2015版《中国药典》微生物检验实施指导培训班
2015版中国药典微生物检验
• 注：方法选择原则：根据供试品理化特性和微生物限度 标准等因素选择。
培养基适用性检查
• 胰酪大豆胨琼脂：金黄色葡萄球菌、 枯草芽孢杆菌、铜 绿假单胞菌、白色 念珠菌、黑曲霉 • 胰酪大豆胨肉汤：金黄色葡萄球菌、 铜绿假单胞菌、枯草 芽孢杆菌 • 沙氏葡萄糖琼脂、玫瑰红钠琼脂 、白色念珠菌、黑曲霉。
中国药典2015年版相关培养基变化无菌检查法通则1101chp2010chp2015硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基tsb营养肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基tsa营养琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基sdb改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基sda培养基的适用性检查灵敏度检查无菌性检查中国药典2015年版相关培养基变化无菌检查法通则1101chp2010chp2015硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基改良马丁培养基胰酪大豆胨液体培养基tsb营养肉汤培养基胰酪大豆胨琼脂培养基tsa营养琼脂培养基沙氏葡萄糖液体培养基sdb改良马丁琼脂培养基沙氏葡萄糖琼脂培养基sda培养基的适用性检查灵敏度检查无菌性检查非无菌产品微生物限度检查
菌数报告规则
• 2、薄膜过滤法：计数方法同平皿计数法，每 张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。菌数报告 规则以相当于 1g、1ml或10cm供试品的菌落数 报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以﹤1报告 菌数（每张滤膜过滤1g、1ml或10cm 供试品 ），或﹤1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。 • 3、MPN法：记录每一稀释级微生物生长的管 数，从表3查对每1g或1ml供试品中需氧菌总数 的最可能数。
培养条件
• 描述方式：按计数方法适用性试验确认计 数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和 酵母菌总数测定。 • 培养条件：胰酪大豆胨琼脂平板在30～ 35℃培养3-5天，沙氏葡萄糖琼脂平板在20 ～25℃培养5~7天；MPN法和供试品接种， 所有试验管在30～35℃培养3～5天。
2015版中国药典微生物限度解析
（MPN法） 1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用
性试验：菌种及菌液制备、培养基适用性检查 、计数方法适用性试验。 1.4 供试品检查：检验量、供试品检查 1.5 结果判断 1.6 稀释液、冲洗液及培养基
1.1 总则：
• 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温 细菌和真菌的计数。
• 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否 符合规定的微生物限度标准时，应按规定进行检 验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有 规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
30～35 ℃ 不超过3天
20～25 ℃ 不超过5天
每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量50~100cfu ； 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。 结果判定：
若被检培养基上的菌落平均数不小于对照培养基上的菌落 平均数的70 %，且菌落形态大小与对照培养基上的菌 落一致，判该培养基的适用性检查符合规定。
1.3 计数培养基适用性检查和供试品计 数方法适用性试验
• 供试品微生物计数中所使用的培养基应进 行适用性检查。
• 供试品的微生物计数方法应进行方法适用 性试验【10版：方法验证】， 以确认所 采用的方法适合于该产品的微生物计数。
• 若检验程序或产品发生变化可能影响检验 结果时， 计数方法应重新进行适用性试 验。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
《中国药典》2015年版三部凡例培训
LOGO
半成品配制后直接分装至终容器时，如采用不同分装机进行分装，应按
分装机划分不同批或亚批； 半成品配制后经同一台分装机分装至终容器，采用不同冻干机进行冻干， 应按冻干机划分不同亚批。 非同日或同次配制、混合、稀释、过滤、灌装的半成品不得作为一批。 同一制品的批号不得重复；同一制品不同规格不应采用同一批号。
6
7 8
冻干要求
分装பைடு நூலகம்冻干 标识和记录
抽样、检定
生物制品包装规程
• 标签的要求
药品的标签是指药品包装上印有或者贴有 的内容，分为内标签和外标签。药品内标 签指直接接触药品的包装的标签，外标签 指内标签以外的其他包装的标签。
1、应符合国家法规要求； 2、文字表述应以药品监管理部门批准的为依据，不得超出说明书内容， 不得加入无关的文字和图案； 3、内包装标签和外包装标签的内容、格式应符合法规要求。
批：指在同一生产周期中，用同一批原料、同一方法生产所得的一定数量、均 一的一批制品。
凡例内容（一）
总则
正文（各论）
精确度
凡例
通则
基本要求
名称及编排
凡例内容（二）
生物制品术语与名称解释
检定方法与限度
常用英文名称 缩写与注释
凡例
计量
包装、标签、使用说明、 贮藏、运输
标准品、参考品、对照品
精确度
称重或量取的量，其精确度可根据数值的有效数 位来确定，如：
试验用水：
除另有规定外，系指纯化水；酸碱度检查用的水，均系指新煮沸并 放冷至室温的水。
试验时的温度：
未注明者，系指在室温下进行；如温度高低对试验结果有显著影响者， 除另有规定外，应以25±2℃为准。 酸碱性试验，如未指明用何种指示剂，均系指石蕊试纸。
微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)
霉菌与酵母菌总数、控制菌得检查。
二、引用标准：《中国药典》２015年版（通则1１05-1106）三、目录1。
微生物限度标准2.设备、仪器及用具3。
消毒液、稀释剂、试液及培养基4。
检查总则(通则1105：非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法,通则1106非无菌产品微生物限度检查:控制菌检查法）5。
微生物计数法检查6.控制菌检查法7．实验技术8、附件１.微生物限度标准非无菌药用原料及辅料得微生物限度标准(2)．目测霉变者以不合格论。
（３）。
“无”为标准依据或无相应规定。
准依据或无相应规定.2.设施、仪器及用具2、１、设施：2、１、1．微生物限度检查室及相关设施：微生物计数试验环境应符合微生物限度检查得要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染得措施不得影响供试品中微生物得检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
２、1、2．其她设备:高压蒸汽灭菌器;细菌培养箱(3０~3５℃);霉菌培养箱(２5～2８℃)；电炉(或其她适宜得加热装置）；恒温水浴；电热干燥箱(250~３00℃)；电冰箱。
生化试剂储存箱。
2、2仪器及器皿2、2、1。
菌落计数器；显微镜（15０0X）;电子天平或药物天平（感量0、1ｇ）;ｐH 系列比色计。
2、2、2．玻璃器皿：锥形瓶(2５０~３００ml,内装玻璃珠若干)、研钵（玻璃或陶瓷制,∮10～12ｃm)、培养皿（∮9 ｃm）、量筒(１00ml）、试管（1８×180ｍm）及塞、吸管（1ml分度0、01，10ml分度0、１)、载玻片、盖玻片、玻璃消毒缸（带盖）。
2、2、3新购得玻璃器皿得清洁:先用流水冲洗，浸泡于1％~２%盐酸（工业用）液中约2～6小时，除去游离碱质，再用流水冲洗.用于化学分析得玻璃仪器,需用重铬酸钾清洁液浸泡数分钟后，再用流水冲洗，最后以纯化水涮洗2～3次，晾干备用。
2、3用过得玻璃器皿：2、3、1未被病原微生物污染得器皿：可随时洗涤.用清水冲洗(或浸泡)，除容量仪器外，可用毛刷与肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净,晾干备用.容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流水冲洗,最后以纯化水涮洗2～3次.试管及培养皿:先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内,经1２1℃灭菌30 分钟.趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗,最后以流水涮净。
微生物限度检查操作规程(中国药典2015版四部通则)
菌总数、控制菌的检查。
二、引用标准：《中国药典》2015年版(通则1105-1106)非(2)．目测霉变者以不合格论。
单）、分度小时，除再用刷和肥皂粉，内外刷洗，再用清水涮洗干净，晾干备用。
容量仪器宜用清洁液浸泡或涮洗，再用流试管及培养皿：先正放或直立于高压蒸汽灭菌器内，经121℃灭菌30 分钟。
趁热倾出培养物，再以清水或用毛刷及肥皂粉刷洗，最后以流水涮净。
吸管：全部直立浸没于清洁液的长筒形容器中，筒底应衬有棉或橡皮垫，以防管尖损坏。
24小时后，逐支用流水反复冲洗洁净，晾干后包扎灭菌备用。
载、盖玻片：应分别浸泡于清洁液12~24小时后，取出用流水冲洗，再放入3%~5%肥皂水或5%碳酸钠液内煮沸10~15 分钟，待自然冷却后，再用流水冲洗。
沥干后置95%乙醇中浸泡，晾干备用。
2，3，3玻璃器皿用前应洗涤干净，无残留抗菌物质。
吸管口上端距0.5 cm处塞入约2cm的适宜疏松棉花，置吸管桶内或牛皮纸袋中。
锥形瓶、量筒、试管均应加棉塞或硅胶塞，若用振荡器制备混悬液时，尚需用玻璃纸包裹瓶塞（以免振荡时供试液污染瓶塞），再用牛皮纸包扎。
玻璃器皿，均于160℃干热灭菌2小时或高压蒸汽121℃灭菌30 分钟，烘干备用。
2.4用具2.4.1大、小橡皮乳头（放于干净带盖的容器中，并应定期用70%~75%乙醇溶液浸泡）。
2.4.2无菌衣、帽、口罩、手套（洗净后配套，用牛皮纸包严）灭菌，备用。
也可用一次性无菌衣、帽、口罩、手套。
2.4.3接种环（白铱金或镍铬合金，环径4~5mm、长度6~10cm）、乙醇灯、乙醇棉球或碘伏棉球、。
500ml。
100ml；。
变色3.1.11．亚甲蓝指示液：取亚甲蓝0.5g，加水使溶解成100ml。
3.1.12．溴麝香草酚蓝指示液：取溴麝香草酚蓝0.4g，加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解，再加水至100ml。
变色范围 pH6.0~7.6（黄→蓝）。
3.1.13．酸性品红指示液：以酸性品红0.5g，加水100ml使溶解，再逐渐加1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第二滴，直至溶液呈草黄色；于沸水内保持15分钟，再静置2小时，滤过，即得。
2015版中国药典微生物限度培训-2014
27
培养基
环境浮游菌、沉降菌及表面微生物监测用培养基一般采用胰酪大豆 胨琼脂培养基（TSA） 当监测结果有疑似真菌或考虑季节因素影响时，可增加沙氏葡萄糖 琼脂培养基(SDA)。
28
请根据报告内容更新
培养条件GBT 16293-2010 医工业洁净室（区）浮游菌的测试方法
USP1116 无菌工艺环境的微生物控制与监测
41
Presentation title in footer | 00 Month 0000
四、培养基体系
最突出的变化：微生物质控分类及培养基体系 2010版 分类依据 项目1 项目2 按微生物类别分 细菌数 营养琼脂 霉菌及酵母菌数 玫瑰红钠琼脂 2015版 按营养条件分 需氧菌总数 胰酪大豆胨琼脂（TSA） 霉菌及酵母菌总数 沙氏葡萄糖琼脂（SDA）
12
Presentation title in footer | 00 Month 0000
尘埃粒子监测
监测方法：参照GB/T 16292-2010 《医药工业洁净室（区）悬浮粒 子的测试方法》 监测设备：
空气尘埃粒子计数器，多为光散射粒子计数器
工作原理： 当取样气流中的尘埃颗粒通过计数器散射腔的光敏感区时，光 遇到粒子时发生散射，这些光脉冲信号经光电二极管转换成电脉冲 信号，电脉冲次数反映粒子数，脉冲幅值反映粒子的粒径。 一台仪器可同时测定多个粒径通道的粒子。
采样点
不得少于2个
14
请根据报告内容更新
采样量
15
请根据报告内容更新
尘埃粒子标准
16
请根据报告内容更新
容易被忽略的UCL值：
UCL的计算：平均值均值的95%置信上限，微粒每立方米 （粒/m3）
2015版中国药典微生物限度
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑵ 水不溶性非油脂类供试品
• 取供试品， 用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨 缓冲液，或 pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪 大豆胨液体培养基制备成 1:10 供试液。 分散力较差的供试品，可在稀释液中加入 表面活性剂如 0.1%的聚山梨酯 80，使供 试品分散均匀。若需要，调节供试液 pH 值至 6～8。必要时，用同一稀释液将供 试液进一步 10倍系列稀释。
1.3.3计数方法适用性试验
1. 供试液制备 2. 接种和稀释 3. 抗菌活性的去除与灭活 4. 供试品中微生物的回收
– 平皿法 – 薄膜过滤法 – 最可能数法（MPN 法）
5. 结果判断
1.4 供试品检查
• 1.4.1检验量
– 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml
或cm²）。
– 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g 或
• 需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的 总菌落数（包括真菌菌落数）；
• 霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上 生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。
• 若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌 和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可 使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡 萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红 钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。
1.4.2供试品检查
• 供试液制备
– ⑷需用特殊方法制备供试液的供试品
• 膜剂供试品 • 肠溶及结肠溶制剂供试品 • 气雾剂、喷雾剂供试品 • 贴膏剂供试品
1.4.2供试品检查
1. 平皿法
– 平皿法包括倾注法和涂布法。 – 除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性
试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每 稀释级每种培养基至少制备2个平皿。 – 培养和计数 除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养 基平板在30～35℃培养3~5天，沙氏葡萄糖琼脂 培养基平板在20～25℃培养5 ~7天， 观察菌落 生长情况,点计平板上生长的所有菌落数，必要时 可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告 。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落 数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌 数报告规则报告菌数。 – 若同稀释级两个平皿的菌落数平均值不小于15， 则两个平皿的菌落数不能相差1 倍或以上。
射干合剂2015年版《中华人民共和国药典》微生物检查方法适用性研究
射干合剂2015年版《中华人民共和国药典》微生物检查方法适用性研究目的建立符合2015年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）要求的射干合剂的微生物限度检查方法。
方法采用2015年版《中国药典》方法对射干合剂进行微生物限度检查方法学验证。
薄膜过滤法进行样品前处理，使用6种菌株分别进行微生物计数检查和限度菌检查的方法适用性研究。
结果微生物计数检查的5种菌株的回收比值均在0.5～2之间，控制菌检查的大肠埃希菌检出合格。
结论射干合剂的微生物限度检查方法经验证符合2015年版《中国药典》要求。
Abstract：Objective To standardize the method of microbiological examination on Shegan Mixture in Chinese Pharmacopoeia 2015. Methods Chinese Pharmacopoeia 2015 was used. Microbial enumeration test and specified microorganisms test were used to verify Shegan Mixture. The samples were treated by membrane filtration. Six kinds of strains for microbiological counting and limiting bacteria were used to study applicability. Results Microbial counts of the five strains of the recovery ratio were between 0.5 to 2，and Escherichia coli tested by control bacteria was qualified. Conclusion The microbiological examination methods for Shegan Mixture can meet the requirements of Chinese Pharmacopoeia 2015.Key words：Shegan Mixture；microbial enumeration test；specified microorganisms test；membrane filtration method；Chinese Pharmacopoeia 2015射干合劑为本院临床应用多年的医院制剂，是著名儿科名家时毓民的经验方，由麻黄（炙）、射干、黄芩、前胡、苦杏仁、僵蚕、蔊菜、蝉蜕、百部（炙）等组成，具有宣肺清热、止咳祛痰平喘的功效，常用于治疗感冒咳嗽、急性支气管炎及哮喘性支气管炎引起的咳嗽、多痰等症状。