细胞免疫组化常用试剂配制
免疫组化实验步骤
免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
理化实验配制方案
理化实验配制方案在进行理化实验时，不同的实验要求使用不同的试剂和药品，并且需要按照一定的比例和配制方法进行混合。
在进行实验前，正确的配制方案对于实验结果的准确性和可重现性非常重要。
本文将针对常见的理化实验，介绍一些常用的试剂配制方案。
pH缓冲溶液Phosphate Buffered Saline (PBS) 缓冲液PBS缓冲液是一种理化实验中常用的缓冲液，可以用于细胞培养、免疫组化等实验。
其配制方法如下：•向1L去离子水中加入8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、0.24g KH2PO4。
调节pH值至7.4。
•用0.22μm的无菌滤膜过滤，分装到无菌的50mL离心管中。
•灭菌，储存在4℃。
Tris-HCl缓冲液Tris-HCl缓冲液广泛用于生化实验和分子生物学实验中，其配制方法如下：•向800mL去离子水中加入Tris 11.1g, 调节pH值至所需值。
•加入到1L容量瓶中，用去离子水调至1L。
酶解液RIPA缓冲液RIPA缓冲液是广泛用于蛋白提取和酶解实验的缓冲液，其配制方法如下：•向1L去离子水中加入150mM NaCl、1% NP-40、0.5% sodium deoxycholate、0.1% SDS、50mM Tris-Cl pH 8.0、1mM EDTA。
•加入到1L容量瓶中，用去离子水调至1L。
Tris-HCl酶解液Tris-HCl酶解液是生化实验和分子生物学实验中常用的酶解液，其配制方法如下：•向1L去离子水中加入10mM Tris-HCl(pH8.2)、1mM EDTA、1% Triton X-100、0.1% SDS、50μg/ml Proteinase K。
•加入到1L容量瓶中，用去离子水调至1L。
其他试剂甲醛PBS固定液甲醛PBS固定液是常用的细胞固定液，可用于细胞培养、免疫组化等实验。
其配制方法如下：•向10ml PBS中加入1 ml 37%甲醛。
细胞免疫组化步骤
细胞免疫组化步骤（SABC法）实验准备：实验用品：移液枪、枪头、EP管、湿盒需要灭菌的东西：培养皿（可以是重复用的）、细胞爬片（多聚赖氨酸处理，并经过环氧乙烷消毒）、常规细胞培养物品。
试剂：细胞消化液、完全培养基、4%多聚赖氨酸、0.01M PBS（ph7.2-7.4）、3%H2O2（现配）、0.5%Txiton X-100、浓缩型SABC试剂盒（血清封闭液、二抗、三抗《SABC》）、苏木素、ddH2O、DAB显色试剂盒操作步骤：一、细胞爬片的制作1、细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬（4-5ml）或者密度为1-5x106/ml2、在灭菌的培养皿中铺上3块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠3、取细胞悬液分别滴到圆片上，注意不要滴到圆片外，让细胞贴片30min左右4、30min后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37°C，5%CO2培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢）。
二、组化前处理1、取出培养皿，用PBS漂洗2x2min（PBS可以不灭菌）2、4%多聚甲醛处理（室温）20min；3、PBS漂洗，3x2min；4、0.5%Txiton X-100 处理（室温）20min；5、PBS漂洗，3x2min；6、3%H2O2处理（室温）15min；7、PBS漂洗，3x2min；三、组化1、血清封闭：试剂盒中的血清封闭液，37°C，20min；2、取出甩干封闭液（不漂洗）；一抗（1：200）（PBS稀释），阴性对照用PBS代替一抗，37°C1-2h或4°C过夜；3、PBS漂洗，3x2min；4、二抗孵育：试剂盒中的生物素化...37°C，20min；5、PBS漂洗，3x2min；6、SABC孵育：湿盒内37°C，20min；7、PBS漂洗，3x4min；8、DAB显色：DAB试剂盒中的A、B、C三种试剂，我是按照500ul蒸馏水中各加4ul，混匀。
免疫组化(IHC)实验具体步骤及说明
免疫组化（IHC）实验具体步骤及说明一、试剂和溶液乙醇: 无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇抗原修复液: 0.01M 的柠檬酸钠缓冲液：58.82g 柠檬酸三钠及7.56g 柠檬酸溶于200ml 纯水，调pH 至6.0，纯水1:100 稀释为工作液3%过氧化氢-甲醇: 30%的过氧化氢与无水甲醇1:9 稀释10X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L 纯水，调pH 至7.4 洗涤液: 1×PBS：纯水稀释10× PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS（1×PBST）super block，生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent 二抗，酶标亲和素UltraTek HRP，DAB 显色试剂盒：Cat. KT1002a 抗体稀释液：3%BSA-PBS 0.5%盐酸-乙醇：0.5～1%盐酸，95.0-95.5%乙醇苏木素：苏木精2g 溶于250ml 无水乙醇，十六水合硫酸铝17.6g 溶与750ml 纯水，以上溶液充分混合，加入碘酸钠0.2g 和冰醋酸20ml二、实验步骤1.组织固定：烘箱温度65-75℃ 30min 或者65℃过夜；2.脱蜡：二甲苯浸泡三次，每次10 分钟；3.水化：依次经过无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；4.洗涤：自来水冲洗1 次，PBS 浸泡3min；5.抗原修复：放入稀释100 倍的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0) 中，高压锅煮沸10min，常温冷却30min；6.洗涤：纯水浸泡2 次，PBS 浸泡1 次，每次3min；7.灭活酶：室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min；8.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；9.封闭：加入适当体积的super block（KT1002a Reagent A），37℃温箱孵育5min；10.洗涤：纯水浸泡1 次，PBS 浸泡2 次，每次3min；11.一抗：加入反应体积为0.15ml，适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。
免疫组化实验方法
免疫组化用户自备试剂：1．粘片剂APES 或POLY-L-LYSINE（博士德公司有售）。
2．免疫组化专用PBS（pH7.2-7.6）配法：1000ml 蒸馏水中加氯化钠8.5g, Na2HPO42.8g,NaH2PO4 0.4g。
如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。
3．0.01M 枸橼酸盐缓冲液：1000ml 蒸馏水中加枸橼酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）3g, 枸橼酸(C6H8O7·H2O ) 0.4g。
4．DAB显色试剂盒（博士德公司有售）。
A.石蜡切片热修复抗原染色程序:1. 载玻片防脱片剂处理:可选择APES 或Poly-Lysine。
捞片后置烤箱58-60 ℃30-60 分以使切片紧密粘附。
2. 切片常规脱蜡至水。
脱蜡前，应将组织切片在室温中放置60min或60 °C 恒温箱中烘烤20min。
然后按下列步骤进行：1) 组织切片置于二甲苯中浸泡3 次，每次10 min ；2) 无水乙醇中浸泡3 次，每次10 min ；3) 依次通过质量分数为95% 、70% 、50% 的梯度乙醇溶液，每次 10 min ；4) PBS 中浸泡10 min 。
3. 30%H2O2 1 份+蒸馏水10 份混合,室温5-10 分钟以灭活内源性酶。
蒸馏水（可用PBS）洗3 次。
4. 热修复抗原:将切片浸入0.01M 柠檬酸钠缓冲液（PH6.0）,电炉或微波炉加热至沸腾后断电，间隔5-10 分钟后，反复1-2 次。
冷却后PBS（pH7.2-7.6）洗涤1-2 次。
5. 滴加5%BSA 封闭液,室温20 分钟。
甩去多余液体, 不洗。
6. 滴加适当稀释的一抗（小鼠或兔IgG），37 ℃ 1 小时左右或20℃时2 小时左右。
也可4℃过夜。
PBS（pH7.2-7.6）洗2 分钟×3 次。
（一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。
一般来说，阳性染色强度不够时，可提高一抗浓度和延长孵育时间；背景过高时，可降低一抗浓度和缩短孵育时间。
免疫组化实验步骤
免疫组化实验步骤免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2.水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7."2―7."4）：NaC137mmol/L，KCl2."7mmol/L ,Na2HPO44."3mmol/L, KH2PO41."4mmol/L.2．"0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6."0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0."4g。
3．0."5mol/L EDTA缓冲液（ph8."0）：700ml水中溶解186."1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph 8."0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8."0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH 8."0,加水1000ml。
5.酶消化液：a.0."1%胰蛋白酶:用0."1%CaCl 12(ph7."8)配制。
b.0."4%胃蛋白酶液：用0."1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a.甘油和0."5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9."0–9."5）等量混合b油和TBS(PBS)配制8．"TBS/PBS PH9."0–9."5,适用于荧光纤维镜标本;ph7."0-7."4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
细胞免疫组化(SABC法)
细胞免疫组化（SABC法）步步看：细胞冻存够了，且状态良好！咋们就开始做细胞免疫组化吧！开始做实验了，先看要准备些什么吧！实验准备：实验用品：移液枪：1ml、200ul、10ul枪头：1ml、200ul、10ul枪头盒：1ml、200ul、10ulEP管：1.5ml湿盒需要灭菌的东西：培养皿（可以是重复用的）、细胞爬片（多聚赖氨酸处理，并经过环氧乙烷消毒）、常规细胞培养物品。
试剂：细胞消化液、完全培养基、4%多聚赖氨酸、0.01M PBS（ph7.2-7.4）、3%H2O2（现配）、0.5%Txiton X-100、浓缩型SABC试剂盒（血清封闭液、二抗、三抗《SABC》）、苏木素、ddH2O、DAB显色试剂盒操作步骤：一、细胞爬片的制作1、细胞用消化液消化后，用完全培养基重悬（4-5ml）或者密度为1-5x106/ml2、在灭菌的培养皿中铺上3块细胞爬片（圆片），圆片间不要重叠3、取细胞悬液分别滴到圆片上，注意不要滴到圆片外，让细胞贴片30min左右4、30min后，在培养皿中补加完全培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来），放于37°C，5%CO2培养箱中培养3h左右（让其贴壁更牢）。
二、组化前处理1、取出培养皿，用PBS漂洗2x2min（PBS可以不灭菌）2、4%多聚甲醛处理（室温）20min；3、PBS漂洗，3x2min；4、0.5%Txiton X-100处理（室温）20min；5、PBS漂洗，3x2min；6、3%H2O2处理（室温）15min；7、PBS漂洗，3x2min；三、组化1、血清封闭：试剂盒中的血清封闭液，37°C，20min；2、取出甩干封闭液（不漂洗）；一抗（1：200）（PBS稀释），阴性对照用PBS代替一抗，37°C1-2h或4°C过夜；3、PBS漂洗，3x2min；4、二抗孵育：试剂盒中的生物素化...37°C，20min；5、PBS漂洗，3x2min；6、SABC孵育：湿盒内37°C，20min；7、PBS漂洗，3x4min；8、DAB显色：DAB试剂盒中的A、B、C三种试剂，我是按照500ul蒸馏水中各加4ul，混匀。
细胞培养常用试剂的配制
细胞培养常用试剂的配制日期：2012-04-13来源：未知作者：网友点击：239次相关专题∙细胞培养基的配制∙细胞培养专题∙万能缓冲液PBS器材与试剂干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等具体步骤1、水：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。
需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.2、PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗溶解定容：将药品(NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4%26middot;H2O 1.56g，KH2PO40. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
用HCl或NaOH调PH到7.4。
移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶(大的吊针瓶)内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。
注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
3、胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。
不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。
使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。
终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25%，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS(D-hanks)液中。
搅拌混匀，置于4℃内过夜。
用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。
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免疫细胞化学常用试剂
一、固定剂
大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。
某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。
因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）
试剂：多聚甲醛40g
0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml
配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠
试剂：A液：多聚甲醛40g
蒸馏水400ml
B液：Na2HPO4·2H2O16.88g
蒸馏水300ml
C液：NaOH 3.86g
蒸馏水200m
配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。
该固定剂较温和，适于组织的长期保存。
组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。
3．Bouin’s液及改良Bouin’s液
试剂：饱和苦味酸
40%甲醛250ml
冰醋酸50ml
配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。
冰醋酸最好在临用前加入。
改良Bouin’s液即不加冰醋酸。
该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。
但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。
此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。
4．Zamb oni’s(Stefanini’s)液
试剂：多聚甲醛20g
饱和苦味酸 150ml
Karasson-Schwlt’s PB至1000ml
配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。
该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。
我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。
固定时间为6～18h。
5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液
（Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）
试剂：过碘酸钠
赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸）：
多聚甲醛
蒸馏水
配制方法：
（1）贮存液A（0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，将pH调至7.4，补足0.1mol/L的PB至100ml，使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好两周内使用。
此溶液的渗透浓度为300mOs mmol/L/kg。
（2）贮存液B（8%多聚甲醛溶液）：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚甲醛液（方法见前）。
过滤后4℃冰箱保存。
（3）临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），使NaIO4终浓度为2%。
由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固定时不需再调pH值。
固定时间为6～18h。
该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。
由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。
Mclean和Nakane等认为，最佳的混合是：含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L的赖氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。
6．Karnovsky’s液（pH7.3）
试剂：多聚甲醛30g
25%戊二醛80ml
0.1mol/L PB 至1000ml
配制方法：先将多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加
0.1mol/L的PB至1000ml，混匀。
该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在4℃短时固定，比在较低浓度的戊二醛中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。
固定时最好先灌注固定，接着浸泡固定10～30min，用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。