2010年版药典一部生物安全性检查和生物活性测定法介绍(张德波)
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2010版药典微生物限度检查法及指导原则培训
无
增加贴膏剂供试液制备 增加贴膏剂供试液制备 贴膏剂供试液 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层， 取规定量供试品，去掉贴剂的保护层，放置 在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。 在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。用适 宜的无菌多孔材料（如无菌纱布） 宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆盖贴剂 的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。 的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。然后将其 置于适宜体积并含有灭活剂（如山梨酯80 80或 置于适宜体积并含有灭活剂（如山梨酯80或 卵磷脂）的稀释剂中，用力振摇至少30 30分钟 卵磷脂）的稀释剂中，用力振摇至少30分钟 或以其它方法制备成供试液。 ，或以其它方法制备成供试液。
细菌、 4、细菌、霉菌及酵母菌计数
---计数培养基的适用性检查 ---计数培养基的适用性检查
CP2005 无 CP2010 结果判断 被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值大 70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致， 于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致，判该培养 基的适用性检查符合规定。 基的适用性检查符合规定。
CP2010
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂 斜面培养基中，培养5 加入3 斜面培养基中，培养5～7天，加入3～ 0.05％（v/v）聚山梨酯80 ％（v/v 80的 5ml 含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9% 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后， 无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用 适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内 至无菌试管内， 适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用 0.05％（v/v）聚山梨酯80 0.9%无菌 ％（v/v 80的 含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌 氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～ 制成每1ml含孢子数50 氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100 cfu的孢子悬液。 cfu的孢子悬液。 的孢子悬液 菌悬液在室温下放置应在2小时内使用， 菌悬液在室温下放置应在2小时内使用， 若保存在2 8℃可以在24小时内使用 可以在24小时内使用。 若保存在2～8℃可以在24小时内使用。 黑曲霉孢子悬液可保存在2 8℃， 黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证 过的贮存期内使用。 过的贮存期内使用。
修订中国药典2010年版附录
（一部）新增、修订的附录名单 一部共62项，新增14项
❖ 离子色谱法 ❖ 二氧化硫残留量测定法 ❖ 黄曲霉毒素测定法 ❖ 电感耦合等离子体原子发射
光谱法 ❖ 渗透压摩尔浓度测定法 ❖ 异常毒性检查法 ❖ 降压物质检查法 ❖ 过敏反应检查法
❖ 溶血与凝聚检查法
❖ 中药生物活性测定指导原则
❖ 抑菌剂效率检查法指导原则
急需、前瞻、先进、成熟
❖ 2、指导原则的增订，理由和意义要充分，应对药 品质量标准和质量控制有实际指导意义。
❖ 3、修订内容应紧密围绕药品标准以及药品监督管 理工作，修订必须有充分的理由和科学依据， 不轻易修改。
三、拟增修订项目
❖ 1、一部共16项，其中新增6项：
❖电泳测定法 ❖渗透压摩尔浓度测定法 ❖等离子体发射光谱法 ❖大孔树脂有机残留物测定法 ❖聚合酶链式反应法 ❖中药特征图谱指导原则
（二部）新增、修订与删除的附录名单 二部共87项，新增16项，删除1项
❖ 药用辅料 ❖ 离子色谱法 ❖ 2-乙基己酸测定法 ❖ 蛋白质含量测定法 ❖ 合成多肽中的醋酸测定法 ❖ 制药用水电导率测定法 ❖ 核磁共振波谱法 ❖ 锥入度测定法 ❖ 溶血与凝聚检查法
❖ 拉曼光谱法指导原则
❖ 化学药品注射剂安全性检查 法指导原则
《中国药典》2010年版附录
通用检测方法和指导原则 主要增修订内容 郭毅新
一、主要报告内容
❖ 1、附录增修订原则 ❖ 2、增修订项目 ❖ 3、主要增订项目内容 ❖ 4、主要修订项目内容 ❖ 5、评价与展望
二、附录增修订原则
❖ 1、新增通用检测方法应是目前药品检验检测急需 的、能解决目前存在突出问题的，并能引导药 品检验检测水平不断增高，能充分反映现阶段 国内和国际药品质量控制先进技术的成熟可靠 的方法。
2010版无菌、微生物限度检查法课件
检视我国历版药典无菌检查法发展历史
1953版 实验环境仅要求为半无菌操作箱；仅收载一种直接接种法； 用一种培养基检查
1963版
1977版
仅一种直接接种法；用三种培养基分别培养细菌和霉菌
开始收载薄膜过滤法（简单装置），用二种培基分别培 养细菌和霉菌
1985版
收载薄膜过滤法限于抗生素样品；用需、厌气菌培养基及 霉菌培养基；要求实验环境为紫外线灭菌的无菌室。
（八） 表1、表2和表3部分
表1
将表1第3列的表题原
“每种培养基最少检验 数量” 修订为：“接种每种培养基所需的 最少检验数量” ——更明确指出接种到培养基中去的检验量。
修订了表1下的
注: 对供试品容器装量不够 接种两种培养基的情况，明确规定最少检验 数量应加倍。
表2
将表2原名称：“上市抽验样品（液体制剂）
⑶新增贴剂供试液制备
取规定量供试品，去掉贴剂的保护层， 放置在无菌玻璃或塑料片上，粘贴面朝上。 用适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布）覆 盖贴剂的粘贴面以避免贴剂粘贴在一起。 然后将其置于适宜体积并含有灭活剂（如 聚山梨酯80或卵磷脂）的稀释剂中，用力 振荡至少30分钟，或以其他方法制备成供 试液。
⑷具抑菌活性的供试品增修订内容
的最少检验数量” 修订为：“ 液体制剂最少 检验量及上市抽验样品的最少检验数量” ——明确液体制剂最少检验量见表2的第2列， 供试品最少检验数量见表2的第3列。
· 修订了表2下的 注: ——对供试品容器装量 不够接种两种培养基的情况，明确规定最少 检验数量应加倍。
表3
·将表3原名称：“上市抽验样品（固体制剂） 的最少检验量” 修订为：“ 固体制剂最少检 验量及上市抽验样品的最少检验数量” ——明确固体制剂最少检验量见表3第2列；供 试品最少检验数量见表3的第3列。
2010年版药典一部生物安全性检查和生物活性测定法介绍(张德波)
• 温育: 37±0.5 ℃, 3小时。 • 结果判断 • 几个问题 • 试验剂量问题， 试验剂量问题，结果判断问题 乳状液型注射液实验观察问题
附录Ⅹ 附录ⅩⅢD 细菌内毒素检查法
• 细菌内毒素（Endotoxin） 细菌内毒素（ ） 革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，具有多种生物活性， 其化学结构是脂多糖（LPS）。 • 生物活性 致热性 、与鲎试剂反应 • 特点 广泛存在、非常稳定、具有疏水性和亲水性的两性分子 致热活性的高度不均一性 • 细菌内毒素标准品 参考标准品（国际 国家标准品） 国家工作 标准品 • 企业工作品
附录Ⅹ 附录ⅩⅢD 细菌内毒素检查法
鲎试剂 鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成 规格: 规格 0.1ml; 0.5ml. 灵敏度（λ） 灵敏度 对鲎试剂灵敏度的正确理解。 • 鲎试剂的灵敏度复核 细菌内毒素工作标准液的配制：2λ、λ、1/2λ、1/4λ 鲎试剂的复溶：按标示规格复溶，不得稀释或浓配。 加样操作 结果判断
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
降压物质检查标准起草 • 本身为降压药物不用设置降压物质检查标准。 • 剂量设定：指导原则定得太宽，操作性很强。
无降压作用的药品： 临床单次用量的1/5~5倍； 有一定降压作用的药品：最大无降压反应的1/4~ 1/2。 供试品临床原液注射1ml/kg无降压反应，可以此作剂量。
• 例2：某样品规格1g 细菌内毒素 取本品，依法检查，每1mg中含内毒素量应小于0.1EU • 介绍一种简便的操作方法
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
静脉用注射剂 热原、异常毒性、溶血与凝聚、过敏反应、降压物质 （非降压药）。 可考查建立细菌内毒素检查法。 肌肉用注射剂 异常毒性、过敏反应。
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
02 2010年版《中国药典》微生物检查法
乳糖发酵培养基 曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂 沙门菌 营养肉汤 四硫磺酸钠亮绿培养基
促生长能力+指示能力 促生长能力+指示能力 促生长能力 促生长能力 抑制能力
胆盐硫乳琼脂或沙门、志贺氏属琼脂
促生长能力+指示能力
曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂
铜绿假单胞菌 胆盐乳糖培养基
促生长能力+指示能力
促生长能力 抑制能力
21
抑制能力 21 促生长能力+指示能力
三、白色念珠菌的检查
取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml、10cm2）直接或处理后接种至适量（不少 于100ml）的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养24～48 小时。取上述培养物划 线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养24～48小时（必要时延长至72 小时）。 白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光 滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。 若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检 出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑 选2～3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养24～48小时（必要 时延长至72小时）。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出 白色念珠菌。 若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温80玉 米琼脂培养基上，培养24～48小时。取培养物进行染色，镜检及芽管试验。 芽管试验 挑取1%吐温80玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载 玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35～37℃、1～3h，置显微镜下观 察，可见到由孢子长出短小芽管。 若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品 未检出白色念珠菌。
2010年版药典微生物限度检查法
附录Ⅺ J 微生物限度检查法微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。
检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。
微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。
除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。
检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。
检验量检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g用于阳性对照试验)。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。
一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。
供试液的制备根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。
1.液体供试品取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10的供试液。
油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
2.固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10的供试液。
中国药典2010版药品微生物检查
替代方法的验证也分为定性和定量两类，不同类型需
要验证的参数不同，验证参数的设定借鉴了美国和欧洲 药典的规定，但又结合了我国国情。具体参数的设定见 下表。
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26
参数 准确度 精密度 专属性 检测限 定量限 线性 范围 重现性 耐用性
定性检验 － － ＋ ＋ － － － ＋ ＋
定量检验 ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
真菌
与初始值比，到7、14、28天菌数均不增加。
2 类供 试 品
细菌
14天菌数下降不少于2.0 lg ， 14天到28天菌数 不增加。
真菌
与初始值比，到14、28天菌数均不增加。
3类供试品
细菌
14天菌数下降不少于1.0 lg ， 14天到28天菌数均不增加。
真菌
与初始值比，14、28天菌数均不增加。
目前欧洲、美国、英国等国药典均已在附录中收载了抑菌剂效力 测定，我国2010版药典增订抑菌剂效力检查法指导原则，目的在于缩 短与欧美国家的距离，评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导 生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂的确定。
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11
所有抑菌剂都具有一定的毒性，而且在贮存过程中其 有效性有可能因药物的活性成分提高或降低，为保证药品 的质量和用药安全，添加抑菌剂的量应根据制剂本身是否 具抗菌活性，保持最低有效量。
1980年版《药品卫生检验方法》中收载了破伤风梭菌检查法，并 对用于深部组织、创伤、溃疡及阴道用药开始检查破伤风梭菌。至此形成了我 国药品微生物限度检查法及限度标准的基本框架。
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5
中国药典1990年版第二增补本收栽20个化学药品种的微生物 限度标准。中国药典1995年版收载了微生物限度检查法，对少数剂 型收载了微生物限度。按剂型制订微生物限度标准，是根据我国国情 决定的。从发展看，以品种来制定标准较为合理。
要验证的参数不同，验证参数的设定借鉴了美国和欧洲 药典的规定，但又结合了我国国情。具体参数的设定见 下表。
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参数 准确度 精密度 专属性 检测限 定量限 线性 范围 重现性 耐用性
定性检验 － － ＋ ＋ － － － ＋ ＋
定量检验 ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
真菌
与初始值比，到7、14、28天菌数均不增加。
2 类供 试 品
细菌
14天菌数下降不少于2.0 lg ， 14天到28天菌数 不增加。
真菌
与初始值比，到14、28天菌数均不增加。
3类供试品
细菌
14天菌数下降不少于1.0 lg ， 14天到28天菌数均不增加。
真菌
与初始值比，14、28天菌数均不增加。
目前欧洲、美国、英国等国药典均已在附录中收载了抑菌剂效力 测定，我国2010版药典增订抑菌剂效力检查法指导原则，目的在于缩 短与欧美国家的距离，评价最终产品的抑菌效力，同时也可用于指导 生产企业在研发阶段制剂中抑菌剂的确定。
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所有抑菌剂都具有一定的毒性，而且在贮存过程中其 有效性有可能因药物的活性成分提高或降低，为保证药品 的质量和用药安全，添加抑菌剂的量应根据制剂本身是否 具抗菌活性，保持最低有效量。
1980年版《药品卫生检验方法》中收载了破伤风梭菌检查法，并 对用于深部组织、创伤、溃疡及阴道用药开始检查破伤风梭菌。至此形成了我 国药品微生物限度检查法及限度标准的基本框架。
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中国药典1990年版第二增补本收栽20个化学药品种的微生物 限度标准。中国药典1995年版收载了微生物限度检查法，对少数剂 型收载了微生物限度。按剂型制订微生物限度标准，是根据我国国情 决定的。从发展看，以品种来制定标准较为合理。
中国药典2010年版一部
一枝黄花YizhihuanghuaSOLIDAGINIS HERBA本品为菊科植物一枝黄花Solidago decurrens Lour.的干燥全草。
秋季花果期采挖，除去泥沙，晒干。
【性状】本品长30～lOOcm。
根茎短粗，簇生淡黄色细根。
茎圆柱形，直径0.2～0.5cm；表面黄绿色、灰棕色或暗紫红色，有棱线，上部被毛；质脆，易折断，断面纤维性，有髓。
单叶互生，多皱缩、破碎，完整叶片展平后呈卵形或披针形，长1～9cm，宽0.3～1.5cm；先端稍尖或钝，全缘或有不规则的疏锯齿，基部下延成柄。
头状花序直径约0.7cm，排成总状，偶有黄色舌状花残留，多皱缩扭曲，苞片3层，卵状披针形。
瘦果细小，冠毛黄白色。
气微香，味微苦辛。
【鉴别】 (1)叶表面观：上表皮细胞多角形，垂周壁略呈念珠状增厚。
下表皮细胞垂周壁波状弯曲，气孔不定式，略下陷。
非腺毛有两类：表皮非腺毛由3个细胞组成，壁薄，顶端1个细胞常萎缩成鼠尾状，较小；叶缘非腺毛睫毛状由3～7个细胞组成，壁稍厚，长180～500μm。
(2)取本品粉末2g，加石油醚（60～90℃）50ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，弃去石油醚液，药渣挥干溶剂，加70%乙醇30ml，加热回流1小时，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
另取一枝黄花对照药材2 g，同法制成对照药材溶液。
再取芦丁对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法（附录ⅥB)试验，吸取供试品溶液5～10μl、对照药材溶液和对照品溶液各5μl，分别点于同一以含4%磷酸氢二钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸-水（8：1：1：1）为展示剂，展开，取出，晾干，喷以3%三氯化铝乙醇溶液，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
；再喷以5%三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
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[用法与用量]静脉滴注：一日20～40ml，以10%葡萄糖注射液200ml
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
溶血与凝聚标准起草 • 实验方法问题：取样量、供试液。 • 结果判断问题：振摇引起的争议。 • 个人提出的修改方法 建议以此作为内控标准。 • • • • 供试液配制 试验剂量 结果观察 结果判断
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
细菌内毒素检查标准起草
举例：某中药注射液
• 试验前准备工作 试验前准备工作:实验兔、相关器具除热原、供试品 • 正式实验
家兔正常体温测定:体温38.0 ～ 39.6℃,且两次相差≤0.2℃。 供试品液准备:注射前配制，温热至约38 ℃。 分组：三只家兔温度最好相近，组内温差不得过1 ℃ 注射给药：15分钟内注射完毕，注意止血。 测定给药后的体温
120EU（1支）—— 1.0ml（ 120EU/ml) 120EU/ml—— —— —— 0.25EU/ml（4λ）—— 0.125EU/ml（2λ）
供试品阳性对照液 内毒素液
0.5ml
0.25EU/ml ——————————————0.125EU/ml（2λ，20倍稀释液） 上样品10倍稀释液 0.5ml
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
降压物质检查标准起草 • 本身为降压药物不用设置降压物质检查标准。 • 剂量设定：指导原则定得太宽，操作性很强。
无降压作用的药品： 临床单次用量的1/5~5倍； 有一定降压作用的药品：最大无降压反应的1/4~ 1/2。 供试品临床原液注射1ml/kg无降压反应，可以此作剂量。
• 温育: 37±0.5 ℃, 3小时。 • 结果判断 • 几个问题 • 试验剂量问题， 试验剂量问题，结果判断问题 乳状液型注射液实验观察问题
附录Ⅹ 附录ⅩⅢD 细菌内毒素检查法
• 细菌内毒素（Endotoxin） 细菌内毒素（ ） 革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，具有多种生物活性， 其化学结构是脂多糖（LPS）。 • 生物活性 致热性 、与鲎试剂反应 • 特点 广泛存在、非常稳定、具有疏水性和亲水性的两性分子 致热活性的高度不均一性 • 细菌内毒素标准品 参考标准品（国际 国家标准品） 国家工作 标准品 • 企业工作品
• • • • •
ⅩⅢ A 热原检查法 ⅩⅢ D细菌内毒素检查法 ⅩⅢ E异常毒性检查法* ⅩⅢ G过敏试验检查法* ⅩⅢ H 溶血与凝聚试验*
• 附录ⅩⅧ B 中药注射剂安全性检查法指导原则 附录ⅩⅧ • 附录ⅩⅧ C 中药生物活性测定指导原则 附录ⅩⅧ
凡例--动物试验 凡例--动物试验 -2005年版一部 • 动物品系、年龄、性别应 符合规定。 • 尽量取代动物试验，减少 动物使用量。 2010年版一部 • 动物应健康。 • 动物品系、年龄、性别、 体重应符合规定。
• • • • • • • • • • 初试合格 3只均≤0.6 ℃,且总和≤1.4℃ 需复试 3只中有一只≥ 0.6 ℃,或均不超 过0.6 ℃，但总和≥1.4℃ 初试不合格 3只中≥ 0.6 ℃的超过一只。 复试合格 5只中≥ 0.6 ℃不超过一只，或8 只总和≤3.5 ℃ 复试不合格 5只中≥ 0.6 ℃超过一只，或8只 总和＞ 3.5 ℃ • • • • • • • • • •
附录Ⅹ 附录ⅩⅢD 细菌内毒素检查法
鲎试剂 鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成 规格: 规格 0.1ml; 0.5ml. 灵敏度（λ） 灵敏度 对鲎试剂灵敏度的正确理解。 • 鲎试剂的灵敏度复核 细菌内毒素工作标准液的配制：2λ、λ、1/2λ、1/4λ 鲎试剂的复溶：按标示规格复溶，不得稀释或浓配。 加样操作 结果判断
• 计算体温变化 计算体温变化（升温为负值时以0计，注意数值修约）
• 数值修约：四舍六入五成双 12.1498≈12.1; 12.150001 ≈12.2; 12.15 ≈12.2; 12.16 ≈12.2 12.45 ≈12.4
• 得出结论
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
结果判断（2005版） ）
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
家兔预选 • 未曾使用过的家兔。 • 供试品合格，但升温≥ 0.6℃，休息达2周以上。 • 3周内未曾使用的家兔。 • • •
预选条件应与正式实验一致。 休温应在38.0 ～ 39.6℃。 每一只8次测温最高与最低温差应不大于0.4℃
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
凡例--动物试验 凡例--动物试验 -实验动物的要求 应是取得实验动物生产资质的单位生产,动物应有合格证。 动物应品系、年龄明确。 动物性别、体重应符合试验需要。 应有严格检疫制度。 使用前应正常饲养至适应使用环境。 应有动物处理制度。
• • • • • •
成方制剂和单味制剂
• 止喘灵注射液 异常毒性 • 注射用双黄连（冻干） 溶血与凝聚、热原 • 清开灵注射液 异常毒性、热原、溶血与凝聚 • 注射用灯盏花素* 热原、过敏试验、降压物质、异常 毒性、溶血与凝聚
建议：按临床用量来设定，考虑毒性问题。 供试液浓度确定：溶血、刺激性。 给药体积确定： 标准文字表述：
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
过敏反应标准起草 • 豚鼠毒性试验 • 剂量设定：在考虑毒性的基础上，剂量应尽可能大， 同时考虑临床用量。
致敏次数及激发时间：应当作研究，而不是完全按试验 方法规定次数与时间来操作。
结果判断（2010版）
初试合格 3只均≤0.6 ℃,且总和≤1.3℃ 需复试 3只中有一只≥ 0.6 ℃,或总和 ≥1.3℃ 初试不合格 3只中≥ 0.6 ℃的超过一只 复试合格 5只中≥ 0.6 ℃不超过一只，或8 只总和≤3.5 ℃ 复试不合格 5只中≥ 0.6 ℃超过一只，或8只 总和＞ 3.5 ℃
• 例2：某样品规格1g 细菌内毒素 取本品，依法检查，每1mg中含内毒素量应小于0.1EU • 介绍一种简便的操作方法
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
静脉用注射剂 热原、异常毒性、溶血与凝聚、过敏反应、降压物质 （非降压药）。 可考查建立细菌内毒素检查法。
肌肉用注射剂 异常毒性、过敏反应。
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
家兔的重复使用 • 供试品合格的家兔 至少休息48小时。 • 升温≥ 0.6 ℃的家兔，至少休息2周以上，且通过预选合格。 • 供试品不合格的家兔淘汰 • 建议：关于升温的家兔 建议：
关于降温的家兔
附录Ⅹ 附录ⅩⅢE 异常毒性检查法
异常毒性检查 • 初试动物要求：17~20g，5只。 • 复试动物要求：18~19g，10只。 • 给药时间：各论下有规定者按各论项下规定时间， 否则按每只4～5秒。 4 5 • 结果观察：给药后观察48小时。 • 结果判断：以动物是否死亡作为判定指标。
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
2005年版药典 • • • • 供试用家兔 • 体重 1.7～3.0kg,雌者应无孕。 • 饲养：预测前7日的规定。 • 淘汰： 饲养不正常者 • 供试品判为不合格者 使用超过10次者 • 2010年版药典 供试用家兔 体重 1.7kg以上,雌者应无孕。 饲养：预测前7日的规定。 淘汰：饲养不正常者 供试品判为不合格者 不同点：体重无上限 • 使用次数不再规定10次 • 建议： 建议：
附录ⅩⅢG过敏试验检查法 附录ⅩⅢG过敏试验检查法 过敏物质检查法
• • • • • 动物要求: 动物要求 250 ～350g，雌者应无孕，6只。 致敏： 致敏：腹腔注射给药0.5ml/只，间日一次，连续3次。 激发： 激发：首次致敏注射后的第14日和第21日，静脉注射1ml/只。 结果观察： 结果观察：激发后观察30分钟。建议观察60分钟。 结果判断： 结果判断：如有一只动物出现竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏3声、紫 癜和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现二便失禁、步态不稳 或倒地、抽搐、休克，死亡现象之一者，判定供试品不符合规定。
• 保证实验可靠的几点建议： 保证实验可靠的几点建议： 设置空白、适当增加动物数、激发前的观察、饲养问题 对该试验的几点思考：实验剂量、实验动物数、观察指标。 对该试验的几点思考
附录Ⅹ 附录ⅩⅢH 溶血与凝聚检查法
• 2%兔红细胞混悬液配制 • 操作法
试管编号 2%兔红细胞混悬液ml 0.9%氯化钠溶液ml 蒸馏水ml 供试品溶液ml 0.3 0.3 0.3 1样品 样品 2.5 2.2 2样品 样品 2.5 2.2 4.7 3颜色 颜色 4阴性 阴性 2.5 2.5 2.5 5阳性 阳性 2.5
2010年版药典一部 2010年版药典一部
生物安全性检查和生物活性测定法介绍
张德波
成都市食品药品检测心(成都市药检所 成都市食品药品检测心(成都市药检所)
2010年版药典一部安全性检查内容介绍 2010年版药典一部安全性检查内容介绍
• 凡例 动物试验(四十五) • 成方制剂和单味制剂 四个品种 • 附录ⅩⅢ 附录Ⅹ
附录Ⅹ 附录ⅩⅢF 降压物质检查法
降压物质检查法
对照品贮备液的配制： ①磷酸组胺折算成组胺的系数0.342。 ②规定配制成1.0mg/ml，但最好采用定容方法。 ③4～8 ℃保存3个月内使用。将有沉淀析出改为经验证活性符合要求， 验证方法：猫注射0.1μg/kg，血压下降均值应不小于2.67kpa。 对照品稀释液的配制： 配制浓度应根据供试品给药剂量（体积）来确定。 实验前的准备工作：对照品、猫、仪器、试验通路联接、手术器具、麻 醉剂、供试品 猫的麻醉及手术注意事项 猫灵敏度测定： 0.05μg/kg、 0.1μg/kg、 0.15μg/kg 供试品降压物质检查：ds dT dT ds 异常情况的处理: 异常情况的处理:动物呼吸困难、动物有苏醒迹象、血压突然下降
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
• 热原 热原（Pyrogen ） ：系指某些药品中含有的能引起体温升高的杂质。 • 来源：临床上能够引起发热的物质如细菌内毒素、病毒、细菌，以及 来源： 其他一些微生物、类固醇等。 • 存在 存在：无所不在，水、灰尘、生产药品的器皿中都存在热原质。 • 性质 性质：细菌内毒素是细菌细胞壁的一种化学成份，主要为脂多糖，致 热性极强，具有耐热、耐酸碱、耐氧化剂，不易破坏，同时具有水溶 性、不挥发性、滤过性，在药品生产过程中不易去除。 • 不良反应 不良反应：引起人体发冷、寒颤，然后引起发热，甚至昏迷和休克。
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
溶血与凝聚标准起草 • 实验方法问题：取样量、供试液。 • 结果判断问题：振摇引起的争议。 • 个人提出的修改方法 建议以此作为内控标准。 • • • • 供试液配制 试验剂量 结果观察 结果判断
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
细菌内毒素检查标准起草
举例：某中药注射液
• 试验前准备工作 试验前准备工作:实验兔、相关器具除热原、供试品 • 正式实验
家兔正常体温测定:体温38.0 ～ 39.6℃,且两次相差≤0.2℃。 供试品液准备:注射前配制，温热至约38 ℃。 分组：三只家兔温度最好相近，组内温差不得过1 ℃ 注射给药：15分钟内注射完毕，注意止血。 测定给药后的体温
120EU（1支）—— 1.0ml（ 120EU/ml) 120EU/ml—— —— —— 0.25EU/ml（4λ）—— 0.125EU/ml（2λ）
供试品阳性对照液 内毒素液
0.5ml
0.25EU/ml ——————————————0.125EU/ml（2λ，20倍稀释液） 上样品10倍稀释液 0.5ml
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
降压物质检查标准起草 • 本身为降压药物不用设置降压物质检查标准。 • 剂量设定：指导原则定得太宽，操作性很强。
无降压作用的药品： 临床单次用量的1/5~5倍； 有一定降压作用的药品：最大无降压反应的1/4~ 1/2。 供试品临床原液注射1ml/kg无降压反应，可以此作剂量。
• 温育: 37±0.5 ℃, 3小时。 • 结果判断 • 几个问题 • 试验剂量问题， 试验剂量问题，结果判断问题 乳状液型注射液实验观察问题
附录Ⅹ 附录ⅩⅢD 细菌内毒素检查法
• 细菌内毒素（Endotoxin） 细菌内毒素（ ） 革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，具有多种生物活性， 其化学结构是脂多糖（LPS）。 • 生物活性 致热性 、与鲎试剂反应 • 特点 广泛存在、非常稳定、具有疏水性和亲水性的两性分子 致热活性的高度不均一性 • 细菌内毒素标准品 参考标准品（国际 国家标准品） 国家工作 标准品 • 企业工作品
• • • • •
ⅩⅢ A 热原检查法 ⅩⅢ D细菌内毒素检查法 ⅩⅢ E异常毒性检查法* ⅩⅢ G过敏试验检查法* ⅩⅢ H 溶血与凝聚试验*
• 附录ⅩⅧ B 中药注射剂安全性检查法指导原则 附录ⅩⅧ • 附录ⅩⅧ C 中药生物活性测定指导原则 附录ⅩⅧ
凡例--动物试验 凡例--动物试验 -2005年版一部 • 动物品系、年龄、性别应 符合规定。 • 尽量取代动物试验，减少 动物使用量。 2010年版一部 • 动物应健康。 • 动物品系、年龄、性别、 体重应符合规定。
• • • • • • • • • • 初试合格 3只均≤0.6 ℃,且总和≤1.4℃ 需复试 3只中有一只≥ 0.6 ℃,或均不超 过0.6 ℃，但总和≥1.4℃ 初试不合格 3只中≥ 0.6 ℃的超过一只。 复试合格 5只中≥ 0.6 ℃不超过一只，或8 只总和≤3.5 ℃ 复试不合格 5只中≥ 0.6 ℃超过一只，或8只 总和＞ 3.5 ℃ • • • • • • • • • •
附录Ⅹ 附录ⅩⅢD 细菌内毒素检查法
鲎试剂 鲎血液变形细胞裂解物冷冻干燥制备而成 规格: 规格 0.1ml; 0.5ml. 灵敏度（λ） 灵敏度 对鲎试剂灵敏度的正确理解。 • 鲎试剂的灵敏度复核 细菌内毒素工作标准液的配制：2λ、λ、1/2λ、1/4λ 鲎试剂的复溶：按标示规格复溶，不得稀释或浓配。 加样操作 结果判断
• 计算体温变化 计算体温变化（升温为负值时以0计，注意数值修约）
• 数值修约：四舍六入五成双 12.1498≈12.1; 12.150001 ≈12.2; 12.15 ≈12.2; 12.16 ≈12.2 12.45 ≈12.4
• 得出结论
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
结果判断（2005版） ）
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
家兔预选 • 未曾使用过的家兔。 • 供试品合格，但升温≥ 0.6℃，休息达2周以上。 • 3周内未曾使用的家兔。 • • •
预选条件应与正式实验一致。 休温应在38.0 ～ 39.6℃。 每一只8次测温最高与最低温差应不大于0.4℃
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
凡例--动物试验 凡例--动物试验 -实验动物的要求 应是取得实验动物生产资质的单位生产,动物应有合格证。 动物应品系、年龄明确。 动物性别、体重应符合试验需要。 应有严格检疫制度。 使用前应正常饲养至适应使用环境。 应有动物处理制度。
• • • • • •
成方制剂和单味制剂
• 止喘灵注射液 异常毒性 • 注射用双黄连（冻干） 溶血与凝聚、热原 • 清开灵注射液 异常毒性、热原、溶血与凝聚 • 注射用灯盏花素* 热原、过敏试验、降压物质、异常 毒性、溶血与凝聚
建议：按临床用量来设定，考虑毒性问题。 供试液浓度确定：溶血、刺激性。 给药体积确定： 标准文字表述：
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
过敏反应标准起草 • 豚鼠毒性试验 • 剂量设定：在考虑毒性的基础上，剂量应尽可能大， 同时考虑临床用量。
致敏次数及激发时间：应当作研究，而不是完全按试验 方法规定次数与时间来操作。
结果判断（2010版）
初试合格 3只均≤0.6 ℃,且总和≤1.3℃ 需复试 3只中有一只≥ 0.6 ℃,或总和 ≥1.3℃ 初试不合格 3只中≥ 0.6 ℃的超过一只 复试合格 5只中≥ 0.6 ℃不超过一只，或8 只总和≤3.5 ℃ 复试不合格 5只中≥ 0.6 ℃超过一只，或8只 总和＞ 3.5 ℃
• 例2：某样品规格1g 细菌内毒素 取本品，依法检查，每1mg中含内毒素量应小于0.1EU • 介绍一种简便的操作方法
中药注射剂安全性检查指导原则及标准起草
静脉用注射剂 热原、异常毒性、溶血与凝聚、过敏反应、降压物质 （非降压药）。 可考查建立细菌内毒素检查法。
肌肉用注射剂 异常毒性、过敏反应。
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
家兔的重复使用 • 供试品合格的家兔 至少休息48小时。 • 升温≥ 0.6 ℃的家兔，至少休息2周以上，且通过预选合格。 • 供试品不合格的家兔淘汰 • 建议：关于升温的家兔 建议：
关于降温的家兔
附录Ⅹ 附录ⅩⅢE 异常毒性检查法
异常毒性检查 • 初试动物要求：17~20g，5只。 • 复试动物要求：18~19g，10只。 • 给药时间：各论下有规定者按各论项下规定时间， 否则按每只4～5秒。 4 5 • 结果观察：给药后观察48小时。 • 结果判断：以动物是否死亡作为判定指标。
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
2005年版药典 • • • • 供试用家兔 • 体重 1.7～3.0kg,雌者应无孕。 • 饲养：预测前7日的规定。 • 淘汰： 饲养不正常者 • 供试品判为不合格者 使用超过10次者 • 2010年版药典 供试用家兔 体重 1.7kg以上,雌者应无孕。 饲养：预测前7日的规定。 淘汰：饲养不正常者 供试品判为不合格者 不同点：体重无上限 • 使用次数不再规定10次 • 建议： 建议：
附录ⅩⅢG过敏试验检查法 附录ⅩⅢG过敏试验检查法 过敏物质检查法
• • • • • 动物要求: 动物要求 250 ～350g，雌者应无孕，6只。 致敏： 致敏：腹腔注射给药0.5ml/只，间日一次，连续3次。 激发： 激发：首次致敏注射后的第14日和第21日，静脉注射1ml/只。 结果观察： 结果观察：激发后观察30分钟。建议观察60分钟。 结果判断： 结果判断：如有一只动物出现竖毛、发抖、干呕、连续喷嚏3声、紫 癜和呼吸困难等现象中的2种或2种以上，或出现二便失禁、步态不稳 或倒地、抽搐、休克，死亡现象之一者，判定供试品不符合规定。
• 保证实验可靠的几点建议： 保证实验可靠的几点建议： 设置空白、适当增加动物数、激发前的观察、饲养问题 对该试验的几点思考：实验剂量、实验动物数、观察指标。 对该试验的几点思考
附录Ⅹ 附录ⅩⅢH 溶血与凝聚检查法
• 2%兔红细胞混悬液配制 • 操作法
试管编号 2%兔红细胞混悬液ml 0.9%氯化钠溶液ml 蒸馏水ml 供试品溶液ml 0.3 0.3 0.3 1样品 样品 2.5 2.2 2样品 样品 2.5 2.2 4.7 3颜色 颜色 4阴性 阴性 2.5 2.5 2.5 5阳性 阳性 2.5
2010年版药典一部 2010年版药典一部
生物安全性检查和生物活性测定法介绍
张德波
成都市食品药品检测心(成都市药检所 成都市食品药品检测心(成都市药检所)
2010年版药典一部安全性检查内容介绍 2010年版药典一部安全性检查内容介绍
• 凡例 动物试验(四十五) • 成方制剂和单味制剂 四个品种 • 附录ⅩⅢ 附录Ⅹ
附录Ⅹ 附录ⅩⅢF 降压物质检查法
降压物质检查法
对照品贮备液的配制： ①磷酸组胺折算成组胺的系数0.342。 ②规定配制成1.0mg/ml，但最好采用定容方法。 ③4～8 ℃保存3个月内使用。将有沉淀析出改为经验证活性符合要求， 验证方法：猫注射0.1μg/kg，血压下降均值应不小于2.67kpa。 对照品稀释液的配制： 配制浓度应根据供试品给药剂量（体积）来确定。 实验前的准备工作：对照品、猫、仪器、试验通路联接、手术器具、麻 醉剂、供试品 猫的麻醉及手术注意事项 猫灵敏度测定： 0.05μg/kg、 0.1μg/kg、 0.15μg/kg 供试品降压物质检查：ds dT dT ds 异常情况的处理: 异常情况的处理:动物呼吸困难、动物有苏醒迹象、血压突然下降
附录Ⅹ 附录ⅩⅢ A 热原检查法
• 热原 热原（Pyrogen ） ：系指某些药品中含有的能引起体温升高的杂质。 • 来源：临床上能够引起发热的物质如细菌内毒素、病毒、细菌，以及 来源： 其他一些微生物、类固醇等。 • 存在 存在：无所不在，水、灰尘、生产药品的器皿中都存在热原质。 • 性质 性质：细菌内毒素是细菌细胞壁的一种化学成份，主要为脂多糖，致 热性极强，具有耐热、耐酸碱、耐氧化剂，不易破坏，同时具有水溶 性、不挥发性、滤过性，在药品生产过程中不易去除。 • 不良反应 不良反应：引起人体发冷、寒颤，然后引起发热，甚至昏迷和休克。