线粒体提取
线粒体提取
缓冲液A（100 mM Tricine-KOH (pH 7.4), 300 mM sucrose, 10 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM potassium-EDTA, 0.1% BSA, 5 mM DTT and protease inhibitors: 1 mM PMSF, 10
g/ml pepstatin A）。
缓冲液B（pH 7.4, 无DTT ，余下同分离缓冲液A）。
1、将拟南芥叶片10g,置于研钵中，剪碎。
2、加25ml分离缓冲液A，冰上充分研磨。
3、匀浆液经4层纱布过滤。
滤液取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（1）。
4、于2,600g 离心15 min（Beckman J2-HS），弃沉淀。
上清取20ul用于细胞色素c活性
测定，记为（2）。
5、上清液进一步在12,000g 离心15 min，此时得到线粒体粗提样。
6、弃上清，将沉淀轻柔地悬浮于2 ml分离缓冲液B中。
从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（3）。
7、铺制蔗糖密度梯度于38ml超离管中，介质由上到下依次包括6 ml / 0.6 M sucrose, 6 ml / 0.9 M sucrose, 8 ml/ 1.2 M sucrose, 8 ml /1.45 M sucrose 和8 ml/ 1.8 M sucrose。
介质均用缓冲液B配制。
8、然后将2 ml悬浮液铺于蔗糖密度梯度介质上。
9、然后以24000rpm离心90 min（SW28 Beckman rotor）。
10、超离结束后，收集1.45M/1.2M层组分于50ml离心管中，缓冲液B稀释5倍。
11、12000g离心15min，沉淀即为纯化的线粒体。
13、将沉淀重悬于500ul缓冲液B中，从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为（4）。
14、纯化的线粒体液氮速冻，存于-80℃。
线粒体DNA提取
mtDNA提取流程(1)将待测组织充分切碎(碎片大小:脾脏组织≤10 mg、其他组织≤25 mg),取样品25 mg移入微型离心管。
(2)加入180 μL Buffer ATL、20 μL Proteinase K、缓慢充分混匀,置于56 ℃恒温水浴直到完全溶解(水浴期间间隔摇晃混合)。
在开始下一步前摇晃混合15 s。
(3)加入200μL Buffer AL,充分混合(血液样品需56℃恒温水浴10 min)。
(4)加入200 μL 无水乙醇,混合均匀。
(5)将混合溶液移至2mL收集管中的滤管里,6000 xg条件离心1 min,取出滤管,扔掉收集管。
(6)将滤管放入新的收集管中,加入500 μL Buffer AW1, 6000 xg条件离心1 min,取出滤管,扔掉收集管。
(7)将滤管放入新的收集管中,加入500 μL Buffer AW2, 20000 xg条件离心3 min,取出滤管,扔掉收集管。
(8)将滤管放入新的微型离心管(1.5-2 mL)。
(9)向滤管中心滴加200 μL(100 μL)Buffer AE洗涤DNA,室温放置1 min。
6000 xg条件离心1 min。
(10)重复一边上述步骤,增大DNA产率(重复一遍即可)。
理论25mg原料大概能提取10-20μg DNA.注:摇晃混合和拿起时一定要轻慢,防止DNA断裂。
琼脂糖电泳步骤1. 准备电泳槽:将有机玻璃的电泳凝胶床洗净晾干,插上样品梳。
2. 琼脂糖凝胶的制备:称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中(1%的琼脂糖含量),置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化(不要加热至沸腾),取出摇匀。
3. 灌胶:将冷却60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上(厚度不超过0.5cm)。
待琼脂糖胶凝固后,在电泳槽内加入电泳缓冲液,然后拔出梳子。
5. 加样:将DNA样品与加样缓冲液按5:1混匀后(取10μL DNA样液与2μL 电泳载样缓或5μL DNA样液与1μL 电泳载样缓冲液混匀,用移液枪将混合液加到样品槽中,每槽加10-20μL,记录样品的点样次序和加样量。
线粒体的提取与纯化
mt DNA的分离及纯化按戴建华等报道的方法，就具体情况稍加改进，步骤如下（除特别说明，均在4℃下完成）：1.1 取新鲜肝组织，放在缓冲液A（0.25M 蔗糖，0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）中漂洗2~3次，尽可能去除表面血污、结缔组织及脂肪组织后剪碎。
按组织重﹕缓冲液A=1﹕5~10加入缓冲液A，用玻璃匀浆器冰浴匀浆。
1.2 1000 g•min-1离心15min；取上清液；15000 g•min-1离心20min，弃上清，沉淀用缓冲液B （0.25M 蔗糖，0.05M Tris·Hcl，0.007M Mg Cl2，p H7.5）洗涤，按0.5m L•g-1肝的比例加入缓冲液B 悬浮沉淀后加入DNase I 至终浓度为100 µg•m L-1，30℃下作用30min。
1.3 冰浴冷却，加入2倍体积的DNase I反应终止液（0.25M蔗糖，0.1M Na2-EDTA，pH8.0）。
15000g•min-1离心20min。
沉淀用DNaseI反应终止液洗涤一次，重复离心。
1.4 按0.5 m L•g-1肝加入缓冲液C（0.1M Nacl，0.05M Tris·Hcl，0.01M Na2-EDTA，p H8.5）悬浮沉淀，加入SDS至终浓度为1%~1.5%，吸打混匀后37℃保温15min。
1.5 用等体积的苯酚，苯酚/氯仿（1:1），氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次。
取水相，加0.2 倍体积1M Na Ac和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀后放在4℃冰箱中过夜。
1.6 15000g•min-1离心30min后去上清；沉淀用70%乙醇洗涤2次，干燥，TE（0.01M Tris·Hcl，0.001M Na2-EDTA，pH8.0）溶解。
1.7 加入预处理的RNase I 至终浓度为50µg•m L-1，37℃保温1h。
线粒体DNA提取SOP
线粒体DNA提取SOP
一、蛋白酶K法
1、使用液氮将50mg新鲜组织样本研磨至粉末状；
2、转入1.5mL离心管中加入溶液A（4℃）1mL，冰浴中吹打分散后沉降大块沉淀；
3、4℃，1000r/min离心1min，分离颗粒细胞核和细胞碎片；
4、回收上清至新的1.5mL离心管，12000r/min离心10min；
5、弃上清，尽量去除干净；
6、加50uL蛋白酶K，55℃水浴2.5h，期间每隔15min轻轻混匀；
7、加水至500uL；
8、加入等体积的酚、氯仿、异丙醇抽提，轻柔上下翻转离心管15min；
9、1000r/min离心10min；
10、水相转移至新管并加入各500uL的氯仿和异丙醇，轻柔上下翻转离心管15min；
11、1000r/min离心10min；
12、水相转移至新管，加入2倍体积的冰乙醇沉淀，静置10min；
13、12000r/min离心2min，沉淀即为mtDNA；
14、70%乙醇清洗线粒体DNA，置于空气中自然干燥后加入适量TE液溶解，于4℃保存。
线粒体DNA提取
mtDNA提取流程（1）将待测组织充分切碎（碎片大小：脾脏组织≤10 mg、其他组织≤25 mg），取样品25 mg移入微型离心管。
（2）加入180 μL Buffer ATL、20 μL Proteinase K、缓慢充分混匀，置于56 ℃恒温水浴直到完全溶解（水浴期间间隔摇晃混合）。
在开始下一步前摇晃混合15 s。
（3）加入200μL Buffer AL，充分混合（血液样品需56℃恒温水浴10 min）。
（4）加入200 μL 无水乙醇，混合均匀。
（5）将混合溶液移至2mL收集管中的滤管里，6000 xg条件离心1 min，取出滤管，扔掉收集管。
（6）将滤管放入新的收集管中，加入500 μL Buffer AW1, 6000 xg条件离心1 min，取出滤管，扔掉收集管。
（7）将滤管放入新的收集管中，加入500 μL Buffer AW2, 20000 xg条件离心3 min，取出滤管，扔掉收集管。
（8）将滤管放入新的微型离心管（1.5-2 mL）。
（9）向滤管中心滴加200 μL（100 μL）Buffer AE洗涤DNA，室温放置1 min。
6000 xg条件离心1 min。
（10）重复一边上述步骤，增大DNA产率（重复一遍即可）。
理论25mg原料大概能提取10-20μg DNA.注：摇晃混合和拿起时一定要轻慢，防止DNA断裂。
琼脂糖电泳步骤1. 准备电泳槽：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净晾干，插上样品梳。
2. 琼脂糖凝胶的制备：称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中（1%的琼脂糖含量），置微波炉或沸水浴中加热至完全溶化（不要加热至沸腾），取出摇匀。
3. 灌胶：将冷却60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上（厚度不超过0.5cm）。
待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内加入电泳缓冲液，然后拔出梳子。
5. 加样：将DNA样品与加样缓冲液按5：1混匀后（取10µL DNA样液与2µL 电泳载样缓或5µL DNA样液与1µL 电泳载样缓冲液混匀，用移液枪将混合液加到样品槽中，每槽加10-20μL，记录样品的点样次序和加样量。
线粒体DNA的提取方法
A buffer: 10 mmol/L Tris-HCL ， pH 7.4 ； 500 mmol/L ； 20 mmol/LEDTA；0.2%BSA；0.2%β-mercaptoethanol B buffer: 10 mmol/L Tris-HCL ，pH 7.4；600 mmol/L sucrose; 20 mmol/L EDTA
实验原理
1、4000rpm 离心可以沉淀分离出叶绿体、 细胞核和组织碎片，12, 000 rpm离心才可 沉淀分离线粒体。 2、用蔗糖浓度梯度纯化线粒体，不同浓度 蔗糖的缓冲液因比重不同而分层。
3、SDS可以从植物各样组织类型中释放和 结合的细胞核酸。
仪器设备： Apparatus:
研钵和研杵；冷冻离心机；过滤装置（漏 斗，玻棒） pH 计；移液器；水浴箱； 50mL 离心管；2；1.5 mL离心管。 mortar (cold); Centrifuged; filter; pH meter; water bath boiler; 50mL centrifugal tube; eppendorf tube .
2.线粒体在37℃下裂解4 h后(或60℃下裂解40min)，往裂解液中加 入等体积的酚-氯仿异戊醇，轻轻混匀，静置5 m in。在12 000rpm 4℃下离心 10 min。吸出上清，再用酚 - 氯仿 / 异戊醇抽提，吸取上 清，加入?RNase,在37℃下保温30m in后,加入酚-氯仿/异戊醇抽提， 吸出上清，再用氯仿 /异戊醇抽提。吸出上清 ,加入1/10 体积的乙 酸钠和两倍体积的异丙醇，置- 20 ℃ 2 h 或过夜。 2. The material were lysed in 2% SDS, constantly shaking the mixture. If the tissue coalesces, warm the tubes in a 60℃water bath for 40 min (or in a 37℃water bath for 4h) until the organelles are fully lysed. Shake the mixture intensively for 10min with an equal volume of equilibrated phenol. Centrifuge for 10min at 12,000 rpm. Remove the upper aqueous phase. The RNase treatment was done at 37℃ for 30minutes. Then add phenol∶chloroform∶isoamyl alcohol （ 25∶24∶1 ） . Repeat the procedure. Add chloroform∶isoamyl alcohol （24∶1）. Repeat the procedure. Precipitate the DNA with 1/10 vol of 3M NaAC and 2 vol of isopropanol at -20℃ for 2-3h or overnight.
线粒体提取
线粒体提取缓冲液A(100 mM Tricine-KOH (pH 7.4), 300 mM sucrose, 10 mM KCl, 1 mM MgCl, 1 2mM potassium-EDTA, 0.1% BSA, 5 mM DTT and protease inhibitors: 1 mM PMSF, 10,g/ml pepstatin A)。
缓冲液B(pH 7.4, 无DTT ，余下同分离缓冲液A)。
1、将拟南芥叶片10g,置于研钵中，剪碎。
2、加25ml分离缓冲液A，冰上充分研磨。
3、匀浆液经4层纱布过滤。
滤液取20ul用于细胞色素c活性测定，记为(1)。
4、于2,600g 离心15 min(Beckman J2-HS)，弃沉淀。
上清取20ul用于细胞色素c活性测定，记为(2)。
5、上清液进一步在12,000g 离心15 min，此时得到线粒体粗提样。
6、弃上清，将沉淀轻柔地悬浮于2 ml分离缓冲液B中。
从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为(3)。
7、铺制蔗糖密度梯度于38ml超离管中，介质由上到下依次包括6 ml / 0.6 M sucrose, 6 ml/ 0.9 M sucrose, 8 ml/ 1.2 M sucrose, 8 ml /1.45 M sucrose 和 8 ml/ 1.8 M sucrose。
介质均用缓冲液B配制。
8、然后将2 ml悬浮液铺于蔗糖密度梯度介质上。
9、然后以24000rpm离心90 min(SW Beckman rotor)。
2810、超离结束后，收集1.45M/1.2M层组分于50ml离心管中，缓冲液B稀释5倍。
11、12000g离心15min，沉淀即为纯化的线粒体。
13、将沉淀重悬于500ul缓冲液B中，从中取20ul用于细胞色素c活性测定，记为(4)。
14、纯化的线粒体液氮速冻，存于-80?。
几种不同提取线粒体的方法对线粒体含量及活性的影响
【 KEY W O RD S】 m itochondria; m itochondrial extraction; m itochondrial ac tivity
基础研究
几种不同提取线粒 体的方法对线粒体含量及活性的影响
吴 媛 1, 2 董凌月 1 , 2 安 威 1, 23 安云庆 3 3
( 1. 首都医科大学基础医学院细胞生物学系 ; 学系 )
【 摘要 】 目的 比 较几种不同的提取线粒体的方法对线粒 体蛋白 浓度及 活性的 影响 。方法 采用 蔗糖密 度梯度 离心法 、 普利 莱试剂盒提取方法和 Pierce线粒 体提取试剂盒方法分别提取线粒体 ,测定提 取得到的线 粒体蛋 白浓度 、 污染 情况和活 性 。结果 同样数量的细胞采用普利莱法提取得到的线粒体蛋白 浓度 高于 其他 2 种方法所提取的线粒体蛋白浓度 ( P < 0. 05 ) ; 采用 W este rn
2010 年 4 月 第 31 卷 第 2 期
首 都 医 科 大 学 学 报 Journa l of Capita lM edical U niversity
Apr . 2010 Vo l . 31 No. 2
[ do i: 10. 3969/ j. issn. 1006 2 7795. 2010. 02. 020]
2应用蔗糖密度梯度离心法以下简称为蔗糖法传代培养的细胞pbs洗3次消化细胞并收集沉淀用hepesph22moll甘露醇70mmoll蔗糖edta1无脂肪酸的bsa匀浆之后800g离心10min将上清以11000g离心15min将得到的沉淀用i2pa缓冲液25mgl蛋白酶抑制剂和pmsf洗涤并重悬放于冰上15min1000010min收集上清即为线粒体蛋白3应用pierce公司线粒体提取试剂盒提取线粒以下简称为pierce法将传代培养的细胞化细胞并收集沉淀加入800试剂a中速涡旋min加入10l试剂b以最大速度涡旋冰中min再以最大速度涡旋min后加入800l试剂10min取上清000g离心15min再将沉淀加入500l试剂12000g离心min管内沉淀即为线粒体
动物线粒体DNA提取的原理和方法
动物线粒体D NA 提取的原理和方法*X夏玉玲 刘彦群 鲁 成X X (西南农业大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点实验室 重庆 400716)摘 要 从动物线粒体的特征、线粒体的鉴定方法、提取线粒体D NA 各步骤等原理出发,比较了目前常用的几种提取线粒体D N A 的方法,提出动物线粒体D N A 提取的几点关键步骤,并提出一套优化的操作流程。
关键词 线粒体 线粒体D N A 提取方法线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。
它是细胞进行氧化磷酸化的场所。
线粒体基因组不仅是研究D N A 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。
线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。
由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索[1]。
动物线粒体D NA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[2]。
进行动物线粒体D NA 方面意义重大,现将线粒体D N A 的提取的原理和方法介绍如下:1 提取动物线粒体D N A 的原理1.1 线粒体的特征线粒体是由内外两层膜组成,外膜光滑,内膜向内回旋折叠,形成许多横隔。
线粒体中含有多种氧化酶,在此进行TCA 循环、呼吸连电子传递和氧化磷酸化等产能作用,并传递和储存所产生的能量,是细胞的动力工厂和生物氧化的主要场所。
线粒体的形状、大小、数目和组成,在不同生物、不同组织以及生活于不同条件下的细胞中变化很大。
线粒体的外型呈多样化,绝大多数类型细胞呈圆形、卵原形,也有呈杆状的。
其体积大小不等,一般直径比较一致,为0.5~1.0L m,长度为1~5L m,最长可达到7L m 。
线粒体的数目与生物种类、组织、细胞类型和细胞生理功能变化有关。
锥虫和有的真菌只有一个线粒体,大多数动物的肝脏细胞含有上千个线粒体,生殖细胞如卵母细胞可达到30万个线粒体,家蚕的每个后部丝腺细胞只有2~4个线粒体[13],而有的细胞根本没有线粒体;在细胞生命活动旺盛时,它的数量多,在衰老时,数量少,有时可能消失;新生细胞比衰老细胞或病变细胞的线粒体多。
线粒体提取方法
线粒体提取试剂盒产品组成：产品组成 BB-3601-1 BB-3601-2规格 50T 100T线粒体提取液A 20ml 40ml线粒体提取液B 20ml 40ml线粒体保存液 20ml 40ml产品简介：本试剂盒可用于各种动物细胞和实体软、硬组织样本的线粒体提取。
不能用于冷冻样品的线粒体提取。
细胞线粒体提取：1.取1-2×107个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞；2.用冷PBS洗涤两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3.加入400μl冷的试剂A，置冰上10分钟。
4.用Dounce匀浆器匀浆30-40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。
5.快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。
6.在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
7.在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。
8.在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
9.弃上清，沉淀用线粒体保存液重悬。
10.即得到线粒体样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。
组织线粒体提取：a)取50-100mg新鲜动物组织样本，用PBS洗涤干净。
b)用剪刀尽可能剪碎，用冷PBS洗涤两次。
c)加入400μl冷的试剂A，置冰上10分钟。
d)用Dounce匀浆器匀浆30-40下，然后在4℃，500×g条件下离心5分钟。
e)快速将上清吸入另一预冷的干净离心管。
f)在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
g)在沉淀中加入400μl冷的试剂B，混匀。
h)在4℃，11000×g以上条件下离心20分钟。
i)弃上清，沉淀用线粒体保存液重悬。
j)即得到线粒体样品，置冰箱备用或直接用于下游实验。
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实验五 线粒体的分离与观察
离心技术概述
离心技术是根据颗粒在作匀速圆周运动时都会受 到一个向外的力这一原理而发展起来的一种分离 技术。
离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运动受到 一个向外的力。与角速度和旋转半径有关。
相对离心力又称相对离心加速度，是指离心力相 当于重力加速度的倍数，表示“数字×g”。
离心力g＝1.11×10-5n2r
r为离心机中轴到离心管远端
的距离
n为离心机每分钟的转速（
r/min）
1000g=9.8牛（N）
离心技术类型
离心技术可用于细胞器的分离。 离心技术一般包括：差速离心和密度梯度离心
（一）差速离心
（differential centrifugation）
在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离 不同大小的细胞和细胞器。
实验五 线粒体的分离与观察
一、实验目的
1.对分离得到的线粒体进行活性鉴定。 2.掌握用差速离心技术分离制备线粒 体的方法。
二、实验原理
细胞器是细胞中维持细胞复杂生命活动的功能 性器官，为了研究各种细胞器的功能，首先就 要将这些细胞器从细胞中分离出来。利用各种 物理方法（研磨、超声波振荡、低渗等将组织 制成匀浆，细胞中的个中亚组分即从细胞中释 放出来。
(1)匀浆(Homogenization)低温条件下， 将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质( 即0.25mol／L蔗糖)进行破碎细胞使之成 为各种细胞器及其包含物的匀浆。
(2)分级分离(Fractionation)由低速到高速离 心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀， 再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉 淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、 线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和 密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整 个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉 淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮 和离心加以纯化.