免疫印迹常用试剂(除一抗外)
实验报告三--免疫印迹
实验三：免疫印迹1 原理免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
本试验采用湿法转移。
免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。
大多数应用前者。
本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。
转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。
目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。
本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。
2 试剂与仪器2.1 试剂（所有试剂均供两组用）2.1.1 转移缓冲液Tris 3.025g甘氨酸14.413g甲醇20mL加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS)Tris 2.42gNaCl 27.750g加蒸馏水约800mL，调pH至7.5，定容1000mL2.1.3 TTBSTBS 800mLTween-20 400μl2.1.4 封闭液及抗体稀释液脱脂奶粉0.3gTBS 100mL2.1.5 底物溶液二氨基联苯胺（DAB） 5.0mgTBS 18mLH2O220μl 临用前配2.1.6 丽春红总蛋白质染色液丽春红1g4%乙酸100mL2.1.7 5%小牛血清生理盐水小牛血清7.5mL0.85%生理盐水定容至150mL2.1.8 酶标抗IgG（1：1500）酶标抗IgG 0.1mL5%小牛血清生理盐水定容至150mL2.2 仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸3 试验步骤3.1 SDS-PAGE电泳分离所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从略。
免疫印迹常用试剂(除一抗外)
200µg/0.2ml 1000µg/1ml 浓缩液 亲和纯化抗体
产品应用
WB=1:200-500 Elisa =1:1000-2000 IP=1:20-100 IHC=1:200-500
2.酶标二抗
产品编号
bse-0295G
英文名称
Goat Anti-Rabbit IgG/HRP
中文名称
辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG
产品标准
1L（100ml浓缩液）
产品应用
蛋白印迹(Western Blot,WB)
13.WB洗涤液
产品编号
C-0043
英文名称
WesternBlotWashBuffer
中文名称
WB洗涤液
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
分子生物学试剂
产品价格
30ml/48元 70ml/78元
产品标准
10X浓缩液
免疫印迹常用试剂（除一抗外）
1.内参抗体
产品编号
bs-0061R
英文名称
β-Actin(内参抗体)
中文名称
β-肌动蛋白（抗体）（浓缩液）
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
兔抗人、羊、狗、猪、牛、兔、鸡、猴和大、小鼠β-Actin多克隆抗体
产品价格
0.1ml/400元 0.2ml/650元 1ml/1860元
产品编号
C-0075
中文名称
KODAK胶片
生产产地
KODAK原装
产品类别
曝光胶片
产品价格
100张/盒/240元
产品标准
5X7英寸
产品应用
转膜曝光
17.硝酸纤维素膜
免疫印迹实验报告
免疫印迹实验报告一、实验目的免疫印迹（Western blotting）是一种广泛应用于分子生物学、生物化学和免疫学等领域的技术，用于检测和定量特定蛋白质在样品中的表达水平。
本次实验的目的是通过免疫印迹技术检测目标蛋白在不同样品中的表达情况，以验证实验假设并为进一步的研究提供数据支持。
二、实验原理免疫印迹实验基于抗原抗体特异性结合的原理。
首先，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白质样品按照分子量大小分离。
然后，将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜）上。
接着，膜与特异性抗体进行孵育，使抗体与目标蛋白结合。
最后，通过检测抗体的存在来确定目标蛋白的表达水平。
检测抗体的方法通常包括使用酶标记的二抗结合底物产生显色或发光信号，或者使用荧光标记的二抗通过荧光检测系统进行检测。
三、实验材料和设备1、材料细胞裂解液蛋白酶抑制剂蛋白标准品一抗（特异性针对目标蛋白）二抗（酶标记或荧光标记）化学发光底物（或荧光检测试剂）预染蛋白分子量标准硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜电泳缓冲液转膜缓冲液封闭液（如脱脂奶粉或牛血清白蛋白溶液）洗涤液（含吐温 20 的磷酸盐缓冲液）2、设备电泳仪和电泳槽转膜装置摇床冰箱酶标仪（或荧光检测仪器）四、实验步骤1、蛋白样品制备收集细胞或组织样本，加入适量的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上裂解一定时间。
离心收集上清液，即为蛋白样品。
2、 SDSPAGE 电泳制备 SDSPAGE 凝胶，根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶浓度。
将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性。
上样，进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。
3、转膜电泳结束后，将凝胶浸泡在转膜缓冲液中平衡。
按照“三明治”结构组装转膜装置，依次为阴极、滤纸、凝胶、膜、滤纸、阳极。
在冰浴或冷室中进行转膜，根据蛋白分子量和转膜条件确定转膜时间。
4、封闭转膜结束后，将膜放入封闭液中，在摇床上孵育一定时间，以封闭非特异性结合位点。
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。
下面将详细介绍WB实验的具体步骤。
1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。
使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。
再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。
2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。
3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。
电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。
电泳结束后，将凝胶转移到膜上。
4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。
5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。
常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。
6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。
一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。
7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。
8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。
10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。
最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。
11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。
需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。
同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。
常用免疫组化试剂介绍
常用免疫组化试剂介绍概述免疫组化（IHC）是一门通过检测特定抗原在组织切片中的表达程度来揭示组织形态和细胞化学等方面信息的技术。
由于IHC是一种定性分析技术，所以该方法需要与定量技术（如分子生物学）结合使用，从而得到更准确的数据。
IHC涉及到多种试剂，其标记原理和表现形式各异，能够检测的抗原种类也不同。
本文将对常用的IHC试剂进行介绍，以此为指导，让大家更好地了解和应用IHC技术。
常用的免疫组化试剂抗原修复试剂抗原修复试剂（Antigen Retrieval）用于在组织样本中使细胞内蛋白与抗体亲和性和特异性增加。
这种试剂可通过热处理（如高压）或化学处理（如酶样蛋白和酸性处理）来复原被检测抗原的结构和功能。
常用的抗原修复试剂包括：EDTA、Tris、Citrate等。
原位杂交试剂原位杂交试剂（In Situ Hybridization）可检查DNA或RNA分子的特异性结合情况。
这种试剂可将RNA等分子与特定热稳定的蛋白质结合，用于检测基因突变等。
常用的原位杂交试剂包括：流式胶体金试剂、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、双链RNA原位杂交等。
细胞计数试剂细胞计数试剂（Cell Counting）用于获得细胞数量或结构变化。
这种试剂通常用于确定某一类细胞的数量、细胞计数和分离、细胞生长和分裂的应用。
常用的细胞计数试剂包括：皮质醇、14C-labeled thymidine等。
细胞信号转导试剂细胞信号转导试剂（Cell Signaling）用于研究细胞分子级别的通讯系统，并采取措施以确定物质在细胞内的作用机理。
常用的细胞信号转导试剂包括：抗体、试剂原和阻断类似物等。
同型抑制剂同型抑制剂（Isotype Control）用于在IHC实验中作为实验设计的对照组，以检测所观察的抗原与探测剂结合的特异性表现。
常用的同型抑制剂包括：IgG1、IgG2a和IgG2b等。
情况控制试剂情况控制试剂（Condition Control）用于确定IHC试验的最佳条件，包括温度、缓冲液、酸碱程度等。
免疫印迹(WB)实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色二、实验步骤1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗涤3 次；5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。
免疫印迹(Western blot)法标准操作规程
免疫印迹（Western blot）法标准操作规程
一、适用范围
适用于实验室从事免疫印迹实验的实验技术人员和研究生。
二、操作规程
1、所需试剂：30%的储备胶溶液，1M Tris-HCl pH8.0，1.5M Tris-HCl PH6.8，10%SDS 溶液，TEMED，10% APS溶液，10X电泳缓冲液，2X SDS电泳上样缓冲液，考马斯亮蓝染色液，脱色液，转膜缓冲液（TBS），0.01M PBS，丽春红染液，封闭液（5%的脱脂奶粉TBS），相应的一抗、二抗等。
2、规程：
1）SDS-PAGE电泳规程见SDS-PAGE SOP
2）电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，3次×5min。
3）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中，10min。
4）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极（+）碳板、滤纸、NC膜、凝胶、滤纸、阴极（—）碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，装入电泳转移槽中，接通电源，恒流1mA/cm2，转移1.5hr或18V过夜，转移结束后，断开电源将膜取出，割取待测膜条做免疫印迹。
3）封闭：将膜转入一容器中加入封闭液，于摇床上室温振荡2H；
4）加入一抗：弃去封闭液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次，按合适稀释比例加入一抗，液体必须覆盖膜的全部，4℃过夜。
5）洗膜：取出NC膜，用PBS洗膜，3次×5min；
6）加入二抗：加入适当比例二抗，于摇床上室温振荡2h；
7）曝光、显影：用PBS洗膜，3次×5min，配制显色液（按说明书要求），将膜浸入其中片刻后压片，通过曝光时间的长短调节蛋白条带的亮度和背景的强弱。
免疫电泳法所用试剂
免疫电泳法所用试剂
免疫电泳法所用的试剂主要包括以下几种：
1. 蛋白质样品：免疫电泳法主要用于分离和检测蛋白质，所以需要有待检样品。
2. 蛋白质分离胶：免疫电泳通常使用聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel）作为分离基质。
这需要一些成槽胶液和凝胶片，例如SDS-PAGE凝胶和非变性凝胶。
3. 输运缓冲液：用于运输蛋白质样品和抗体的缓冲液。
常用的有Tris缓冲液、磷酸缓冲液等。
4. 蛋白质标记物：用于标记待检蛋白质或抗体的标记物，常用的有酶标记物、荧光标记物等。
5. 蛋白质染色剂：用于染色展示分离蛋白质的染色剂，常用的有银染剂和考马斯亮蓝染剂等。
6. 抗体：免疫电泳需要使用特异性抗体与待检蛋白质结合，常用的包括一抗和二抗。
7. 标准蛋白：用于建立标准曲线，确定待检蛋白质的相对分子质量。
以上只是免疫电泳法所用试剂的一些常见例子，具体实验根据需要可能有所不同。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
标记抗体
产品价格
0.1ml/80元1ml/680元
产品标准
1mg/ml
产品应用
免疫学及分子生物学
3.组织细胞裂解液
产品编号
C-0013
英文名称
WIP(Tissue and Cell lysis solution for Western Blot and Immunoprecipitation)
免疫印迹常用试剂（除一抗外）
1.内参抗体
产品编号
bs-0061R
英文名称
β-Actin(内参抗体)
中文名称
β-肌动蛋白（抗体）（浓缩液）
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
兔抗人、羊、狗、猪、牛、兔、鸡、猴和大、小鼠β-Actin多克隆抗体
产品价格
0.1ml/400元0.2ml/650元1ml/1860元
常规抗体稀释液
产品应用
Western Blot,WB辅助试剂
12.电转移缓冲液（Western转膜液粉剂）
产品编号
C-0074
英文名称
Western Transfer Buffer
中文名称
电转移缓冲液（Western转膜液粉剂）
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
转膜液
产品价格
1L/50元
产品标准
中文名称
红细胞裂解液
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
分子生物学试剂
产品价格
100ml /100元200ml/160元
产品标准
适用于从1μl到10ml的血液样品中分离白细胞
产品应用
用于红细胞裂解(从血液样品中分离白细胞）
5.蛋白浓度测定试剂盒
产品编号
C-0018
英文名称
BCA(bicinchoninic acid)
中文名称
BCA蛋白浓度测定试剂盒
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
分子生物学试剂
产品价格
30ml/150次/80元70ml/350次/160元120ml/600次/300元
产品标准
蛋白标准（5mg/ml BSA）
产品应用
用于蛋白浓度的检测
6.SDS-PAGE凝胶制备试剂盒
产品编号
C-0047
英文名称
SDS-PAGE kit
中文名称
SDS-PAGE凝胶制备试剂盒
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
分子生物学试剂
产品价格
40-60块/260元
产品标准
40-60块SDS-PAGE凝胶/kit
产品应用
WB
6.Tris-甘氨酸蛋白电泳缓冲液(粉剂)
产品编号
C-0050
英文名称
SDS-PAGE Running Buffer
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
免疫印记辅助试剂
产品价格
0.5ml /48元1ml/80元
产品标准
0.5ml/1ml
产品应用
用于Western Blot常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样
8.考马斯亮蓝快速染色
产品编号
P1300-70/100
英文名称
Commassie Blue Fast Staining Solution
中文名称
WIP组织细胞裂解液（含使用方法说明）
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
分子生物学试剂
产品价格
30ml/40元70ml/80元100ml/120元
产品标准
国际通用标准
产品应用
用于组织细胞裂解
4.细胞裂解液
产品编号
C-0002
英文名称
ELS BufferSC (Erythrocyte Lysing Solution，ELS)
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
抗稀释液
产品价格
30ml/50元70ml/80元
产品标准
产品应用
蛋白印迹(Western Blot,WB)
11.WB二抗稀释液
产品编号
C-0029
中文名称
WB二抗稀释液
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
抗体稀释液
产品价格
30ml/50元70ml/90元
产品标准
中文名称
考马斯亮蓝快速染色液
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
化学试剂
产品价格
70ml/70元250ml/100元
产品标准
70ml/250ml
产品应用
用于SDS-PAGE或非变性PAGE蛋白电泳胶的快速染色，或Western转膜后PAGE胶上残余蛋白的检测
9.常用蛋白分子量标准Marker（需根据检预染Protein Marker
英文名称
Protein Marker蓝色预染Protein Marker
中文名称
次高蛋白分子量标准(43-200kDa)/5条带
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
免疫学及分子生物学试剂
产品价格
10次/280元10次/360元蓝色预染Protein Marker
产品标准
200µg/0.2ml 1000µg/1ml浓缩液亲和纯化抗体
产品应用
WB=1:200-500 Elisa =1:1000-2000 IP=1:20-100 IHC=1:200-500
2.酶标二抗
产品编号
bse-0295G
英文名称
Goat Anti-Rabbit IgG/HRP
中文名称
辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG
WesternBlotWashBuffer
14.ECL超敏发光液
产品编号
P1010
英文名称
Super ECL Plus Detection Reagent
中文名称
Western Blot ECL超敏发光液
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品标准
43-200kDa/5条带
产品应用
10T(次)
产品介绍
由5种已知氨基酸序列蛋白质分别纯化后混合而成的蛋白质溶液
分子量大小:（43、66.2、97.4、130、200、kDa）
10.WB一抗稀释液
产品编号
C-0044
英文名称
WB Anti-body Diluent
中文名称
WB一抗稀释液
生产产地
1L（100ml浓缩液）
产品应用
蛋白印迹(Western Blot,WB)
13.WB洗涤液
产品编号
C-0043
英文名称
WesternBlotWashBuffer
中文名称
WB洗涤液
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
分子生物学试剂
产品价格
30ml/48元70ml/78元
产品标准
10X浓缩液
产品应用
中文名称
Tris-甘氨酸蛋白电泳缓冲液(粉剂)
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
分子生物学试剂
产品价格
1L/150元
产品标准
1L/包
产品应用
Western Blot
7.蛋白电泳上样缓冲液
产品编号
C-0045
英文名称
SDS-PAGE loading buffer
中文名称
蛋白电泳上样缓冲液（5倍稀释）