免疫印迹操作步骤
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色二、实验步骤1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗涤3 次；5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。
下面将详细介绍WB实验的具体步骤。
1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。
使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。
再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。
2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。
3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。
电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。
电泳结束后，将凝胶转移到膜上。
4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。
5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。
常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。
6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。
一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。
7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。
8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。
10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。
最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。
11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。
需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。
同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
免疫印迹分析流程
免疫印迹分析流程
免疫印迹分析(Western Blot)是一种常用的蛋白质分析方法。
它的基本流程包括:
1. 样品制备:提取并定量蛋白质样本。
常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
2. 电泳分离蛋白:使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质。
根据分子量的不同,蛋白质会在凝胶上分离成不同的条带。
3. 转膜:将凝胶中的蛋白转移到NC膜或PVDF膜上。
4. 滤膜:使用5%脱脂奶粉或BSA在室温封闭1小时,以阻断膜胶的非特异性结合位点。
5. 一抗反应:加入特异性的一抗,孵育过夜。
一抗与目标蛋白特异性结合。
6. 二抗反应:洗涤后加入连接HRP的二抗,孵育1-2小时。
二抗与一抗结合。
7. ECL显色:滴加显影液,HRP催化发光底物氧化产生发光信号。
8. 凝胶成像:曝光、扫描和记录结果。
目标蛋白会出现特异性的条带。
9. 数据分析:通过条带的位置和强度分析目标蛋白的相对分子量和表达量。
以上是免疫印迹分析的基本流程。
根据实验目的,可以选择不同的样品制备方法、凝胶系统、转膜系统等,从而实现对蛋白质的分离、定量和功能分析。
免疫印迹(Western blot)法标准操作规程
免疫印迹（Western blot）法标准操作规程
一、适用范围
适用于实验室从事免疫印迹实验的实验技术人员和研究生。
二、操作规程
1、所需试剂：30%的储备胶溶液，1M Tris-HCl pH8.0，1.5M Tris-HCl PH6.8，10%SDS 溶液，TEMED，10% APS溶液，10X电泳缓冲液，2X SDS电泳上样缓冲液，考马斯亮蓝染色液，脱色液，转膜缓冲液（TBS），0.01M PBS，丽春红染液，封闭液（5%的脱脂奶粉TBS），相应的一抗、二抗等。
2、规程：
1）SDS-PAGE电泳规程见SDS-PAGE SOP
2）电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，3次×5min。
3）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中，10min。
4）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极（+）碳板、滤纸、NC膜、凝胶、滤纸、阴极（—）碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，装入电泳转移槽中，接通电源，恒流1mA/cm2，转移1.5hr或18V过夜，转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹。
3）封闭：将膜转入一容器中加入封闭液，于摇床上室温振荡2H；
4）加入一抗：弃去封闭液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次，按合适稀释比例加入一抗，液体必须覆盖膜的全部，4℃过夜。
5）洗膜：取出NC膜，用PBS洗膜，3次×5min；
6）加入二抗：加入适当比例二抗，于摇床上室温振荡2h；
7）曝光、显影：用PBS洗膜，3次×5min，配制显色液（按说明书要求），将膜浸入其中片刻后压片，通过曝光时间的长短调节蛋白条带的亮度和背景的强弱。
免疫印迹操作步骤
免疫印迹操作步骤western blot 超详细步骤一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP 管中，编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。
3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。
2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。
测出待测蛋白浓度。
测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。
按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。
样品于-80℃保存。
三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂10%H2O(ml) 4.030%丙烯酰胺3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED(μl) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(μl) 4010%AP(μl) 30TEMED(μl) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法，又称蛋白质印迹或Western Blotting，是一种利用抗
原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
以下是其基本步骤：
1. 取样：取上清液作为样品。
2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3. 转移：通过半干式转移，将电泳后的凝胶上的蛋白质转移到膜上。
这个过程包括割胶、平衡、膜处理、转膜等步骤。
其中，转膜是关键步骤，需要将凝胶上的蛋白质精确转移到NC膜上，滤纸、凝胶、NC膜需要精确对齐，
去除气泡，并在恒流1mA/cm2下转移小时。
4. 免疫检测：在转移后的膜上，利用抗体进行检测。
这一步通常包括一抗和二抗的结合，以及通过化学发光检测或其他方法检测到结合的抗体。
5. 结果分析：通过对比染色结果和标准条带，可以分析出样品中特定蛋白质的表达情况。
此外，阴性对照是以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
以上信息仅供参考，具体步骤可能会根据实验需求和条件有所不同，建议咨询专业人士获取具体信息。
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1．主要内容
检测限为2—20fmol，或约0．1～lng的50kDa蛋白质
有多个操作步骤，需2天(或1天)时间完成。
检测抗原的存在，定量及其大小。
半定量至全定量。
抗原的检测依赖于耐变性的表位。
一般，低亲和力抗体亦可使用。
2．操作步骤
(1)将蛋白质溶解于Laemmli样品缓冲液中。
最终的样品缓冲液条件是2％SDS、100mmol／LDTT(从lmol ／L的储存液中取出，临用前加入，该储存液置于—20℃冷冻保存)、60mmol／LTris(pH6．8)、0。
01％溴酚蓝和10％甘油。
全细胞可直接放在样品缓冲液中进行溶解；纯化或部分纯化的溶液可用2％的样品缓冲液1：1进行稀释。
加热至70℃10min。
最终蛋白质浓度应不超过150ug／每孔(微型胶不超过15pg／每孔)。
(2)将样品放在SDS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，移去平板，将凝胶剪成适当大小以进行转印。
在凝胶上作记号以确定方向。
(3)剪1张硝酸纤维素膜和4张吸附滤纸(Whatman 3MM或替代物)，其大小与凝胶相当。
(4)将硝酸纤维素膜放入蒸馏水中润湿。
将膜转入转印缓冲液中浸泡5min。
将吸水纸浸泡于转印缓冲液中。
转印缓冲液1(20 000～400 000kDa蛋白质)：48mmol／LTris，390mmol／L甘氨酸、0．1％(w／v)SDS、20％甲醇加蒸馏水至1000ml。
转印缓冲液2(<80 000kDa蛋白质)：25mmol／LTris、190mol／L甘氨酸、20％甲醇加蒸馏水至1000ml。
(5)将凝胶、印迹膜、滤纸和支持垫浸入转印缓冲液中使其完全浸泡。
小心地将支持垫中的气泡排出。
(6)组装转印夹层组合：依次为支持垫、2张吸水纸、凝胶、膜、2张吸水纸和支持垫。
将组装好的夹层组合放入转印槽中，并使膜靠近正极(阳极，红色电极)。
(7)于4C条件下转印过夜。
分子质量>100 000kDa的蛋白质，先在28V转印1h，然后在84V转印14～16h。
分子质量<100 000kDa的蛋白质，63V转印4～16h。
(8)转印完成后，断开电源。
卸下夹层组合装置，并在硝酸纤维素膜上作记号以保持原来的方向。
(9)用PBS将膜清洗数次。
(10)在室温下将膜放入5％脱脂奶粉／PBS中搅动孵育2h。
然后从封闭液中取出印迹膜并用PBS漂洗2次，每次5min。
(11)加入一抗溶液。
15cmXl5cm印迹膜用10ml。
所有的溶液均用3％BSA／PBS进行稀释。
(12)在室温下将膜和抗体搅动孵育1h。
用PBS将膜漂洗4次，每次换液洗5rain。
(13)加入辣根过氧化物酶标记的二抗试剂。
所有的溶液均用3％BSA／PBS进行稀释。
对组织培养上清可以不稀释或1：10稀释。
这样获得的抗体浓度为1Ps／ml和50ug／ml。
如果是多克隆抗血清或腹水，将10ul 稀释至10ml即可。
如果抗体的浓度尚未知，需作若干稀释度以确定正确的浓度范围。
(14)在室温下搅动孵育1h。
用PBS将膜漂洗4次，每次换液洗5min。
(15)在临用前，新鲜配制化学发光试剂。
由于该试剂的半衰期非常短，故应按需配制。
将膜放入此液内孵育lmin。
(16)用纸巾吸去印迹膜边缘或边角部分过多的化学发光试剂。
将印迹膜放入塑料袋中以确保干的表面与胶片接触。
(17)将印迹膜在暗室中使胶片曝光lmin。
冲洗胶片以确定待测抗原的正确曝光时间。
曝光时间可短至几秒钟，也可长达数小时。