PCR技术发展与应用的研究进展
PCR技术用于基因治疗及研究的进展
分子生物学课程论文题目PCR技术用于基因治疗及研究的进展班别学号姓名成绩PCR技术用于基因治疗及研究的进展摘要PCR技术与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个现代分子生物学的实验工作基础。
PCR技术使微量的核酸（DNA或RNA）操作变得简单易行，同时还可使核酸研究脱离活体生物。
PCR技术的发明是分子生物学的一项革命，极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。
[1]本文在简述PCR技术原理的基础上,综述了PCR在基因治疗和生物研究方面的概况。
关键词PCR技术聚合酶链式反应DNA体外扩增基因治疗1.前言1983年KaryMullis发明了一种特异性DNA体外扩增技术—聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）,是体外扩增DNA序列的技术.原来的PCR只能单纯扩增已知两端序列之间的DNA片段，现在可以扩增到已知序列两侧的未知序列，甚至可以扩增到序列未知的新基因。
PCR的模板也从原来要用的DNA发展到直接用RNA作为模板，即反转录PCR，这就使得从真核生物中扩增目的基因变得很容易。
PCR原本是一种定性的方法只能回答样品中有无目的基因存在，现在已经可以用来定量测定，即回答样品中原始模板的确切数目。
PCR扩增的片段也从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。
PCR也从单纯用来扩增基因到能将两个以上的基因连接起来，省去了限制性内切酶消化和用连接酶连接的步骤，这就是所谓的克隆PCR。
再加上PCR方法与其他方法联合应用，到目前为止已报道的PCR方法有几十多种之多。
PCR技术建立以来，在20多年的时间里发展很快，已有一系列PCR方法被设计出来，并广泛应用于遗传学、微生物学乃至整个生命科学的研究中。
PCR技术的出现极大地推动了分子生物学的发展。
[2]由于PCR技术的实用性和极强的生命力，PCR方法还将会被不断完善，进一步在生命科学研究中发挥更大的作用。
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用
实时荧光定量PCR的研究进展及其应用一、本文概述实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在分子生物学领域广泛应用的分子生物学技术，它能够在PCR 扩增过程中实时监测反应产物的积累，从而精确地定量目标DNA或RNA的初始浓度。
自20世纪90年代诞生以来，qPCR技术以其高灵敏度、高特异性、快速性和定量准确等优点，在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等多个领域发挥了重要作用。
随着技术的不断发展和完善，实时荧光定量PCR已成为现代生物学研究中不可或缺的工具。
本文旨在全面综述实时荧光定量PCR技术的最新研究进展，包括其原理、方法、技术优化、应用领域的拓展以及面临的挑战等。
文章首先简要介绍qPCR技术的基本原理和常用方法，然后重点论述近年来在技术优化、多重PCR、数字化PCR等方向上的进展。
接着，本文详细探讨实时荧光定量PCR在基因表达分析、病原体检测、基因型鉴定、基因突变分析、药物研发等领域的应用案例和前景。
文章还将讨论实时荧光定量PCR面临的挑战，如引物设计、数据分析等问题，并提出相应的解决方案。
通过本文的综述，读者可以对实时荧光定量PCR技术的最新进展和应用有一个全面的了解，为相关研究提供参考和借鉴。
二、实时荧光定量PCR的基本原理与技术特点实时荧光定量PCR（Real-time Fluorescent Quantitative PCR，简称qPCR）是一种在PCR扩增过程中，通过对荧光信号的实时检测，对特定DNA片段进行定量分析的技术。
其基本原理是利用荧光染料或荧光标记的特异性探针，在PCR反应过程中实时检测PCR产物量的变化，从而得到DNA模板的初始浓度。
实时性：通过荧光信号的实时检测，可以实时了解PCR产物的生成情况，无需PCR结束后进行电泳等后续操作，大大缩短了实验时间。
定量性：通过标准曲线的建立，可以准确地计算出DNA模板的初始浓度，实现了PCR的定量分析。
最新PCR技术的发展和应用
TAIL-PCR 技术的基本原理是利用目标序列 旁的已知序列设计3 个嵌套的特异性引物 ( special prime, 简称sp1，sp2，sp3，约 20 bp), 用它们分别和1个具有低Tm 值的短 的(14 bp) 随机简并引物(Arbitrary degenerate prime 简称AD) 相组合, 以基因 组DNA 作为模板, 根据引物的长短和特异性 的差异设计不对称的温度循环, 通过分级反应 来扩增特异引物
巢式PCR可以增加有限量靶序列（如 稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了 困难PCR的特异性。
另外，如果大片断扩增错误，则小片 断错误扩增的概率很大。
锚定PCR（Anchored PCR）
以基因组总DNA 为起始材料, 用于克隆某一已知 片段的侧翼序列, 如分离某一基因的调控序列, 分 析T-DNA 或转座子插入突变体等。
第一次循环时，外引物的融合温度只能比没 有GC-clamp的引物稍高一点，在起始循环后， 由于GC- clamp已导入初级产物，因此以后 的融合温度可以提高。
由于采用了两种不同退火温度的引物，所以 巢式PCR的程序与普通PCR不同，整个程序 中某个阶段一些引物工作，另一些引物 “休 闲”，在另一阶段，“休闲”的引物开始工 作。
在设计引物时，必须使外引物的GC%含量高于 内引物，因而在一个含有不同引物的反应管中， 早期的PCR循环中，长引物在较高的温度下与 模板特异结合，此时内因物是被排斥的，因此 扩增产物是外长片段，在后期PCR循环时，由 于融合温度改变到只适于套组引物，外引物是 被排斥的，因此，此时的扩增产物是套组片段。 因此，巢式PCR的关键是引物设计，可以在外 引物5ˊ端增加多个GC钳子（GC- clamp）达到 扩增片断的目的。
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展
实时荧光定量PCR技术及其应用研究进展实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR，Real-time qPCR）是一种通过荧光信号实时测量PCR产物累积量的技术，可以在PCR反应过程中实时监测PCR 产物的数量。
这种技术结合了常规PCR技术的放大特异性和荧光标记探针的特异性探测，使得PCR分析更加准确、精确。
实时荧光定量PCR技术广泛应用于基因表达分析、病原体检测、细胞检测、突变分析等领域。
下面将分别介绍该技术在不同领域的应用研究进展。
在基因表达分析中，实时荧光定量PCR可用于测量特定基因在不同组织或不同发育阶段中的表达量。
该技术的灵敏度高、动态范围广，并可同时分析多个基因。
通过实时监测PCR产物的累积，可以获得准确的基因表达水平。
实时荧光定量PCR还可以用于研究非编码RNA的表达，如长非编码RNA（lncRNA）和微小RNA（miRNA）。
在病原体检测中，实时荧光定量PCR可用于快速、准确地鉴定和定量各类病原体。
各类病毒、细菌、真菌等的快速检测和定量分析。
由于实时荧光定量PCR具有高灵敏度和高特异性，能够在短时间内完成大量样本的分析，广泛应用于临床诊断和食品安全领域。
在细胞检测中，实时荧光定量PCR被用于检测细胞中的特定基因表达水平，并研究基因在细胞中的调控机制。
通过测量细胞内转录因子基因的表达变化，可以了解基因调控网络的变化情况。
在突变分析中，实时荧光定量PCR可用于检测某一基因的突变频率，如药物抗性相关基因的突变频率。
通过实时监测突变型和野生型基因的相对数量，可以计算出突变频率，为个性化药物治疗提供参考。
实时荧光定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性、高准确度和高通量性等优点，在生命科学研究和临床应用中发挥着重要作用。
随着技术的不断进步和应用领域的不断拓展，实时荧光定量PCR技术在分子生物学领域的应用前景将更加广阔。
PCR技术推动了分子生物学领域进步
PCR技术推动了分子生物学领域进步PCR（聚合酶链式反应）技术是一种重要的分子生物学技术，它在分子生物学领域中具有广泛的应用。
PCR技术的出现和发展极大地推动了分子生物学领域的进步，为科学家们在基因组学、医学研究、疾病诊断和法医学等领域提供了强有力的工具。
PCR技术的推动作用体现在其在基因组学研究中的应用。
PCR技术通过放大DNA片段，使得科学家们能够更加准确地研究基因组的组成和功能。
在过去，科学家们在研究基因组时只能依赖于一些传统的技术，如限制性酶切的方法。
然而，这些方法往往需要较长的时间和大量的DNA样本，并且无法放大特定的DNA片段。
而PCR技术的出现改变了这一现状，它能够快速、精确地放大DNA片段，为基因组研究提供了便捷和高效的工具。
科学家们可以根据已知的DNA序列设计特定的引物，通过PCR技术扩增出感兴趣的DNA片段，进一步研究和解读基因组。
此外，PCR技术在医学研究和疾病诊断中的应用也十分重要。
PCR技术可以被用来检测和鉴定病原体，包括病毒、细菌和真菌等。
通过设计特异性的引物，科学家们可以利用PCR技术检测感兴趣的病原体，从而提高疾病的诊断准确性和效率。
这对于病毒性疾病、细菌感染和真菌感染等疾病的早期诊断和防治具有重要意义。
此外，PCR技术还可以被用于基因突变的检测和遗传性疾病的筛查，帮助科学家们更好地理解疾病的发生机制，并为疾病的治疗和预防提供参考。
PCR技术在法医学领域也有广泛的应用。
在犯罪侦查和案件调查中，DNA的信息十分重要。
PCR技术通过放大DNA 片段，使得科学家们可以从微量的DNA样本中提取足够的DNA片段进行分析。
这对于解决一些涉及个人身份鉴定、犯罪现场DNA分析以及遗失人口的身份确认等问题非常有帮助。
PCR技术的高灵敏度和高特异性使得DNA的检测和分析更加准确和可靠，为法医学和刑事司法领域提供了重要的技术支持。
总的来说，PCR技术的推动作用体现在其在基因组学研究、医学研究、疾病诊断和法医学等领域的广泛应用。
PCR技术的新进展
基因组学研究
基因组测序
PCR技术是基因组测序的关键步骤之一，用 于合成更长的DNA片段，提高测序的准确 性和覆盖率。
基因组编辑
基于PCR技术的基因组编辑技术如CRISPRCas9，能够实现对特定基因的敲除、插入 和修复，为遗传疾病治疗和农作物改良提供 可能。
05
pcr技术的未来展望
pcr技术的改进与创新
02
新一代pcr技术
数字pcr
数字PCR是一种高灵敏度和高特异性的绝对定量技术，通过将待测样本分成大量独立的反应单元，每 个单元中包含一个或多个起始分子，进行独立扩增，通过计数每个反应单元中阳性与阴性结果的个数 ，计算出待测样本中目标分子的数目。
数字PCR具有高灵敏度、高分辨率和高准确性的特点，能够检测单拷贝基因，适用于稀有基因变异、 低丰度基因表达以及突变负荷的检测等。
基因表达
PCR技术可用于检测基因在不同组织或发育阶段的表达情况，有助于理解基因在生命过 程中的作用。
基因突变研究
突变检测
PCR技术能够检测DNA序列中的突 变，包括点突变、插入和缺失等，为 遗传病研究和药物研发提供有力工具 。
突变定位
通过PCR扩增和测序，可以精确定位 突变位点，为遗传咨询和产前诊断提 供依据。
实时PCR是一种实时监测PCR扩增过程的检测技术，通过在 反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号的变化 实时监测PCR扩增过程。
实时PCR具有高灵敏度、高特异性和可重复性强的特点，能 够实现自动化操作，广泛应用于基因表达分析、病原体检测 和基因突变研究等领域。
逆转录pcr
逆转录PCR是一种将RNA逆转录为 cDNA再进行PCR扩增的技术，用于 检测细胞或组织中特定基因的表达水 平。
pcr 国内发展现状
pcr 国内发展现状PCR（聚合酶链反应）是一种可以在体外复制和扩增特定DNA片段的分子生物学技术。
自1983年PCR技术被开发以来，它在许多领域的应用取得了巨大成功，如医学诊断、基因工程、体外复制等。
以下是PCR在国内的发展现状：首先，PCR在医学诊断领域的应用十分广泛。
例如，PCR可以用于检测各种病原体，如细菌、病毒和寄生虫。
临床上，PCR被广泛用于诊断肿瘤、传染病和遗传病等疾病。
通过检测特定的DNA序列，PCR可以提供高度敏感和特异性的诊断结果，有助于早期发现和治疗。
其次，PCR在农业科学中的应用也越来越重要。
PCR可以用于检测和鉴定农作物病害、害虫和转基因作物。
通过PCR技术，可以快速、准确地鉴定受感染植物或有害昆虫的存在，有助于保护农作物的质量和产量。
此外，PCR还可以用于育种和品种鉴定等农业研究领域。
此外，PCR在环境监测和食品安全领域也有广泛的应用。
例如，PCR可以用于检测水源中的细菌、寄生虫和病毒，以及环境中的重金属和污染物。
在食品安全方面，PCR可以用于检测食品中的潜在病原体和转基因成分。
这些应用可以提高环境和食品安全的监测能力，保护公众的健康和安全。
此外，PCR技术也在基础研究中发挥了重要作用。
例如，PCR 可以用于DNA测序、基因突变分析、基因表达研究等。
PCR 的快速、高效、准确的特性为基础研究提供了强有力的工具，推动了生命科学等领域的发展。
不过，尽管PCR技术在国内已经得到广泛应用，但还存在一些挑战。
首先，PCR技术的操作较为复杂，需要高度的专业知识和实验技术。
此外，PCR技术中的污染问题也需要重视，否则可能会导致假阳性结果。
另外，PCR技术的成本相对较高，限制了其在一些基层医疗机构和农村地区的应用。
总结起来，PCR技术在国内的发展已经取得了显著进展，广泛应用于医学诊断、农业科学、环境监测和基础研究等领域。
随着技术的不断进步和成本的降低，相信PCR技术的应用将进一步扩展，并在更多领域发挥重要作用。
分子生物学技术的研究进展及应用
分子生物学技术的研究进展及应用随着科技的不断进步和发展，分子生物学技术成为了人类研究生命学科的一大利器。
分子生物学技术通过对生物分子及其相互作用的研究，为解释生命现象及其发生机制提供了新的思路和方法。
分子生物学技术的应用涵盖了基础科研和应用领域的各个方面，如医学、农业、环境科学等，为人类提供了更好的生活品质。
1. PCR技术PCR技术是目前分子生物学领域最具代表性的技术之一。
PCR技术可以在短时间内扩增生物样本中的DNA序列，从而将其放大到足够的数量进行研究和分析。
PCR技术操作简便，准确性高，可用于研究基因的发生、发展、多态性和演化等过程。
除了在生物学领域中的广泛应用，PCR技术还常用于医学诊断、药物筛选等方面。
2. 基因芯片技术基因芯片技术是一种高通量的基因分析方法，可以同时识别和量化数百至数万个基因。
它基于表达谱学，通过对不同阶段基因表达的比较，实现基因的鉴定与分析。
基因芯片技术的应用范围非常广泛，包括癌症、心血管疾病、神经退行性疾病、肝病、肾病等多种疾病的基因诊断和治疗。
3. 基因编辑技术基因编辑技术是近年来兴起的一项分子生物学技术。
它可以修改细胞的基因序列，使其具有某种特定的性质或功能。
目前基因编辑技术最重要的平台是CRISPR/Cas9。
CRISPR/Cas9是一种靶向基因编辑工具，可以对任何基因进行编辑，而且精度较高。
基因编辑技术的应用涵盖了很多领域，如基因治疗、重要作物品种改进、疾病研究等。
4. 基因组学和蛋白质组学基因组学和蛋白质组学为解码生命信息提供了强大的工具。
基因组学研究的是组成基因组的DNA分子，而蛋白质组学研究的是蛋白质。
它们在各自领域里扮演着重要的角色。
例如，基因组学研究可以揭示生物的遗传信息，蛋白质组学则可以更深入地了解生物的功能和进化。
5. 二代测序技术二代测序技术是分子生物学领域的一项重要技术。
它可以快速地进行DNA测序，从而加速对生物结构和功能的理解和研究。
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PCR技术发展与应用的研究进展摘要：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是最常用的分子生物学技术之一，通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增．定量PCR技术是克服了原有的PCR 技术存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等，快速PCR技术快速PCR在保证PCR反应特异性、灵敏性和保真度的前提下，在更短时间内完成对核酸分子的扩增．mRNA 差异显示PCR技术是在基因转录水平上研究差异表达和性状差异的有效方法之一．近年来已经开展了许多这三方面的研究工作，本文就定量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示PCR 技术作一综述，以便更好地理解及应用这项技术。
关键字：定量PCR；荧光PCR；快速PCR；DNA聚合酶；mRNA差异显示PCR聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术由于PCR简便易行、灵敏度高等优点，该技术被广泛应用于基础研究。
但是，由于传统的PCR技术不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其在临床上的应用受到限制[1]。
鉴于此，对PCR产物进行准确定量便成为迫切的需要。
几经探索，先后出现了多种定量PCR (quantitative PCR，Q-PCR)方法，其中结果较为可靠的是竞争性PCR和荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR)。
随着生命科学和医学检测的不断发展，人们越来越希望在保证PCR反应特异性、灵敏性、保真度的同时，能够尽量缩短反应的时间，即实现快速PCR(Rapid PCR or Fast PCR)。
快速PCR技术不仅可使样品在有限的时间内可以尽快得到扩增，而且可以显著增加可检测的样品数量，显然，在大批量样本检测和传染病快速诊断等方面将会有重要的应用前景。
例如，快速PCR在临床检测中可大大加快疾病的诊断效率；在生物恐怖袭击时能有效帮助快速鉴定可疑物中有害生物的存在与否；同时，由于PCR已经渗入到现代生物学研究的各个方面，快速PCR的实现必然可以使许多科学研究工作的进展显著加快，最终影响到整个生物学发展的速度。
近年来，快速PCR技术得到了可喜的进展。
从聚合酶的改进、添加剂的开发以及热循环仪的革新创造三个不同途径上分别进行的研发表明。
生物的性状和生物对各种生物、理化及致病因子的应答，本质上都是基因在时间上或空间上选择性表达，即基因的差异表达的结果，因而，获取差异表达的基因信息，将有助于了解生物的生理变化和病理改变的分子机制[2]。
研究基因差异表达主要技术有：消减文库筛选、差异杂交、代表性差异分析、基因表达序列分析、电子消减技术[3]和mRNA差异显示PCR技术等(mRNA Differential Display PCR，简称DD-PCR[4] )。
迄今为止，上面的几种方法已成功地用于基因差异表达的研究。
尤其是mRNA差异显示PCR技术，虽然发明只有短短十几年，已经取得了令人瞩目的科研成果，原因是它具备需要总RNA 的量极少，不需要纯化的mRNA，操作简便、快速、灵敏等优点[5-8]，故已被许多生命科学实验室作为一种重要工具，应用于体内和体外差异表达基因的筛选，研究基因功能[9]。
现将定量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示PCR技术研究情况作一综述作简要综述。
1 定量PCR技术定量PCR（Polymerase Chain Reaction）技术有广义概念和狭义概念。
广义概念的定量PCR技术是指以外参或内参为标准，通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量。
狭义概念的定量PCR技术（严格意义的定量PCR技术）是指用外标法（荧光杂交探针保证特异性）通过监测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假阴性结果(扩增效率为零)。
广义概念下的定量PCR 技术可以分为五种类型：（1）外参法+终产物分析，是指样本与阳性参照在两个反应容器内反应。
这种类型没有对样本进行质控监测，易出现假阴假阳结果，没有监测扩增效率，定量不准。
（2）内参法+终产物分析，是指样本与阳性参照在一个反应容器内反应。
这种类型对样本进行质控监测，排除假阴结果，但是定量不准。
（3）外标法+过程监测，这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，但是无法排除假阴结果。
（4）内参法+过程监测，由于样本与阳性参照在一个容器内反应，用同样的Taq酶和反应参与物，存在竞争性抑制，起始模板量浓度高的反应会抑制起始模板量浓度低的反应，所以定量不准。
（5）外标法+过程监测+内对照，这种类型监测扩增效率，阳性样本定量准，同时排除假阴结果。
这种类型是应该提倡的。
1.1 竞争性PCR技术定量PCR技术是对传统PCR技术的进一步发展和补充，在定量过程中需借助各种形式的参照物。
参照物是一种已知含量的标准模板，按其是否与待测样品在同一反应体系中扩增而分为内参照和外参照。
鉴于PCR扩增过程中管与管之间的扩增效率存在差异，理想的定量PCR应该使用内参照。
竞争性PCR即是采用内参照的一种定量PCR方法，通过消除管间及样品间的变异，从而达到较为精确的基因定量[10]。
该方法是将待测基因与已知浓度的内参照模板在同一反应管中共同扩增，由于二者具有相同引物的结合位点并采用同一引物进行扩增，因此二者竞争引物、脱氧核苷酸以及DNA聚合酶，以致当一种模板量逐渐增加时，另一种模板的扩增产物就会逐渐减少。
两模板的扩增产物量可分别用以下公式表示：Y待测= X待测(1+E)n；Y内参照= X内参照(1+E)n，其中X待测为起始拷贝量；Y待测为扩增产物量。
由于在同一反应体系中扩增，两模板的循环次数n保持一致，如果使两者间的扩增效率E也相同，就存在如下关系：Y待测/Y内参照= X待测/X内参照。
当两模板的产物量相同时，则两模板的反应起始拷贝数相等，由此可对待测模板进行精确定量。
具体检测方法是将已知浓度的内参照模板倍比稀释后分别与恒定量的待测基因一起扩增，以参照模板的起始拷贝数为横轴，以两模板扩增产物量的比率为纵轴，作出标准曲线，纵坐标为1的点所对应的参照模板的起始拷贝数即为待测基因的拷贝数。
由上述定量原理可知，保持两模板扩增效率E的一致性是定量的关键，为此要求参照模板应与待测基因具有相似的大小及序列，相同的引物结合位点。
此外，参照模板还应在扩增后易于分离检测。
因此，对于竞争性PCR的研究重点主要集中在建立高效、稳定、可靠的模板方面，现已取得了较满意的结果[11-13]。
1．2 荧光定量PCR技术荧光定量PCR（RQ-PCR技术）是通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。
Ct值( cycle threshold，Ct )，即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
1.2.1 Taqman技术Taqman 技术由美国PE公司开发，现已广泛用于基因检测。
该技术的原理是利用Taq 酶的5’-3’外切酶活性，在传统PCR技术一对特异性引物的基础上增加了一条荧光双标记探针。
该探针可与上、下游引物之间的DNA模板序列特异性结合。
探针的5’端标以荧光报告基团，如FAM(62羧基荧光素)；3’端标以荧光淬灭基团，如TAMRA(62羧基四甲基诺丹明) 。
当探针保持完整时，两个基团的空间距离非常接近，构成荧光能量传递( FRET) 关系，5’端荧光报告基团发出的荧光信号被3’端淬灭基团吸收，使其不能被仪器检测。
当两个基团发生分离后，两者间的FRET关系被破坏，淬灭基团的抑制作用解除，报告基团的荧光信号便得到释放。
在PCR退火复性期，探针与DNA 模板特异性结合。
在PC R延伸阶段，Taq酶在引物的引导下，以四种脱氧核苷酸为底物，按碱基配对原则沿着模板合成新链，当移动至探针结合的位置时便发挥其5’-3’外切酶活性将探针降解成单核苷酸，使得荧光报告基团与淬灭基团分离，前者的荧光信号释放并被检测。
由此可见，每合成一条新链就有一个探针被裂解并释放出一个荧光信号。
根据这种关系，通过检测PCR反应液中的荧光强度，再经校正计算后即可得出初始模板的数量。
Taqman技术现主要用于病毒的定量分析，病原体的分型鉴定，基因的快速诊断分析[14-16]。
1.2.2 AmpliSensor 技术该技术与Taqman PCR的区别在于其采用的是复合探针。
一个探针上标以荧光报告基团，另一个探针上标以荧光淬灭基团，后者的5’端较前者多出7个碱基( GCGTCCC)。
两探针之间能因碱基互补而结合，此时两基团靠近而形成FRET结构，报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收。
当两探针分开后，其间的FRET关系受到破坏，淬灭基团的抑制作用解除，报告基团的荧光信号得到释放。
在PCR扩增前需将该复合探针与一个半套式PCR引物连接，该引物的5’端应具有一段与长探针上多出的7个碱基互补的序列，以便DNA连接酶能将该引物与短探针连接。
扩增时该探针2引物复合物作为半套式引物掺入到模板，并释放出淬灭探针，使原有的FRET结构破坏，从而释放出报告基团的荧光信号，其强度与被扩增的模板数相对应。
Matera G等[17]用AmpliSensor技术对丙型肝炎病毒(hepatitis Cvirus HCV)的基因型进行检测，发现此方法具有很高的特异性，能准确检测待测标本中DNA的基因型和含量。
1.2.3 Lightcycler技术Lightcycler技术是Roche公司新近开发的一种PCR定量技术。
该技术的特点[18,19]也是将荧光报告基团和淬灭基团分别标记在两个不同的探针上，形成荧光探针和淬灭探针。
荧光报告基团标于探针的5’端，荧光淬灭基团标于探针的3’端，两探针能分别与模板同一条链中相邻的核苷酸序列进行杂交。
当探针游离时能检测到报告基团的荧光信号；如果反应体系中存在特异性模板，PCR复性阶段两探针即会与之杂交，此时两探针上的荧光报告基团和淬灭基团相距很近，形成FRET关系，前者的荧光信号被后者吸收，即发生荧光淬灭。
由于荧光淬灭的程度与被扩增的模板量相对应，因此可达到定量的目的。
Kearns AM等[20,21]报道，Light-cycler技术在对病毒DNA的快速分型和定量方面有特殊的优势。
1.2.4 Molecular beacon技术亦称分子信标技术是一种单链DNA 形成的发夹结构，在其一端有一报告基团，在另一端有一淬灭基团，当它形成发夹结构时，由于荧光报告基团与淬灭基团想互靠近，两者之间发生荧光信号能量共振转移( fluorescent resonance energy transfer FRET)，当热循环温度达到分子beacon的解链温度时，其构象改变，与模板结合而完全伸展成线性分子，使得FRET消失，报告基团发出荧光信号。