疾病诊断、环境保护、农业生产等提供科学依据。
四、报告的局限性与未来发展方向1.局限性：16s rRNA报告无法区分共生和病原微生物，且受样本制备和测序深度等因素影响。
2.未来发展方向：发展更高效的测序技术、生物信息学方法，以及整合多组学数据进行综合分析，提高报告的准确性和应用价值。
16SrDNA鉴定菌株地实用标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA 的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well ThermalCycler ； 凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB3130 3.2 试剂DNA 快速提取试剂：PrepMan Ultra ；琼脂糖；PCR 试剂：Taq 酶，10×Taq Buffer(Mg 2+)，dNTPs ，ddH 2O 等； ExoSAP-IT ；测序试剂：BigDye Terminator ，5×Sequencing Buffer ；BigDye XTerminator Purification Kit ； 3.3 耗材移液器吸头：1000μL 、200μL 、10μL ；离心管：1.5mL 、200μL ；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate ；Micro Amp TM Optical Adhesive Film ； 3.4 引物16SrDNA 名称 序列扩增长度 第1部分正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' 500 bp 左右反向引物519R 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3' 第2部分 正向引物357F 5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 750bp 左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3' 第3部分 正向引物926F 5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3' 560 bp 左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'4. 操作流程5. 实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，O等； ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator ddH2Purification Kit；3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well ReactionPlate；Micro Amp TM Optical Adhesive Film；3.4引物16SrDNA 名称序列扩增长度第1部分正向引物27F5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'500 bp左右反向引物519R5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3'750bp左右反向引物1115R5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3'第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp左右反向引物1492R5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:1 4.操作流程5.实验方法5.1 核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra 的离心管中，涡旋震荡混匀30s 左右，然后100℃水浴10min 后，以离心机最大转速离心3min ，取10μL 上清液与490μL ddH 2O （即稀释50倍），混匀作为下步PCR 的模板DNA 。
制备大肠杆菌的16SrRNA基因重组体及重组体的转化的实验方
制备大肠杆菌的16SrRNA基因重组体及重组体的转
化的实验方
(1)接种单菌落于2ml LB培养液中，37℃过夜。
(2)取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至
A590=0.4～0.6。
(3)倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。
(4)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl25ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。
(5)缓慢加入75mmol/L预冷CaCl21.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。
2.重组 DNA的转化
(1)将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记：
(2)冰浴30min至1h。
中间摇动3次，以防受体菌沉底。
(3)42℃90s。
(4)37℃水浴5min。
(5)加入无相应抗生素的Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。
(6)分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。
猪链球菌的分离、16S rRNA鉴定及药敏试验
养猪 Ｓ ＷＩ Ｎ Ｅ Ｐ Ｒ Ｏ Ｄ Ｕ Ｃ Ｔ Ｉ Ｏ Ｎ ｆ ３ ３ １
２ ０ １ ５
猪链球菌 的分离 、 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ 鉴 定 及 药 敏 试 验
何 芳， 周 望平 ， 邱 美珍 ， 杨 俊 （ 湖南省畜牧 兽医研 究所 ， 湖南 长沙 ４ １ ０ １ ３ １ ）
作者简 介 ： 何 芳（ １ ９ ７ ３ 一 ） ， 女， 湖检 测和 测序
向为 动 物 疫 病 防控 ． Ｅ — ｍａ ｉ ｌ ： ７ ５ ｏ ０ ８ １ ７ ６ ＠ｑ ｑ ． ｃ ｏ ｍ
１ ． ５ ． １ 细 菌基 因组 Ｄ Ｎ Ａ的提取
猪链球菌病是一种人畜共忠 的急性、热性传 染 病料 。鲜血琼脂、 巧克力琼脂购 自江门市凯林贸易有 病， 可致猪脑膜炎、 关节炎 、 肺炎 、 心 内膜炎、 多发性浆 限公司， 即用型 Ｐ Ｃ Ｒ Ｍ ｉ ｘ 试剂盒购 白 北京天恩泽基因 膜炎［ １ 】 。 临床表现为急性 出血性败血症、 哺乳仔猪下痢 科技有 限公司， 药敏纸片购 自杭州微生物试剂公司。 和怀孕母猪流产等， 可致 生猪死亡 ， 危害较严重 。 据报 １ － ２ 试验 时 间 与 地 点 道， 猪链球菌血清型众多 ， 目前有 ３ ５ 个血清型 ， 而且 试验 时问为 ２ ０ １ ４年 ５ —７月，采样地 点为湖 南
中图分类号 ： ￥ ８ ５ ８ ． ２ ８ ２ ． ６ １ 文献标 志码 ：Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ２ — １ ９ ５ ７ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ３ — ０ １ ０ ８ — ０ ２
摘 要 从湖南某猪场病猪组织中分离出６ 株细菌， 通过培养形态、 菌落特征、 细菌染色特性、 镜检、 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ基因扩增及序列 Ｂ Ｌ Ａ Ｓ Ｔ 分析等系统鉴定 ， 确定为猪链球菌， ６ 株分离菌的 １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ基因序列与收录 菌株同源性为９ ９ ％； ２ 上。药物敏感性试验结果表 明， 分离细菌对头孢喹肟、 先锋霉素、 青霉素药物高度敏感。 关键词 猪链球菌 ； １ ６ Ｓ ｒ Ｒ Ｎ Ａ； 药敏试 验
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程
16SrDNA鉴定菌株的标准操作规程1.适用范围本标准规定了通过特定引物对细菌的16SrDNA片段进行PCR扩增，然后对扩增片段进行序列分析比对，快速获得细菌种属信息的操作规程。
本标准适用于未知细菌的快速种属分析，以及为细菌的生化鉴定提供指导信息。
2.方法和原理16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法。
细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。
16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列。
16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。
在 16S rRNA 分子中，可变区序列因细菌不同而异，恒定区序列基本保守，所以可利用恒定区序列设计引物，将16S rDNA片段扩增出来，利用可变区序列的差异来对不同菌属、菌种的细菌进行分类鉴定。
16SrDNA序列的前500bp序列变化较大，包含有丰富的细菌种属的特异性信息，所以对于绝大多数菌株来说，只需要第一对引物测前500bp序列即可鉴别出细菌的菌属。
针对科学论文发表或是前500bp无法鉴别的情况，需要进行16SrDNA的全序列扩增和测序，得到较为全面的16SrDNA的序列信息。
由于测序仪一次反应最多只能测出700bp的有效序列，为了结果的可靠性，通常将16SrDNA全长序列分成3部分进行测序。
3.设备和材料3.1器材移液器（1000μL、200μL 、100μL、10μL）；涡旋振荡器；Eppendorf MixMate；离心机；水浴锅；电泳仪；制冰机；低温冰箱；PCR仪：Veriti 96 Well Thermal Cycler；凝胶成像仪：VersaDoc MP 4000；基因分析仪：AB3500、AB31303.2试剂DNA快速提取试剂：PrepMan Ultra；琼脂糖；PCR试剂：Taq酶，10×Taq Buffer(Mg2+)，dNTPs，ddH2O等；ExoSAP-IT；测序试剂：BigDye Terminator，5×Sequencing Buffer；BigDye XTerminator Purification Kit；3.3耗材移液器吸头：1000μL、200μL、10μL；离心管：1.5mL、200μL；Micro Amp TM Optical 96-Well Reaction Plate；页脚内容2Micro Amp TM Optical Adhesive Film ；3.4 引物16SrDNA 名称 序列 扩增长度第1部分 正向引物27F 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'500 bp 左右反向引物519R 5'- GWA TTA CCG CGG CKG CTG -3'第2部分正向引物357F5'- CTC CTA CGG GAG GCA GCA G-3' 750bp 左右反向引物1115R 5'-AGG GTT GCG CTC GTT GC-3' 第3部分正向引物926F5'- AAA CTY AAA KGA ATT GAC GG-3'560 bp 左右反向引物1492R 5'-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3'其中M=C:A, Y=C:T. K=G:T, R=A:G, S=G:C. W=A:T; all 1:14. 操作流程5.实验方法5.1核酸提取：挑取单菌落，然后置于装有100μLPrepMan Ultra的离心管中，涡旋震荡混匀30s左右，然后100℃水浴10min后，以离心机最大转速离心3min，取10μL上清液与490μL ddH2O（即稀释50倍），混匀作为下步PCR的模板DNA。
16S-rRNA基因序列鉴定细菌的通用解释标准
序列的类型
相似度差是否.0%
模式菌株
是
属名和种名
≥99.0%
模式菌株
否（与他多个种的相似度差小于0.8%）
属名和多个种名
低鉴定度的鉴定
97.0-98.9%
模式菌株或有效命名的菌株
能与其他属区分
属
需注明“亲缘关系最近的菌种”
95.0-96.9
模式菌株或有效命名的菌株
可能的新属新种，并注明“亲缘关系最近的菌属”
< 95%
模式菌株或有效命名的菌株
可能的新属新种
对于临床菌株，美国CLSI组织的文件MM-18A《DNA靶基因序列鉴定细菌和真菌的解释标准；批准指南》详细介绍了广谱基因测序技术（broad-range gene sequencing）在细菌与真菌鉴定中的应用，其中综合了细菌的生化反应、rRNA靶基因与其他靶基因序列分析的方法。
表16S rRNA基因序列鉴定细菌的通用解释标准
16srrna鉴定菌株的标准操作规程
16srrna鉴定菌株的标准操作规程1. 准备工作：清洗实验室器具、准备培养基和试剂、保持操作环境的无菌状态。
2. 提取细菌样品：从菌落、液体培养基或环境样品中选择一个菌落较纯净的菌株。
使用无菌操作工具，在无菌条件下，用菌液或菌落均匀涂抹于无菌平板上。
3. 培养菌株：将无菌平板培养基转移到适合该菌株生长的培养条件下。
通常情况下，大多数菌株可以在37℃下培养24小时后获得足够的菌量。
4. 提取菌株的16S rRNA基因：使用合适的菌株提取方法提取菌株的总DNA，并使用PCR方法扩增16S rRNA基因。
PCR 反应条件可根据实验室的标准方法或相关文献进行设置。
5. 准备电泳样品：将扩增的16S rRNA基因产物与DNA分子量标记物一同混合，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测。
6. 电泳分析：将准备好的电泳样品注入琼脂糖凝胶孔中，进行电泳分析。
根据相对位置和迁移速度，确定16S rRNA基因的大小。
7. 分离目标DNA带：使用无菌操作工具，在琼脂糖凝胶上切割目标DNA带。
8. 提取目标DNA带：使用合适的目标DNA提取方法，从琼脂糖凝胶上提取目标DNA带。
9. DNA序列测定：将提取的目标DNA带进行测序，可以委托测序机构进行测序，也可以使用实验室的测序设备进行测序。
10. 序列分析：使用生物信息学工具对测序结果进行分析，包括序列比对、物种鉴定和进化分析等。
11. 物种鉴定结果的确认：将测序结果与数据库中的已知序列进行比对，确定菌株的物种鉴定结果。
12. 数据和结果的解释：根据测序结果和数据库比对结果进行数据分析和结果解释。
上述是针对16S rRNA基因进行鉴定的一般操作流程，具体操作规程可能因实验室的要求和设备的不同而有所差异。
实施过程中应始终保持无菌操作，确保结果的准确性和可靠性。
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16SrRNA SOP文件
检测方法：
（一）细菌基因组DNA的提取：
向200µl的无菌PCR管中加入50µl无菌水，挑取已纯化的单个菌落于其中充分混匀，调制菌液至1-2浊度，震荡15秒钟，盖好管盖置100℃沸水中煮沸
10min，取出后于冰上放置3—5分钟后，13000转离心5分钟，取上清液约
30ul即为DNA提取液
（二）16SrRNA基因的PCR扩增：50 µl 体系
2×PCR Mix 25 µl
上游引物：1µl
下游引物：1µl
Taq DNA聚合酶（5 U/µl）0.5µl
DNA 模板 1 µl
ddH2O 21.5µl
16SrRNA基因的检测引物：
27F：5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3’
1492R: 5’-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGAC-3’
16SrRNA基因的PCR反应参数：
94 ℃8 min；
94 ℃40 s
55 ℃(53℃) 40 s 30循环
72 ℃1 min 30 s
72 ℃8 min
4℃保存
注：每次配制PCR反应体系时，应多制备一个体积，以防由于（三）琼脂糖电泳检测：
1×TAE电泳缓冲液的配制：
50×TAE缓冲液：Tris碱121g，冰醋酸28.56mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）50mL，加去离子水定容至500ml室温保存备用，使用时先将50×TAE缓冲液稀释成1×TAE缓冲液。
1%琼脂糖凝胶的配制：
称取0.3g琼脂糖，加入30 mL 1×TAE电泳缓冲液，于微波炉中加热溶解，取出后用水冷却至50℃，加入,3µl的goldview核酸染料；将上样梳固定于胶槽内，将制备好的胶液小心地倒入胶板内，使胶液缓慢展平，确保没有气泡后，将胶槽于室温放置使胶液完全凝固。
胶液完全凝固后，将凝胶置于电泳槽内，添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板1—2mm，取4µl产物于胶孔内，100V电泳25分钟。
检测：
将电泳后的凝胶于紫外线下观察，16SrRNA基因的条带位于1500bp处。