组织特异性细胞外基质对体外培养hPDLSCs干细胞特性的维持及体内分化的研究
干细胞的分子生物学特性与应用
干细胞的分子生物学特性与应用干细胞是一类具有自我更新和分化为多种细胞类型潜能的细胞。
其分子生物学特性和应用广泛研究，包括干细胞的标记、增殖、分化、信号传导等方面。
本文将探讨干细胞的分子生物学特性以及其在不同领域的应用。
一、干细胞的分子特性干细胞具有以下几种分子特性，这些特性是随着技术的发展而逐渐被揭示出来的。
1. 自我更新能力：干细胞具有不断自我更新的能力，可以不断分裂并产生新的干细胞。
这种能力是由细胞内特定的分子机制调节的，如转录因子Oct4、Sox2、Nanog等参与了干细胞的自我更新。
2. 多能性：干细胞可以分化为特定细胞类型，如胚胎干细胞可以分化为各类器官的细胞，而成体干细胞则可以分化为特定组织的细胞。
这种多能性是通过控制基因表达网络来实现的。
3. 增殖能力：干细胞可以快速进行增殖，保持细胞数量的稳定。
这一过程受到细胞周期的调控，包括有丝分裂与无丝分裂等。
4. 信号传导途径：干细胞的自我更新和分化过程受到多个信号传导途径的调控，如Wnt、Notch、Shh和BMP等信号通路可以调节干细胞的命运决定。
二、干细胞在医学研究中的应用由于干细胞具有多能性和自我更新能力，其在医学研究中有着广泛的应用，如下所示。
1. 组织工程：干细胞可以用于组织工程，通过在支架上培养干细胞并诱导其分化为特定细胞类型，形成人工组织用于修复和替代受损组织。
2. 疾病建模：干细胞可以从病人体内获得，并通过诱导其分化为特定细胞类型，建立疾病模型进行研究。
这有助于深入理解疾病发生的分子机制，并为新药研发提供平台。
3. 药物筛选：干细胞可以用于药物筛选，通过在体外培养干细胞并将其分化为特定细胞类型，测试不同药物对细胞的效果，为新药的开发提供便利。
4. 细胞治疗：干细胞可以用于细胞治疗，将其分化为特定组织的细胞并进行移植，用于修复受损组织或替代功能缺失的细胞。
三、干细胞在科学研究中的应用除了在医学领域的应用之外，干细胞还在科学研究中有着广泛的应用。
干细胞具有自我复制和分化为特定细胞类型能力
干细胞具有自我复制和分化为特定细胞类型能力干细胞是一种具有特殊能力的细胞，能够自我复制并分化为特定细胞类型。
这种独特的特性使干细胞具有广泛的潜在应用价值，从组织修复和再生医学到药物开发和疾病研究。
干细胞的自我复制能力使其能够不断产生新细胞，维持其数量的稳定。
这种能力使干细胞成为组织修复和再生的有力工具。
例如，在骨髓移植中，造血干细胞能够自我复制并分化为成熟的血细胞，以治疗一系列血液病和免疫系统疾病。
此外，干细胞通过自我复制，也为器官移植提供了重要的源头。
干细胞可以从多种来源获得，包括胚胎干细胞、成体组织干细胞和诱导多能干细胞。
干细胞的分化能力是其最为重要的特性之一。
干细胞能够分化为各种类型的特定细胞，包括神经细胞、心肌细胞、肝细胞等。
这种能力使干细胞在组织工程、疾病治疗和新药研发方面具有巨大的潜力。
例如，在神经退行性疾病治疗中，干细胞可以分化为神经细胞，替代受损的神经组织，从而恢复功能。
同样，在心肌组织修复方面，干细胞的分化能力也被广泛应用。
干细胞可以分化为心肌细胞，修复心脏组织，治疗心脏病。
除了自我复制和分化能力，干细胞还具有其他一些重要的特性。
例如，干细胞具有长寿命和能力进行自我修复。
这使得干细胞能够在长时间内持续提供新细胞，从而满足组织修复的需求。
此外，干细胞还具有低免疫原性，能够逃避免疫系统的攻击。
这为干细胞的移植和治疗提供了重要的便利。
然而，干细胞也存在一些潜在的风险和挑战，如细胞突变和传染病传播的风险，以及伦理和道德问题。
对于干细胞的研究和应用已经取得了巨大的进展，但仍然面临许多挑战。
其中之一是如何获取足够的干细胞，以满足治疗和研究的需求。
干细胞的获取有时涉及到伦理和道德问题，如胚胎干细胞的使用。
另一个挑战是如何控制干细胞的分化过程，使其分化为特定细胞类型。
此外，长期安全性和效果的评估也是一个重要的问题，需要进行深入的研究。
总而言之，干细胞具有自我复制和分化为特定细胞类型的能力，这使其成为医学和生物科学领域的重要研究方向。
细胞外基质和间充质干细胞在组织修复和再生中的作用
细胞外基质和间充质干细胞在组织修复和再生中的作用在人类的生命过程中，我们经历了各种各样的外部伤害和内部疾病。
这些外来因素会破坏我们身体的组织结构和细胞功能，导致身体受损。
然而，人体的自我修复能力是相当强大的。
在这样的环境下，细胞外基质和间充质干细胞展现出了其在组织修复和再生中的重要作用。
细胞外基质是组成身体各种组织的结构和支撑物。
它由胶原蛋白和其他细胞外分子组成，构成了复杂的细胞外基质网络。
它的结构可以为身体提供稳定性和可塑性并防止伤害。
细胞外基质不仅提供保护和支撑，而且还参与和控制细胞的生长差异及复制。
通过这种方式，它可以影响到细胞的功能，促进组织修复和再生。
间充质干细胞一般是从成年人骨髓、脂肪组织或其他来源中获得的一类干细胞。
它们具有多种分化能力，可以分化成肌细胞、神经细胞、心脏细胞等多种细胞类型，帮助组织修复和再生。
一些研究发现，间充质干细胞可以释放出一些信号分子和细胞因子，调节细胞的自我修复并增加受损组织中的血管生成，以促进再生和修复。
细胞外基质和间充质干细胞在组织修复和再生中的相互作用被广泛地研究。
研究人员发现，细胞外基质可以加强间充质干细胞的效应，以促进组织修复和再生。
同时，间充质干细胞可以通过分泌胶原蛋白、纤维连接蛋白等主要细胞外分子，影响细胞外基质的组成和分布。
通过这种方式，间充质干细胞可以调节身体中的细胞外基质，有助于组织修复和再生。
例如，在肝脏再生中，细胞外基质和间充质干细胞的作用显得尤为重要。
肝脏是一个重要的代谢器官，可以清除体内有害物质和维持体内的平衡。
但当肝脏受到疾病或损伤时，它仍然可以通过其自我修复机制来恢复功能。
研究发现，间充质干细胞可以通过分泌成纤维细胞生长因子、肝生长因子等细胞因子来促进肝脏再生并减轻对肝脏的损伤。
同时，细胞外基质也有助于肝脏细胞的恢复和再生。
在这个过程中，细胞外基质和间充质干细胞之间的相互作用是非常重要的。
在神经修复方面，细胞外基质和间充质干细胞也扮演着重要角色。
干细胞的分化与定向诱导技巧
干细胞的分化与定向诱导技巧干细胞是具有自我更新能力和多向分化潜能的一类基础细胞。
在医学领域，干细胞具有广阔的应用前景，可以用于组织重建、疾病治疗以及新药研发等方面。
干细胞的分化与定向诱导是实现这些应用的关键步骤，本文将介绍干细胞分化的基本原理和常用的定向诱导技巧。
干细胞分化的基本原理是指通过调控细胞内外环境来引导干细胞向特定细胞类型分化的过程。
在自发分化过程中，干细胞通过自身的遗传调控和信号传导路径来实现分化。
而定向诱导技巧则是通过外部介入，利用特定的因子和技术手段来控制干细胞的分化方向，使其转变为目标细胞类型。
在干细胞分化的过程中，存在内源性和外源性两种分化信号。
内源性信号是指体内存在的调控因子，如基因表达调控和细胞信号通路等。
外源性信号则是指通过外部途径引入的调控因子，如特定细胞因子和生化材料等。
这些信号可以单独或联合作用，通过激活或抑制细胞内特定信号通路，从而实现干细胞向特定细胞类型的转变。
定向诱导技巧主要包括生化诱导和物理诱导两种方法。
生化诱导是利用生物化学因子来诱导干细胞的分化。
常见的生化诱导因子包括生长因子、转录因子和化学物质。
生长因子可以通过激活特定信号通路促进细胞增殖和分化，转录因子则可以通过与DNA结合来控制基因表达，进而诱导细胞分化。
化学物质则可以改变细胞内的环境，如酶抑制剂和分化诱导剂等。
生化诱导的优势在于可以精确地调控分化的时间和程度，但其不足之处在于需要优化诱导因子的浓度和时间，以及需要解决因子稳定性和细胞毒性等问题。
物理诱导是利用物理力学原理来诱导干细胞的分化。
常见的物理诱导方法包括微环境模拟和力学刺激。
微环境模拟是通过模拟细胞自然生长环境，如细胞外基质、细胞间隙和培养基等，来提供合适的生长条件和机械性刺激，从而引导干细胞的分化。
力学刺激是通过应用机械压力、牵拉力或剪切力等来调节细胞内外环境，从而影响干细胞的分化。
物理诱导的优势在于可以模拟细胞自然生长环境，更好地保持细胞功能和生化特性，但其不足之处在于需要优化刺激力的强度和时间，以及需要解决刺激对细胞的毒性和特异性等问题。
细胞外基质在组织工程中的应用_李珍美玉
1.1 胶原蛋白 胶原蛋白是结构蛋白质，具有 α 链 组成的三股螺旋构象（即胶原域），按其功能分为成 纤维胶原和非纤维胶原。成纤维胶原其胶原域是由 长而不中断的三股螺旋组成，包括Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅴ，Ⅺ 型，主要构成细胞外基质中的纤维。非纤维胶原其胶 原域中的 3 股螺旋是不连续的，至少存在 1 个中断 处，主要包括Ⅳ型（基底膜型），Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ，Ⅻ，ⅩⅣ， ⅩⅥ，ⅩⅨ型（RH 型），主要结合于纤维表面或形成 网状结构。Itoh 等[2]用Ⅰ~Ⅲ型胶原构建神经支架材 料，施万细胞在支架材料上生长状态良好，提示其具 有良好的生物相容性。MaW 等[3]将胚胎大鼠神经皮 层或亚皮层的神经干细胞和祖细胞加入具有三维结 构的胶原凝胶体中，联合培养在含有成纤维细胞生 长因子（bFGF）的牛血清介质中。第 5 天时细胞迅速 增殖并且出现神经巢蛋白，第 14 天时许多分化细胞
[摘 要] 细胞外基质（ECM）作为一种特殊的天然生物衍生材料，为细胞提供了生物物理机械性支持，并且可为
组织的再生提供良好的微环境。近年来，细胞外基质已广泛应用于组织工程的再生修复，并展现出了其良好的应用前
景。本文对细胞外基质的主要成分、功能及细胞外基质在组织工程，尤其是在组织工程神经方面的研究进行了综述。
2 细胞外基质与组织工程
2.1 细 胞 外 基 质 的 优 良 特 性 目前合成支架材料 的优点在于可控组成、可降解性及物理性能。缺点在 于缺乏组织器官特定的结构及特定细胞的生态位。 天然细胞外基质既具有合成支架材料的优点，又克 服了以上缺点，且具有较低的免疫原性及优良的生 物学特性。
实验证实植入宿主体内的细胞外基质支架材 料，在 28 天时降解率可超过 50%，在 60 天时可得到 完全降解，植入材料可被新的组织完全取代。95%的 细胞外基质代谢产物经过尿排泄，不会被其他组织 重新循环利用[18]。天然细胞外基质的迅速降解是通 过一些酶和细胞的活动实现的，也可通过细胞外基 质中的组成分子有规律的释放。细胞外基质中某些 分子释放一直持续到细胞外基质材料完全降解。更 为重要的是，降解过程中释放的分子介导接下来一 系列的组织器官重塑过程。在长期的组织再生过程 中，降解过程中所产生的某些肽类引发并维持了骨 髓来源的细胞的循环招募[18]。
表皮干细胞分化调控的研究进展
表皮干细胞分化调控的研究进展黄林生;刘英杰;侯玲玲;关伟军;马月辉【摘要】Epidermal stem cells (ESCs) are mainly located in basal layer and the bulge of the outer root sheath, characterized by non-differentiation , multiplying and self-renewing abilities. Isolation and culture epidermal stem cells in vitro, cultivating skin organ sample and using tissue engineering method to study the proliferation and differentiation , Though adding to our understanding of ESCs biology characteristics, this paper provides an overview of molecular mechanism on regulatingthe proliferation and differentiation of ESCs in recent years.%表皮干细胞(Epidermal stem cells,ESCs)主要是位于表皮基底层及毛囊外根鞘隆突部,具有自我更新和增殖分化能力的细胞.通过体外分离表皮干细胞、培养皮肤器官样组织和利用细胞工程等方法研究ESCs的增殖、分化调控过程,加深了对ESCs生物学特征的了解.就近几年来ESCs分化调控机制进行了综述.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)016【总页数】3页(P9723-9724,9727)【关键词】表皮干细胞;分化调控;研究进展【作者】黄林生;刘英杰;侯玲玲;关伟军;马月辉【作者单位】湖南农业大学动物医学院,湖南,长沙,410128中国农业科学院北京;集美大学体育学院,福建,厦门,361021;北京交通大学生命科学与生物工程研究院.北京,100044;中国农业科学院北京;中国农业科学院北京【正文语种】中文【中图分类】S188干细胞具有多向分化潜能，其干性的维持一方面受自身的影响，另一方面，又受周围环境的调控，干细胞所处的微环境又称为干细胞壁龛(Niches)[1-2]。
干细胞分化及定向分化的基本方法研究
干细胞分化及定向分化的基本方法研究干细胞具有自我更新和分化为多种细胞类型的能力，被认为是治疗许多疾病和损伤的潜在治疗方法。
在干细胞研究领域中，干细胞分化和定向分化是两个重要的研究方向。
本文将重点讨论干细胞分化及定向分化的基本方法研究。
干细胞分化是指干细胞转变为成熟细胞的过程，这一过程包括细胞增殖、细胞周期调控、细胞命运决定等关键步骤。
干细胞分化的基本方法研究主要包括以下几个方面：1. 体外培养条件优化：干细胞分化需要特定的培养条件来模拟体内环境。
优化培养基、细胞培养条件和生长因子添加剂等因素对于干细胞分化非常重要。
研究人员通过不断改良培养条件和添加特定的生长因子，可以促进干细胞朝特定细胞类型分化。
2. 诱导分化：通过添加特定的诱导剂或调控干细胞微环境，可以使干细胞朝着特定细胞系分化。
这些诱导剂可以是小分子化合物、蛋白质因子或基因转染等方式。
例如，使用特定的小分子化合物可以使干细胞向神经元分化，而使用不同的诱导剂则可以使干细胞分化成心肌细胞或肝细胞。
3. 转录因子调控：转录因子是调控基因表达的关键分子。
通过使用不同的转录因子，研究人员可以操纵干细胞的基因表达，从而对其分化方向进行定向控制。
例如，使用特定的转录因子组合可以将干细胞转化为胰岛素产生细胞，以治疗糖尿病。
4. 信号通路调控：干细胞分化受到许多信号通路的调控，包括Wnt、Notch、BMP和Hedgehog等通路。
通过调控这些信号通路的活性，可以控制干细胞的命运和分化。
研究人员可以通过添加特定的激动剂或抑制剂来调节这些信号通路，从而影响干细胞分化的方向。
干细胞定向分化是指将干细胞有选择地定向分化为特定细胞类型的过程。
干细胞定向分化的基本方法研究主要包括以下几个方面：1. 定向分化介导因子筛选：研究人员通过筛选和鉴定特定的介导因子，可以实现对干细胞定向分化的控制。
这些介导因子可以是细胞因子、生长因子或化合物等。
通过添加这些介导因子，可以促进干细胞向特定细胞类型定向分化。
组织干细胞的干性维持、分化控制和免疫调节研究
项目名称：组织干细胞的干性维持、分化控制和免疫调节研究一、研究内容1、组织干细胞静息和活化状态的转换及多潜能性研究研究干细胞静息和活化状态的转换，评价其分化的多潜能性，以认识组织干细胞的干性维持机制。
拟应用已知的可能的组织干细胞的标志，制备组织干细胞遗传标记小鼠模型或进行离体标记，以显微切割系统进行单细胞水平的分离，利用已建立的组织干细胞长期培养观察系统进行培养观察，借助SOLiD TM技术平台对组织干细胞进行单细胞表达谱分析，以识别和鉴定组织干细胞，识别静息和活化的组织干细胞的特征，发现不同状态下组织干细胞的特异性分子标志，掌握静息和活化状态转换的分子机制；研究免疫因子对组织干细胞干性维持的影响及其机制；通过比较不同阶段的多潜能干细胞和单潜能前体细胞的mRNA和蛋白质表达谱以及表观遗传学谱，确定组织干细胞在遗传及表观遗传方面的特性标志，分析维持组织干细胞多潜能性的遗传和表观遗传作用机制，揭示组织干细胞干性维持的规律。
2、组织干细胞分化启动和分化定向研究研究分化启动关键因子、抑分化因子和促分化因子平衡、免疫因子与分化的相关性、分化过程的阶段特性，以及异位再殖的分化特性。
拟采用活体组织中干细胞遗传标记及其谱系示踪模型小鼠，制备组织干细胞分化模型，在不同的时间点（即不同的分化阶段）直接从活体中采取标记细胞和组织标本，采用原位和离体的方法对组织干细胞分化活动的过程及其调控进行具有时空特性的综合研究，其中包括：组织干细胞分化进程中结构空间特性的认识、不同分化阶段特征的鉴别、分化启动和分化定向关键调控因子的鉴定。
在此基础上，也进行不同胚层来源的组织的组织干细胞之间的比较研究，以认识分化事件调控的基本规律。
3、组织干细胞分化的遗传及表观遗传调控机制研究研究与组织干细胞分化相关的关键因子的遗传和表观遗传调控机制，加深对组织干细胞分化调控基本规律的认识。
拟采用遗传学和表观遗传学研究体系，探讨已知的表观调控因子（包括组蛋白修饰分子、染色质重塑分子和microRNA）的生物学功能和作用机制；发现和鉴定新的表观遗传调控因子及其作用机制；研究免疫因子对组织干细胞分化的遗传及表观遗传调节的影响及其机制；运用生物信息学方法，整合不同层次的数据（mRNA、转录因子、microRNA和表观遗传调控相关分子），探索组织干细胞分化调控规律，为干预组织干细胞的分化提供依据。
第十六章 干细胞与组织维持和再生(唐霓)
七、干细胞微环境是干细胞维持自我 更新和分化潜能的重要场所
• 概念 集体出生以后，组织干细胞〔包括生殖 干细胞〕生活的特殊微环境称为干细胞微环境， 又称为干细胞巢〔stem cell niche〕。不同组织类 型的〝干细胞微环境〞的组成及定位不同。
〔一〕 干细胞需求特殊的微环境才干执行正常的生理功用
〔一〕 干细胞为器官移植和组织工程提供了重要的 细胞来源
〔二〕 有望确定疾病病因并对疾病的治疗提供新的 手腕
〔四〕 有助于挑选新药及树立新的模型系统
第二节 胚胎干细胞、组织干细胞和 生殖干细胞
一、 胚胎干细胞具有〝有限〞的增殖才干和多向分化潜 能
〔一〕 胚胎干细胞的分别、体外培育和鉴定
• 哺乳植物胚胎干细胞的分别培育技术的树立
2. 小肠干细胞的增殖与分化
• 小肠干细胞位于小肠隐窝底部，分散于潘氏细胞周 围，隐窝干细胞的数目约占0.4%～0.6%，每一个隐 窝大约包括了4～6个小肠干细胞。
• 小肠干细胞接受微环境中信号分子的调控，以确保 小肠行使正常的生物学功用。
• 小肠干细胞的主要生物学特征。
三、生殖干细胞维持了生物种代间的 延续性
〔三〕 干细胞微环境具有一些共同的结构与功用特点
• 干细胞微环境是由定位于组织内的一群特殊细胞 和细胞外支持结构组成
• 一些重要的信号分子辅佐干细胞定位于微环境 • 干细胞微环境可以发生多种外源信号分子，调控
干细胞分化及增殖 • 脊椎植物和哺乳植物干细胞微环境具有特定的结构
• 骨髓干细胞微环境
八、干细胞生物学研讨具有宽广的运用前景
成年肝干细胞位于Hering管区域内，直接参与肝脏 的生长和发育，同时也是肝细胞再生的重要细胞来 源。
2. 调控肝干细胞分化的重要信号分子
组织特异性干细胞的生物学特性及其分化机制研究
组织特异性干细胞的生物学特性及其分化机制研究组织特异性干细胞是指存在于生物体内，具有特定分化能力和自我更新能力，同时在特定组织或器官内具有特异性的细胞。
其发现和研究引领了生物学和医学领域的革新，对于治疗疾病和再生医学具有重要意义。
本文主要探讨组织特异性干细胞的生物学特性及其分化机制。
一、组织特异性干细胞的生物学特性1. 自我更新能力组织特异性干细胞具有自我更新能力，能够不断地分裂和生成同种类型的干细胞或分化成各种类型的细胞。
该能力使得其在个体发育、细胞再生和维持组织稳态方面起到了重要作用。
2. 分化潜能组织特异性干细胞也具有分化潜能，即能够分化成特定的细胞类型，如肌肉细胞、神经元、心脏细胞等。
这种能力决定了干细胞在组织修复和再生医学方面的巨大潜力。
3. 特定组织或器官内的分布组织特异性干细胞存在于特定的组织或器官内，如骨髓中的造血干细胞、神经系统中的神经干细胞、消化系统中的肠道干细胞等。
这种分布具有特异性，对于组织修复和再生医学的研究和应用具有重要意义。
二、组织特异性干细胞的分化机制1. 外部信号调节组织特异性干细胞分化主要受外部信号调节，包括生长因子、信号分子和细胞外基质等。
这些信号可通过激活干细胞表面的信号受体，启动多个信号转导通路。
信号转导通路主要涉及到细胞增殖、分化和细胞凋亡等方面，从而影响细胞的命运。
2. 内部调控组织特异性干细胞的分化还受到内部调控机制的影响。
内部调控机制包括基因转录因子、表观遗传学修饰和染色质结构等。
这些因素能够调节干细胞的基因表达程序，从而控制细胞分化。
3. 线粒体代谢和能量调节线粒体代谢和能量调节在组织特异性干细胞的分化中也扮演着重要角色。
线粒体代谢的改变能够影响干细胞的命运，如线粒体膜电位变化能够影响干细胞的自我更新和分化。
三、未来展望随着科学技术的不断进步，组织特异性干细胞在治疗疾病和再生医学方面的应用前景十分广阔。
越来越多的研究表明，组织特异性干细胞可以用于疾病的治疗、组织的修复和再生，并且具有更好的效果和更少的副作用。
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硕士学位论文组织特异性细胞外基质对体外培养hPDLSCs 干细胞特性的维持及体内分化的研究唐丽培 养 类 别全日制 学位类型 专业学位一级学科(专业类) 口腔医学二级学科(专业)口腔正畸学 研究方向 正畸牙周组织改建与牙周再生 指导教师 丁 寅 教授（主任医师） 培养单位 口腔医院正畸科二O 一四年五月分类号 R783.5 U D C 616.3 密级 公开第四军医大学The Fourth Military Medical University独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。
申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。
论文作者签名：日期：保护知识产权声明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。
本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。
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学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。
同意学校将论文加入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》和编入《中国知识资源总库》，同意按《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。
论文作者签名：导师签名：日期：目录缩略语表 (1)中文摘要 (3)英文摘要 (6)前言 (9)文献回顾 (11)正文 (19)第一部分人牙周膜干细胞的分离、培养、鉴定及组织特异性ECM的制备 (19)1材料 (19)1.1实验试剂 (19)1.2实验设备 (20)2方法： (20)2.1 hBMCs的原代培养 (20)2.2 hPDLCs的原代培养 (20)2.3 hPDLSCs的分离、培养与鉴定 (21)2.4分别制备hBMCs与hPDLCs组织特异性细胞外基质（ECM） (22)3结果 (23)3.1 hPDLCs原代培养 (23)3.2流式细胞仪对hPDLSCs的细胞表型鉴定 (23)3.3 hPDLSCs的克隆形成 (24)3.4 hPDLSCs的成骨和成脂分化能力 (24)3.5 ECM形态学观察结果 (25)4讨论 (26)第二部分组织特异性ECM对体外培养hPDLSC S干细胞特性的维持作用 (29)1材料 (29)1.1实验试剂 (29)1.2实验设备 (30)2方法 (30)2.1组织特异性ECM对于人牙周膜干细胞克隆形成的影响 (30)2.2组织特异性ECM对人牙周膜干细胞成骨分化的影响 (30)2.3组织特异性ECM对人牙周膜干细胞成脂分化的影响 (31)2.4 Real-time PCR检测人牙周膜干细胞成骨、成脂相关基因的表达 (31)2.5统计学方法 (32)3结果 (32)3.1两种组织特异性ECM对hPDLSCs克隆形成的影响 (32)3.2两种组织特异性ECM对于hPDLSCs成骨分化的影响 (35)3.3两种组织特异性ECM对于hPDLSCs成脂分化的影响 (38)4讨论 (39)第三部分组织特异性ECM复合hPDLSC S在裸鼠体内的生长与分化研究 (42)1材料 (42)1.1主要试剂 (42)1. 2主要仪器 (42)1.3生物支架 (43)1.4动物 (43)2方法 (43)2.1制备ECM (43)2.2实验分组 (43)2.3牙周膜干细胞移植复合物的制备 (43)2.4裸鼠体内移植 (43)2.5取材并制备标本与染色 (44)3结果 (44)3.1 hPDLCs-ECM培养的hPDLSCs在裸鼠体内的生长与分化 (44)3.2 hBMCs-ECM培养的hPDLSCs在裸鼠体内的生长与分化 (46)4讨论 (48)小结 (51)参考文献 (52)个人简历和研究成果 (60)致谢 (61)临床病例报告 (63)缩略语表缩略词英文全称中文全称hBMCs Human Bone marrow cells 人骨髓细胞hPDLCs Human Periodontal ligament cells 人牙周膜细胞hPDLSCs Human Periodontal ligament stem cells 人牙周膜干细胞ECM Extracellularmatrix 细胞外基质COL-I type I collagen I 型胶原PBS phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲液DMSO dimethylsulfoxide 二甲基亚砜α-MEM Alpha modified Essential medium α-MEM 培养基SEM Scanning electron microscopy 扫描电镜CFU-F colony forming units-fibroblast 成纤维细胞集落形成单位FCM flowcytometry 流式细胞术OD opticaldensity 吸光度FBS Fetal bovine serum 胎牛血清ALP Alkalinephosphatase 碱性磷酸酶BMMSCs Bone marrow mesenchymal stem cells 骨髓间充质干细胞HE hemotoxylin and eosin 伊红和苏木精PDL Periodontal ligament 牙周膜CT Connectivetissue 结缔组织mineral 骨粉BM BoneBMPs bone morphogenic proteins 骨形成蛋白OCN osteocalcin 骨钙素RUNX2Runt-related transcription factor 2 侏儒相关转录因子组织特异性细胞外基质对体外培养hPDLSCs干细胞特性的维持及体内分化的研究硕士研究生：唐丽导师：丁寅教授第四军医大学口腔医院医院正畸科西安 710032资助基金项目：2011年国家自然科学基金青年科学基金项目(81100750)中文摘要牙周炎是人类古老而普遍存在的疾病之一，牙周炎的基本病理变化是由细菌感染引起的牙周组织局部的炎症，随着炎症的进展，牙周组织逐渐丧失附着，牙槽骨进行性吸收，造成牙齿松动。
现有的治疗方法都有各自的局限性，无法实现理想的牙周再生。
近年来，干细胞和再生医学的蓬勃发展为牙周炎的治疗带来了曙光，一般认为，牙周组织再生的基础是来自于牙周膜干细胞的扩增和多向分化能力，而干细胞的增殖、分化受到多种因素的影响，在炎症状态下其增殖和多向分化能力均受到显著抑制，因此，改善牙周膜干细胞的炎症微环境，使得牙周膜干细胞大量扩增并多向分化是获得牙周再生的关键。
细胞外基质（ECM）是蛋白和多糖连接而成的网状支架，通过多条途径控制着干细胞的命运，且有研究表明脱细胞的骨髓细胞ECM 对骨髓间充质干细胞体外扩增的干性保持以及多向分化具有重要的促进作用，而ECM对牙周干细胞的影响研究甚少。
本课题采用脱细胞技术获得牙周膜细胞和骨髓细胞两种ECM，模拟牙周膜干细胞的体内微环境，以实现在体外多次扩增传代的条件下牙周膜干细胞依然能够保持良好的干细胞特性，获得大量高质量的牙周膜干细胞用于基础研究；通过组织特异性ECM对牙周膜干细胞的培养，与骨粉结合植入裸鼠体内，观察牙周再生情况，为临床应用提供一定的理论依据。
研究内容：（1）组织特异性ECM（hPDLCs-ECM和hBMCs-ECM）的制备。
（2）研究组织特异性ECM（hPDLCs-ECM和hBMCs-ECM）对体外培养人牙周膜干细胞（hPDLSCs）的生物学特性的影响。
（3）研究组织特异性ECM（hPDLCs-ECM和hBMCs-ECM）培养人牙周膜干细胞（hPDLSCs）后，观察其在裸鼠体内的生长与分化。
研究方法：（1）利用有限稀释克隆法从牙周膜细胞（hPDLCs）中分离纯化人牙周膜干细胞（hPDLSCs），通过检测克隆形成、表面分子标志以及多向诱导分化实验鉴定hPDLSCs。
脱细胞处理人牙周膜细胞（hPDLCs）和人骨髓细胞（hBMCs）以制备组织特异性ECM。
（2）利用克隆形成实验检测两种组织特异性ECM对于体外培养hPDLSCs克隆形成的影响，利用成骨成脂诱导实验检测两种组织特异性ECM对体外培养hPDLSCs 成骨与成脂的影响，以反映ECM对hPDLSCs干细胞特性的影响。
（3）将hPDLSCs与骨髓细胞ECM和牙周膜细胞ECM共培养，结合无机牛骨粉植入裸鼠皮下，8周后取材进行HE染色、Masson三色染色、苦味酸-天狼猩红以及免疫组织化学染色观察新生成的组织。
研究结果：（1）通过有限稀释法获得的hPDLSCs，具有克隆形成能力，表达间充质干细胞标志，并具有多向分化能力。
光学显微镜下，脱细胞处理之后，无细胞结构存在，ECM呈网状膜片。
（2）接种在两种组织特异性ECM上的hPDLSCs的克隆形成率均明显高于对照组，经过多次传代之后，ECM中培养的hPDLSCs仍保持较高的克隆形成能力。
接种在两种组织特异性ECM上的hPDLSCs多次传代之后的成骨成脂分化能力也明显高于对照组。
（3）hPDLSCs和hBMCs-ECM、hPDLCs-ECM共培养后与无机牛骨粉混合，植入裸鼠皮下，在hBMCs-ECM组生成了类似骨质和牙周膜纤维样结构，hPDLCs-ECM 组生成牙周膜样纤维，含大量的Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原，对照组仅有疏松的纤维结缔组织生成，主要为Ⅰ型胶原。
结论:（1）通过有效的脱细胞处理方法可以制得结构完整和具有良好生物学功能的ECM（hPDLCs-ECM和hBMCs-ECM）。
（2）组织特异性ECM（hPDLCs-ECM和hBMCs-ECM）对体外培养人牙周膜干细胞（hPDLSCs）维持干细胞特性有显著的促进作用，hPDLSCs经体外多次传代扩增后仍保持较高的自我更新和多向分化的能力。
（3）组织特异性ECM能够促使hPDLSCs在体内生成类骨质和牙周膜样纤维结构，体现出良好的牙周组织再生能力。
关键词：细胞外基质；牙周膜干细胞；微环境；牙周再生The Effect of Tissue-Specific Extracellular Matrix on the Maintenance in vitro and Differentiation in vivo of Human Periodonatal Ligament Stem CellsCandidate for master:Tang LiSupervisor:Prof. Ding YinDepartment of orthodontics, School of Stomatology, Fourth Military Medical University,Xi’an 710032, ChinaSponsored Programs:2011 China Youth Science Foundation of National Natural ScienceFoundation (81100750)AbstractPeriodontitis is one of the most common diseases with a long history, which mainly caused by bacterial infection. With the inflammation worsening, periodontitis irreversibly leads to attachment loss and loosening of tooth. Current clinical approaches to inhibit osteoclast-induced bone absorption are proved to poor effect. In recent years, as the development of regenerative medicine, Stem Cell Technology may offer an effective strategy to prevent attachment loss and loosening of tooth. It is generally recognized that the periodontal tissue regeneration based on the self renew as well as multipotentiality of periodontal ligament stem cells. Under inflammatory microenvironment, the potential of proliferation and differentiation of periodontal ligament stem cells was significantly inhibited. Therefore, controlling the microenvironment to accelerate the amplification and multilineage differentiation of periodontal ligament stem cells may be crucial to periodontal tissue regeneration. As a major component of microenvironment, extracellular matrix (ECM) surrounding cells involve in the maintenance and multilineagedifferentiation of stem cells. In the present study, we firstly prepared intact periodontal ligament cells-derived and bone marrow cells-derived extracellular matrix by adopting the acellular technology, and then evaluate the effect of the two tissue-specific extracellular matrix on the maintenance and differentiation of human periodonatal ligament stem cells, aiming to shed a light on the clinical therapy of periodontitis.Content:1.To prepare two kinds of tissue-specific extracellular matrix, periodontal ligament cells-derived and bone marrow cells-derived extracellular matrix.2.To assess the effect of tissue-specific extracellular matrix on the biological characteristics of cultured periodontal ligament stem cells in vitro.3.To observe the growth and differentiation of human periodontal ligament stem cells in nude mice after being cultured on tissue-specific extracellular matrix.Methods:1.Tissue-specific extracellular matrix was derived from primary cultured human periodontal ligament cells and bone marrow cells by removing cells separately. Limited dilution cloning was performed to obtain human periodonatal ligament stem cells from human periodontal ligament cells. Furthermore, the proliferation and differentiation of human periodonatal ligament stem cells as well as the surface markers were detected.2.The cloning formation was applied to evaluate the effect of tissue-specific extracellular matrix on the maintenance of hPDLSCs in vitro. The induce effect of extracellular matrix on osteogenic and adipogenic differentiation of stem cells were also evaluated in vitro.3.The hPDLSCs and ECM were co-cultured, combined with inorganic bovine bone, and then transplanted subcutaneously into nude mice. 8 weeks later, the animals were sacrificed and HE staining, Masson trichrome staining and immunohistochemical staining were performed.Results:1.The hPDLSCs we achieved have the potential of proliferation and differentiation.And the surface markers were in consistent with mesenchymal stem cells. After cell removal, ECM displayed like a reticular membrane under the optical microscope.paring to control, both hPDLCs-ECM and hBMCs-ECM significantly promote the formation of hPDLSCs cloning. And the positive effect preserved after cell passage for several times. Besides, the potential of osteogenic and adipogenic differentiation were also improved by tissue-specific extracellular matrix.3.After the mixture of hPDLSCs, hBMCs-ECM and inorganic bovine bone transplanted into the nude mice, more bone / periodontal ligament-like structure were produced comparing to control which had only given rise to some connective tissue. Not as the control group, the mixture of hPDLSCs and hPDLCs-ECM could generate more collagen III in nude mice.Conclusion:1.The present acellular method was valid to prepare fine hPDLCs-ECM and hBMCs-ECM.2.Tissue-specific extracellular matrix, hPDLCs-ECM and hBMCs-ECM could promote the maintenance and multi-directional differentiation in vitro.3.Tissue-specific extracellular matrix could promote the hPDLSCs to generate bone/periodontal ligament-like structure which was beneficial to the reconstruction of periodontal.Key words：extracellular matrix; periodontal ligament stem cells; microenvironment;periodontal regeneration前言细胞外基质是天然组织或器官脱细胞处理所得的生物支架材料，早期细胞外基质仅仅被认为是细胞的支持结构，为细胞提供营养、水分以及缓冲外界应力的作用。