免疫细胞化学常用试剂介绍.
免疫组化实验步骤
免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。
它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。
（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
免疫印迹常用试剂(除一抗外)
200µg/0.2ml 1000µg/1ml 浓缩液 亲和纯化抗体
产品应用
WB=1:200-500 Elisa =1:1000-2000 IP=1:20-100 IHC=1:200-500
2.酶标二抗
产品编号
bse-0295G
英文名称
Goat Anti-Rabbit IgG/HRP
中文名称
辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG
产品标准
1L（100ml浓缩液）
产品应用
蛋白印迹(Western Blot,WB)
13.WB洗涤液
产品编号
C-0043
英文名称
WesternBlotWashBuffer
中文名称
WB洗涤液
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
分子生物学试剂
产品价格
30ml/48元 70ml/78元
产品标准
10X浓缩液
免疫印迹常用试剂（除一抗外）
1.内参抗体
产品编号
bs-0061R
英文名称
β-Actin(内参抗体)
中文名称
β-肌动蛋白（抗体）（浓缩液）
生产产地
北京博奥森生物技术有限公司
产品类别
兔抗人、羊、狗、猪、牛、兔、鸡、猴和大、小鼠β-Actin多克隆抗体
产品价格
0.1ml/400元 0.2ml/650元 1ml/1860元
产品编号
C-0075
中文名称
KODAK胶片
生产产地
KODAK原装
产品类别
曝光胶片
产品价格
100张/盒/240元
产品标准
5X7英寸
产品应用
转膜曝光
17.硝酸纤维素膜
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫组化常用试剂
免疫组化常用试剂免疫细胞化学常用试剂介绍佚名一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。
某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。
因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛 40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛 40g蒸馏水 400mlB液：Na2HPO4·2H2O 16.88g蒸馏水 300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水 200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH 或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
免疫组化常用标记物
免疫组化常用标记物一、常用标志物1、ＣD15(LeuM1)---(阳性部位:细胞膜)。
就是一种由半乳糖、岩藻糖与N－乙酰葡萄糖组成得碳水化合物抗原,又称半抗原χ,就是粒／单核细胞相关抗原、免疫组织化学表达:成熟粒细胞、激活得淋巴细胞(主要就是T淋巴细胞)、R－S细胞、大多数腺癌等。
2、癌胚抗原(carcｉｎoeｍbrｙonic antigen,ＣEA)(CD６6e)——-(阳性部位:细胞膜／浆)、癌胚抗原就是表达于胎儿上皮细胞得一种糖蛋白,分子量为18０kＤａ。
存于某些恶性肿瘤组织尤其就是内胚层来源发肿瘤中,大多数胃肠道(包括胰腺)与肺腺癌均有表达,少量成人上皮细胞与良性肿瘤亦可表达、ＣＥA主要用于标记上皮性肿瘤,尤其就是腺上皮来源得腺癌。
3。
嗜铬素A(chｒomｏｇraｎiｎA,CgＡ)－－—(阳性部位:细胞浆)。
嗜铬素就是位于神经分泌颗粒内得酸性糖蛋白家族,就是一组可溶性酸性蛋白,分子量为７6～120 ｋDａ,分布广泛。
含量最丰富得就是嗜铬素A,另两个就是嗜铬素B与嗜铬素C。
几乎所有得神经内分泌肿瘤中均可检测到嗜铬素、嗜铬素A不仅存在于神经内分泌细胞得分泌颗粒中,也广泛分布于所有含有颗粒得内分泌细胞与神经内分泌细胞来源得肿瘤细胞、此抗体可以识别嗜铬素A 抗原羧基末端得片段,而不与氨基末端得片段反应,主要用于标记神经内分泌细胞及其来源得肿瘤、对小细胞癌进行抗原修复可提高检测得敏感性、4。
细胞角蛋白(cytokeratｉｎpan,广谱CK)－--AＥ1/AE3(阳性部位:细胞浆)。
此抗体可以识别绝大部分酸性细胞角蛋白(Ⅰ型/低分子量)与碱性细胞角蛋白(Ⅱ型/高分子量)、用于标记上皮及上皮来源得肿瘤,特别就是对鉴别与判断转移性肿瘤就是否为上皮源性具有一定得意义、５.细胞角蛋白5/6(cytokeratｉn 5／6,CK5/6)—－－(阳性部位:细胞浆)、在正常组织中,鳞状上皮与导管上皮得基底细胞以及部分得鳞状上皮生发层细胞、肌上皮细胞与间皮细胞阳性,腺上皮细胞阴性。
常用免疫组化试剂介绍
常用免疫组化试剂介绍概述免疫组化（IHC）是一门通过检测特定抗原在组织切片中的表达程度来揭示组织形态和细胞化学等方面信息的技术。
由于IHC是一种定性分析技术，所以该方法需要与定量技术（如分子生物学）结合使用，从而得到更准确的数据。
IHC涉及到多种试剂，其标记原理和表现形式各异，能够检测的抗原种类也不同。
本文将对常用的IHC试剂进行介绍，以此为指导，让大家更好地了解和应用IHC技术。
常用的免疫组化试剂抗原修复试剂抗原修复试剂（Antigen Retrieval）用于在组织样本中使细胞内蛋白与抗体亲和性和特异性增加。
这种试剂可通过热处理（如高压）或化学处理（如酶样蛋白和酸性处理）来复原被检测抗原的结构和功能。
常用的抗原修复试剂包括：EDTA、Tris、Citrate等。
原位杂交试剂原位杂交试剂（In Situ Hybridization）可检查DNA或RNA分子的特异性结合情况。
这种试剂可将RNA等分子与特定热稳定的蛋白质结合，用于检测基因突变等。
常用的原位杂交试剂包括：流式胶体金试剂、脉冲场凝胶电泳（PFGE）、双链RNA原位杂交等。
细胞计数试剂细胞计数试剂（Cell Counting）用于获得细胞数量或结构变化。
这种试剂通常用于确定某一类细胞的数量、细胞计数和分离、细胞生长和分裂的应用。
常用的细胞计数试剂包括：皮质醇、14C-labeled thymidine等。
细胞信号转导试剂细胞信号转导试剂（Cell Signaling）用于研究细胞分子级别的通讯系统，并采取措施以确定物质在细胞内的作用机理。
常用的细胞信号转导试剂包括：抗体、试剂原和阻断类似物等。
同型抑制剂同型抑制剂（Isotype Control）用于在IHC实验中作为实验设计的对照组，以检测所观察的抗原与探测剂结合的特异性表现。
常用的同型抑制剂包括：IgG1、IgG2a和IgG2b等。
情况控制试剂情况控制试剂（Condition Control）用于确定IHC试验的最佳条件，包括温度、缓冲液、酸碱程度等。
免疫细胞化学(coverslip)
免疫细胞化学（Coverslip）1.处理后的神经元，冰上吸去培养基，4℃PBS洗2次；（去掉培养基中的血清，排除血清引起的非特异，25K、5K模型可以省略此步。
）2.固定：用预冷的4％PFA(in PBS)，0.5ml/well，4℃放置固定40min，；（使蛋白质等凝固，保持细胞结构状态，维持细胞的抗原性。
）3.打孔：室温吸去PFA，用TBST（0.1％Triton X-100 in TBS）洗2次，5min/次；（Triton X-100是一种去垢剂，可以溶解细胞膜上的脂质，破坏细胞膜结构，促进抗体穿透细胞。
）以下操作可在Parafilm膜上进行（剪适当长度的Parafilm，展平，两端用透明胶粘贴固定在桌面上）：4.封闭：根据需要配好3％封闭血清(in TBST)，室温下吸取60ul/滴至膜上，从培养皿中夹取玻片覆盖在液滴上，有神经元一面朝下，注意赶去气泡且不要让玻片被液体浸没，封闭1h；（针对二抗宿主来源，主要封闭二抗非特异结合位点。
）5.孵一抗：用TBST洗一遍，操作同上，转移玻片至相应的一抗工作液(in 3%BSA in TBS)上，60ul/滴，阴性对照为一抗稀释液，室温孵育2h。
（取湿纸巾置于膜两旁，盖上盖子，以防止水分蒸发。
）6.用TBST洗2次， 10min/次；7.孵二抗；根据一抗种属来源选择合适的二抗(in 3%BSA in TBS)，60ul/滴，室温下避光孵育1h。
（注意抗体针对的种属，使用浓度：Alexa488、Alexa555为1：1000，Cy3、FITC为1：200。
）8.用TBST洗2次，5min/次。
（如抗体的非特异多也可多洗。
）9.Hoechst染色：把1000×Hoechst用PBS稀释，60ul/滴。
10.封片：10min后用TBST洗两次，5min/次，将玻片转移至滴有Mounting Medium的载玻片上。
（注意Mounting Medium的量要适中，保证玻片紧贴载玻片且无气泡。
常用免疫组化试剂(类别)介绍
常用免疫组化试剂（类别）介绍一、用于鉴别诊断（一）上皮源性：1、细胞角蛋白／cytokeratin.CK：目前，商品化的细胞角蛋白有20多种，不同的分子量代表不同类型的上皮标志。
通常将CK分为两大类型：Ⅰ型（低分子量）；Ⅱ型（高分子量）。
理论上讲，大多数单层上皮表达低分子量的CK；复层上皮多表达高分子量的CK；移形上皮（膀胱）和假复层上皮（呼吸道的被覆上皮）既表达低分子量的CK，也表达高分子量的CK。
在癌组织中，低分子量的CK多在腺癌中表达，高分子量的CK多在鳞癌中表达。
目前为止，未发现任何一种上皮只含有一种CK，某些上皮可含2－10种不同分子量的CK。
因此，目前试图应用单一的CK免疫表型来确定某种特定的上皮性肿瘤是不可能的。
同样，应用CK来区别腺癌、类癌和间皮瘤也是困难的。
因此，CK的免疫组化结果判断是一个较为复杂的问题，在应用这类标记物作为腺癌和鳞癌的鉴别应特别注意。
有必要时，应联合用多种CK加以综合判断。
CK的阳性表达还包括有间变癌、双向分化的滑膜肉瘤、脊索瘤、胚胎癌、间皮瘤、上皮样肉瘤、胸腺瘤等。
CK的阴性表达有：副节瘤单向分化的滑膜肉瘤、软骨（肉）瘤、精原细胞瘤、淋巴瘤、脑膜瘤、恶黑、恶纤组、软组织肉瘤（除特殊类型外）。
在判断CK免疫组化结果时应注意几点：（1）CK的单克隆抗体优于多克隆抗体；（2）CK常出现斑点状的假阳性反应，应注意识别；（3）虽然大多数CK多在胞浆表达，但CK17多在胞核表达；（4）绝大多数CK抗体需用胰酶消化，可增加阳性表达率和染色强度；（5）部分非上皮性肿瘤（平滑肌肉瘤）可见有CK表达，在诊断时应注意；（6）淋巴结、扁桃体和脾组织中的滤泡外的网织细胞含有CK8和18以及desmin，在判断淋巴结转移癌和肌源性肉瘤转移时应根据组织学综合判断。
2、上皮膜抗原（epithelialmembraneantigen／EMA）：EMA是上皮细胞分泌的一种乳脂小球膜糖蛋白，广泛存在于人体各种上皮细胞中（也存在于间皮细胞、浆细胞、组织细胞和T细胞淋巴瘤中），其分布与角蛋白相似，但对内脏腺上皮优于细胞角蛋白，尤其是分化差的癌EMA有时可呈强阳性表达。
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免疫细胞化学常用试剂介绍一、固定剂大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。
某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。
因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。
在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。
1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）试剂：多聚甲醛40g0.1mol/L磷酸缓冲液至1000ml配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。
该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究，最好是动物经灌注固定取材后，继续浸泡固定2～24h。
另外，该固定剂较为温和，适于组织标本的较长期保存。
2.4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠试剂：A液：多聚甲醛40g蒸馏水400mlB液：Na2HPO4·2H2O16.88g蒸馏水300mlC液：NaOH 3.86g蒸馏水200m配制方法：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制（方法同前），至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。
注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。
B液和C液配制好后，将B液倒入C液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合，4℃冰箱保存备用。
该固定剂适于光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛，使其终浓度为0.5%～1%。
该固定剂较温和，适于组织的长期保存。
组织标本于该固定液中，4℃冰箱保存数月仍可获得满意的染色效果。
3．Bouin’s液及改良Bouin’s液试剂：饱和苦味酸40%甲醛250ml冰醋酸50ml配制方法：先将饱苦味酸过滤，加入甲醛（有沉淀者禁用），最后加入冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。
冰醋酸最好在临用前加入。
改良Bouin’s液即不加冰醋酸。
该固定液为组织学、病理学常用固定剂这一，对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整。
但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害，且组织收缩较明显，故不适于组织标本的长期保存。
此外，操作时，应避免吸入或与皮肤接触。
4．Zamboni’s(Stefanini’s)液试剂：多聚甲醛20g饱和苦味酸150mlKarasson-Schwlt’s PB至1000ml配制方法：称取多聚甲醛20g，加入饱和苦味酸150ml，加热至60℃左右，持续搅拌使充分溶解、过滤、冷却后，加Karasson-Schwlt’s PB至1000ml充分混合（Karasson –Schwlt’s磷酸缓冲液的配制配制方法见后）。
该固定液适于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存较纯甲醛为优，也适于光镜免疫细胞化学研究，为实验室常用固定剂之一。
我们在应用中，常采用2.5%的多聚甲醛和30%的饱和苦味酸，以增加其对组织的穿透力和固定效果，保存更多的组织抗原。
固定时间为6～18h。
5．PLP液PLP液即过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液（Periodate-Lysine-paraform-alde－hyde fixative）试剂：过碘酸钠赖氨酸盐酸盐（或盐酸赖氨酸）：多聚甲醛蒸馏水配制方法：（1）贮存液A（0.1mol/L赖氨酸-0.5mol/l Na3PO4,pH7.4）：称取赖氨酸盐酸盐1.827g溶于50ml蒸馏水中，得0.2mol/L的赖氨酸盐酸盐溶液，然后加入Na2HPO4至0.1mol/L，将pH调至7.4，补足0.1mol/L的PB至100ml，使赖氨酸浓度也为0.1mol/L,4℃冰箱保存，最好两周内使用。
此溶液的渗透浓度为300mOs mmol/L/kg。
（2）贮存液B（8%多聚甲醛溶液）：称8g多聚甲醛加入100ml蒸馏水中，配成8%多聚甲醛液（方法见前）。
过滤后4℃冰箱保存。
（3）临用前，以3份A液与1份B液混合，再加入结晶过碘酸钠（NaIO4），使NaIO4终浓度为2%。
由于AB两液混合，pH从约7.5降至6.2，故固定时不需再调pH值。
固定时间为6～18h。
该固定剂较适于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。
其机制是借助于过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氨基与醛基结合，从而与糖形成交联。
由于组织抗原绝大多数都是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定剂有选择性地使糖类固定，这样既稳定了抗原，又不影响其在组织中的位置关系。
Mclean和Nakane等认为，最佳的混合是：含0.01mol/L的过碘酸盐、0.075mol/L 的赖氨酸、2%的多聚甲醛及0.037mol/L的磷酸缓冲液。
6．Karnovsky’s液（pH7.3）试剂：多聚甲醛30g25%戊二醛80ml0.1mol/L PB至1000ml配制方法：先将多聚甲醛溶于0.1mol/L PB中，再加入戊二醛，最后加0.1mol/L的PB至1000ml，混匀。
该固定剂适于电镜免疫细胞化学，用该固定液在4℃短时固定，比在较低浓度的戊二醛中长时间固定能更好地保存组织的抗原性和细微结构。
固定时最好先灌注固定，接着浸泡固定10～30min，用缓冲液漂洗后即可树酯包埋或经蔗糖溶液后用于恒冷切片。
7．0.4% 对苯醌（Parabenzoquinone）试剂：对苯醌 4.0g0．01mol/L PBS1000ml配制方法：称取4.0g对苯溶于1000ml 0.01mol/L的PBS即可。
对苯醌对抗原具有较好的保护作用，但对超微结构的保存有一定影响，故常与醛类固定剂混合使用。
一般要求临用前配制，且避免加热助溶，因加热或放置时间过长，固定液变为棕色至褐色，会使组织标本背景增加，影响观察。
此外，对苯醌有剧毒，使用时避免吸入或与皮肤接触。
8．PFG液（Parabenzoquinone-Formaldehyde-Glutaraldehyde fixative, PFG）试剂：对苯醌20g多聚甲醛15g25%戊二醛40ml0.1mol/L二甲酸钠缓冲液至1000ml配制方法：先以500ml左右的二甲酸钠缓冲液溶解对苯醌及多聚甲醛，然后加入戊二醛，最后加入二甲酸钠缓冲液至1000ml充分混合。
对苯醌与戊二醛及甲醛联合应用，即可阻止醛基对抗原的损害，又不影响超微结构的保存，故适于多种类抗原的免疫细胞化学，尤其是免疫电镜的研究。
9．碳二亚酰胺-戊二醛（ECD-G）液试剂：0.05mol/L PB500ml0.01mol/L PBS500mlTris约14g浓HCl少许ECD10g25%戊二醛 3.5ml配制方法：先以约500ml的PB与相同体积的PBS混合，加入Tris（使其终浓度为1.4%）溶解，以浓HCl调pH至7.0，再将事先称取好的ECD 和戊二醛加入混合液，振摇后计时，用pH计检测，约2～3min时，pH降至6.6，再以1N的NaOH在4min内调pH至7.0，此时，将该混合固定液加入盛有细胞（经PBS漂洗过）的器皿中，在23℃固定7min后，以PBS洗去固定液，即可进一步处理。
ECD即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminoprpyl)-carboi－imide hydrochloride]，简称乙基-CDI，常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质的固定也有良好效果。
ECD单独应用时，边缘固定效应重，但与戊二醛、Tris及PB联合应用，效果明显改善，细胞质仍可渗透，利用细胞中抗原的定位，超微结构保存较好。
目前认为是一种用于培养细胞电镜水平免疫细胞化学研究的很好的固定剂。
10．四氧化锇（锇酸Osmic Acid, OsO4）配制：将洗净装有OsO4的安瓿中加热后，迅速投入装有溶剂的棕色瓶中，使安瓿遇冷自破。
也可用钻石刀在安瓿上划痕，洗净后再放入瓶中，盖好瓶塞，用力撞击安瓿，待其破后加溶剂稀释。
为保证充分溶解，应在用前几天配制。
（1）2% OsO4水溶解：取OsO41g溶于重蒸水中。
此液常作为储备液，于冰箱中密封保存。
（2）1% OsO4-PB：试剂：A、2.26%NaH2PO4·2H2O 4.15mlB2.52%8.5mlC、5.4%葡萄糖5mlD、OsO40.5g配制方法：先分别配好A、B、C三种液体，取A液41.5ml与B液8.5ml混合，将pH调至7.3～7.4，取A－B混合液45ml再与5ml C液混合即为0.12mol/L PBG。
（3）1% OsO4/0.1mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）：试剂：2% OsO4水溶液10ml0.2mol/L二甲胂酸钠缓冲液（pH7.2～7.4）10ml配制方法：取2%OsO4储备液10ml与等量0.2mol/L、pH7.2～7.4的二甲胂酸钠缓冲液充分混合即可。
OsO4是电镜研究所必需的试剂，常用于后固定。
尽管OsO4主要为脂类固定剂，但也可与肽类及蛋白质起作用，形成肽-蛋白质或肽-脂交联。
过氧化物酶的反应产物经OsO4处理后，电子密度增高，适于电镜研究。
但由于OsO4的反应产物对光及电子有较明显的吸收能力，因此在免疫细胞化学染色前常需去除，去锇在光镜水平常用1%的高锰酸钾，在电镜水平则常用H2O2来处理。
以上介绍了目前免疫细胞化学中常用的一些固定液。
关于固定液种类还很多，如70%～90%的酒精、丙酮、醋酸酒精（含0.1%～1%醋酸的70%～90%的酒精等），这些溶液都能促使蛋白质凝固。
它们最初只是光学显微镜通用的固定液，但在免疫细胞化学上用其它方法不成功时，也可试用。
总之，掌握一个原则，免疫细胞化学中，含重金属的固定液禁用（但Zenker-Formalin可进行短时的固定）。
目前多数认为，对生物标本较好的固定措施是：用4℃的Karnovsky’s液灌注固定10～30min后，接着在pH7.3、0.1mol/L的二甲胂酸钠缓冲液中漂洗过液，这种短时冷固定处理，有助于超微结构和许多肽类抗原的保存。
对其它较难保存的抗原可尝试PFG、PLP及Zamboni’s液等混合固定液。
二、缓冲液免疫细胞化学中应用的缓冲液种类较多，即使是同种缓冲液，其浓度、pH、离子强度等也常常不同。