骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记(一)
mdx鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及向肌细胞的诱导分化
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丹酚酸B体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究
诱 导分 化为心肌样细胞 。但 ５一ａａ作为抗肿瘤药 物具 有一定的 ２ 方 法 ｚ 毒副作用 ， 寻找 安全 、 故 有效 的诱 导剂 应是 目前 的重 要课 题 。我 ２ １ ＭＳ ｓ ． Ｃ 的分 离培养 将大 鼠脱颈处死 ， 无菌条件下取 双侧股
们前期的研究结果表 明 Ｓｌ ａＢ可 以减 小心肌 梗塞 的面积 ， 并能 骨 、 骨 ， 胫 适量 Ｄ—Ｈ ｎ ￣液冲洗骨髓 ，０ ａｋ １０目筛 网过滤 ， 密度为 将 有效地促进梗塞灶 内成纤维细 胞 的增 生 ， 速心脏 的修复 过程。 １０ ３／ ｌ Ｐ ｒ ｌ预 先 置 于 试 管 的 底 部 ， 后 按 照 １ １的 比 加 ．７ ｇｍ 的 ｅｃ ｌ ｏ 然 ：
分化为心肌样细胞 的研究 。现将研究结果报道如下 ｎ 后接种 于完全培养 液 （ １ ％胎 牛血清 、０ ／ ／ ｉ， ｉ） ａ 含 ０ １０ｍｇＬ 青 霉素 、０ ／ １０ｍｇＬ链霉素 的 Ｌ—Ｄ Ｍ 培养液 ） 置 于 ３ ５ ＭＥ ， ７Ｃ、％ ９
那么 ， 对有 心肌分化 潜能的 ＭＳ ｓ 什么作用 呢？为进一 步研 例沿管壁缓慢滴加骨髓悬液 ， 它 Ｃ起 ・ 离心（ ０ ／ ｉ，０ ｍｎ ， １８０ｒｍｎ ２ ｉ） 收获位 究其机制 ， 我们进 行了中药单 体丹 酚酸 Ｂ Ｓｌ 体 外诱 导 ＭＳ ｓ 于界面层灰 白色 的单个核细胞 ， Ｌ—Ｄ Ｅ （ａ Ｂ） Ｃ 用 Ｍ Ｍ离心洗涤 ２次（ ０ ８０
向心 肌 细 胞 分 化 的 能 力 。
关键 词 ： 丹酚酸 Ｂ 骨髓间充质干细胞； 体外诱导； 免疫细胞化学； 实时荧光定量 Ｒ — Ｃ ； Ｔ ＰＲ
中图分类 号 ：９２ Ｒ ７
文 献标 识码 ： Ａ
文章编 号 ：０８００ （０ ８ ０ －５４０ １０ —８５ ２ ０ ）３０７ －３
兔骨髓间充质干细胞来源的心肌(样)细胞的诱导分化研究
死模型 。实验动物 随机分两组 ： 实验组 （ ｎ＝１ ） ０ 在心梗 区域注人经诱导后的 ＭＳ ｓ对照组 （ １ ） Ｃ； ｎ＝ ０ 在心
梗 区域注人不含 ＭＳ ｓ的培养液 。移植 ４周后 ， Ｃ 进行病 理标本 观察 和免 疫组化检 测。结果
Ｃ Ｎ ｉ ｉｇ， ＸＩ Ｊａ — ｎ ＨＥ Ｌ— ｎ ｘ ＡＯ ｉｎｍｉｇ， Ｓ Ｎ ｉ —ｕ Ｕ Ｊｎｈ ａ， ＮＩ Ｊ ｎ， Ｃ Ｉ Ｈｏ ｇ ｙ ｈ Ｚ ＮＧ Ｍｉ ， Ｃ Ｅ ｕ Ａ ｎ —ａ 。 ＨＡ ｎ ＡＯ
Ｊｎ — ｎ ．Ｄ ｐ．ｏ ａｄｏ ｇ 。Ｔ ｅＦ ｉ ｍｉ ｇ ｇ ｅｔ ｆ Ｃ ｒｉｏ ｙ ｈ ￡Ａ ｌ ｔ ｏｐｔｌｏ ｕ ｍｉｇ Ｍｅｉ ｌＣ ｌｇ 。Ｋ ｎ ｎ ｌ ｆ ｉ ｅ Ｈ ｓｉ Ｋ ｎ ｎ ｄｃ ｏ ｅｅ ｕ ｍｉｇ ｉ ｆ ａｄ ａｆ ａ ｌ
维普资讯
中国微循环 ２ ０ ０７年 ８ 月第 １ 卷第 ４期 １
文章编号 ：０ ７８ ６ （０ ７ ０ －２ ５０ １０ — ８ ２０ ）４０ ３ －５ ５
・
２ ５・ ３
实验 研 究 ・
兔骨髓问充质干细胞来源的 心肌 （ ） 样 细胞 的诱导分化研究
ｌ ｔ ｏｅｅｄ ｔ ｒ ｒ ｓＬ Ｄ ｆ ０ｒ ｂｔ ｈ ｅｅｒ ｂｔｗ ｒ ｎｏ ｌ ｄ ｉｅ ｔ ｔｏｇ ｕ ｓ ｔｅｅ－ ｅ ａ ｅ ｄｅｎ ａ ｔ ｉ （ Ａ ）ｏ ｉ ．Ｔ ｓ ｉ ｅｅ ａｄｍ ｙ ｉ ｄｄｉ ｏ ｗ ｏ ｐ： ｈ ｘ ｔ ｆｎ ｒ ｎ ａ ｅｅ ２ ａ ｓ ｂ ｂ ａ ｓ ｒ ｖ ｎ ｒ ｐｒ ｅｔ ｎ（ ｅ ｍ ｎ ｏｅｎ＝１）ａｄｔ ｏｔ ｌ ｎ（ ｉ ０ ｎ ｅｃｎ ｏ ｏｅ ｎ＝１） Ｓ ｓｉ ｕｅ ｅｅｌ ｅｅ ｉ ６ｄ ｄｎ－一ｈｎｌ — ｈ ｒ ０ ．Ｍ Ｃ ｄ ｃｄｗ ｒ ａ ｌｄｗｔ ４ 一ｉ ｉ ｏ２ｐ ｅｙ ｎ ｎ ｂ ｈ ｉ ｍ ｉ ｄｎ Ｄ Ｐ）ａｄａｔ ｅｏ ｓ ａｓｌｎｅ ｔ ｍ ｏａ ｉ ｆ ｃ ｏ ｅｅｐｒ ｎ ｒｕ ．Ｎ ｎｃｌｃ — ｏｅ（ Ａ Ｉ ｎ ｕ ｇｎｕｌ ｔ ｐａｔ ｉ ｏ ｙ ｒ ａ ｉ ａ ｔ ｎｉ ｔ ｘｅ ｍｅｔ ｏｐ ｏ—ｅ ｕ ｏ ｙｒ ｎ ｄ ｎ ｃ ｄ ｅ ｎ ｒｉ ｎ ｈ ｉ ｇ ｌｌ
诱导MSCs转分化为视网膜神经样细胞的应用
诱导M SC s转分化为视网膜神经样细胞的应用诱导MSCs转分化为视网膜神经样细胞的应用福建医科大学附属第一医院,福建省眼科研究所白月徐国兴庄华谢茂松郭健王婷婷[摘要]近年来，人们研究发现骨髓间充质干细胞（m esenchym al s t emcel l s,M SC s）在体外可经生长因子诱导，抗氧化剂诱导，中药诱导，增加细胞内cA M P等不同途径的诱导方法，分化为神经外胚层来源的神经元及神经胶质细胞，因此一些研究者尝试以上诱导途径使M SC s分化为视网膜神经样细胞，用于体内相关疾病的细胞替代治疗，为多种疾病带来了新的治疗思路。
[关键词]骨髓间充质干细胞体外诱导视网膜神经样细胞胚胎干细胞具有发育全能性，理论上可诱导分化为机体所需的任何组织或器官，但涉及伦理学问题，以往受到很大限制，发展缓慢。
应用眼色素上皮缘的视网膜干细胞[1]及鼠脑神经先祖细胞移植[2]也由于供体组织有限性及安全性问题，不利于治疗视网膜疾病的开展。
于是有人把目光投向成体干细胞中的MSCs，成年动物骨髓有2类干细胞群：造血干细胞和间充质干细胞。
最初因其容易贴壁呈成纤维细胞样克隆生长，被称为成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）[3],后来研究发现它是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具支持和调控造血的作用，且具有多向分化潜能，故又称其为间充质干细胞[4]。
也称为骨髓基质细胞[5]。
MSCs的特点为:①来源于中胚层，可以跨系统甚至跨胚层分化为3个胚层来源的细胞，特别是中胚层和神经外胚层来源组织的细胞（视网膜来源于胚胎期神经外胚层），并且经过20~30次细胞分裂后，这种分化特性也不会消失[6]。
②分离培养方便。
③由于不表达T细胞识别的细胞表面标志，植入后不会发生免疫排斥反应。
④易于转染和稳定高效表达外源基因优点[7],因此可把利于定向分化的生长因子基因转入MSCs，促使其定向分化。
MSC的纯化方法有贴壁筛选法，流式细胞仪分选法，密度梯度离心法，免疫磁珠法。
体外培养鼠骨髓间充质干细胞及其向心肌样细胞诱导分化的实验研究
法分 离培养的 ＭＳ ｓ生长稳 定 ， 殖较 快。经 ５氮胞苷诱 导后 ， Ｃ 形 态发 生变化 ， Ｃ 增 一 ＭＳ ｓ 可见肌管样结构 。免疫组化 和 Ｒ －Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ证 实
采用贴壁 筛选 法 ， 简便 易行 ， 短期 内可获得 大量的纯度较 高的骨髓 间充质
干细胞 ； ５ 氮胞苷的诱导 下， 在 ． 骨髓间充质干细胞呈现 向心肌样 细胞 分化的趋势 。
和 ５氮胞苷效能 。方法 ．
线 ， 用流 式 细胞 仪 技 术检 测 Ｃ３９ Ｃ ４ 并 １ 、 Ｄ ５的 表 达 ， 行 细 胞 成 分 鉴 定 。 用 ５ 氮胞 苷 体 外 诱 导 ＭＳ ｓ观 察 其 形 态 结 构 。 用免 疫 组 ２ 进 一 Ｃ，
化检测肌钙蛋 白 Ｔ ｃ ｎ ） 结蛋 白（ ｅｍｎ ， Ｒ －Ｃ （Ｔ Ｔ 、 Ｄ ｓ ｉ） 用 ＴＰ Ｒ检 测心肌特异 因子基 因 Ｂ肌球蛋 白重链 （ － Ｃ 的表 达。结果 － ＢＭＨ ） ＭＳ ｓ Ｃ 经体外诱导发 生了向心肌样 细胞 的分化。结论
华
（ 中山大学第二附属 医院心胸外 科 ， 州市 广
【 摘要 】 目的
通过体外培养骨髓 间充质干细胞 （ Ｓ ｓ ， 用５ 氮胞苷诱 导其向心肌样细胞 分化 ， 究 Ｍ Ｃ 生物 学特 性 Ｍ Ｃ ）并 一 研 Ｓｓ
体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化的研究进展
32中西医结合心血管病杂志Cardiovascular Disease Journal of integrated traditionalChinese and Western Medicine2017 年 9月 C 第 5 卷第 27 期Sep. C 2017 V ol. 5 No. 27体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经干细胞分化的研究进展杜佳蕾，张曦元，万 娜，葛 斌，李 璐*（长春中医药大学，吉林长春 130117）【摘要】骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一类多潜能细胞，在适当的条件下，能够通过诱导分化成为神经干细胞，在治疗神经系统方面的疾病具有良好的临床应用前景。
本文对BMSCs体外分离培养方法、诱导方法及治疗神经系统疾病的临床应用进行了综述。
【关键词】骨髓间充质干细胞；分离培养；诱导分化；临床应用；神经干细胞【中图分类号】R617 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-6681.2017.27.32.02间充质干细胞（MSCs）具有自我复制能力属于多潜能细胞，主要存在于骨髓、脂肪、脐带、粘膜、肌肉、肺、肝、骨骼、胎盘、胰腺等，它在适宜条件下经过诱导可以向骨、脂肪、软骨等多种组织细胞分化。
而BMSCs属于间充质干细胞中的一种，因其自身具有取材对机体的损伤小，容易在体外进行分离、培养和扩增，回植体内后不会发生免疫排斥反应等特点而备受关注。
本文将从BMSCs 的分离培养、诱导BMSCs向神经干细胞分化的方法以及BMSCs对神经系统疾病治疗这三个方面加以介绍。
1骨髓间充质干细胞的的分离与培养将体外培养的BMSCs放置于倒置相差显微镜下观察，可以看到大多数的细胞呈梭形、纺锤形，少数形态表现为多角形，细胞核比较大，相邻的细胞之间有缝隙进行连接。
随着对BMSCs研究的不断深入，现在研究建立的用于分离提取BMSCs的方法有很多，比如贴壁细胞分离培养法、密度梯度离心法还有免疫磁珠法、流式细胞仪法等，但是其不同的培养方法所取得的效果不同。
人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达
人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达目的：系统研究人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。
方法：应用密度梯度离心法分离hBMSCs，取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定；应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。
结果：第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90，具有成脂和成骨分化潜能。
成骨相关基因在诱导早期部分表达，中期均有表达，基因表达大部分在14天达高峰，与矿化相关的基因表达在21天达高峰。
结论：hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达，其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。
Abstracts:ObjectiveTo investigate the osteogenic related genes expression during in vitro osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells (hBMSCs).MethodshBMSCs were isolated by density gradient centrifugation. Surface markers and cell cycle were analyzed by flow cytometry. The multiple differentiation potential of hBMSCs were identified using in vitro osteogenic and adipogenic induction. The osteogenic related genes expression of hBMSCs at different induction time point were evaluated by semiquantitative RT-PCR analysis.ResultsThe hBMSCs were derived from bone marrow and expressed CD44 and CD90, markers of mesenchymal stem cell. The second passage of hBMSCs showed adipogenic and osteogenic differentiation potential. During the osteogenic induction process,hBMSCs expressed part of osteogenic related genes in early stage, and all of them in middle stage.The peak expression of most of genes were on the 14th day, and the mineralization associated genes on the 21st day. ConclusionsThe osteogenic related gene expression of hBMSCs shows a dynamic progress during in vitro osteogenic induction, which is consistent with in vivo development of osteoblast.Key words:hBMSCs;in vitro differentiation;osteogenic genes;expression pattern骨缺损的修补和重建是修复重建外科临床面临的常见问题。
成人骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化为神经元样细胞的研究
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骨髓间充质干细胞体外诱导分化与标记(一)
作者：吴晓林,李冬民,马德茂,张晓田,黄石,宋天保
【关键词】骨髓
【Abstract】AIM:Tostudythedifferentiationcharacteristicsandtheoptimaldosageandtimingforbromodeoxyuridi ne(Brdu)labelingofratbonemarrowderivedmesenchymalstemcells(MSCs)invitro.METHODS:Therat marrowstemcellsisolatedbyusingPercoll(1.073kg/L)wereculturedandproliferated.Thethirdpassage cellswereinducedwithdexamethasome,βglycerophosphate,ascorbicacid2phosphate,IGF1andinsuli n.Onday21,thecellswereanalyzedbyimmunohistochemistryfortypeⅠcollagenandbyhistochemistry foralkalinephosphatase(AKP).ThepurifiedMSCswereincubatedwithBrduatdifferentconcentrations( 5,10and15μmol/L)fordifferenttimeperiods(12，24，48，72and96h),followedbyimmunohistochemistryforBrdutoidentifytheoptimalBrduconcentrationandi ncubationtimeperiod.RESULTS:Afterincubationfor21dforinduceddifferentiationintoosteoblasts,ty peⅠcollagenandAKPwerepositivelyexpressed.Theincubationwith10μmol/LBrdufor72hachievedov er98%ofthelabelingratewithoutproducingobviouscelldamages.CONCLUSION:MSCscanbeinducedt odifferentiateintoosteoblastsundercertainconditionsinvitro.TheoptimalBrdulabelingconcentration andtimeperiodare10μmol/Land72h,respectively.
【Keywords】MSCs;induceddifferentiation;osteoblast;Brdu
【摘要】目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在体外的诱导分化及5溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)标记MSCs的可行性.方法：利用密度为1.073kg/L的percoll分离骨髓的单个核细胞，体外培养与扩增MSCs；取生长良好的第3代细胞，用成骨细胞分化培养液培养21d，Ⅰ型胶原免疫组化染色和碱性磷酸酶（AKP）组化染色；分别以浓度为5，10和15μmol/L的Brdu溶液标记MSCs，孵育12，24，48，72和96h后免疫组化检测Brdu，确定最佳标记量和最佳标记时间.结果：诱导分化第21日,AKP染色呈强阳色,Ⅰ型胶原免疫染色呈阳性.10μmol/LBrdu 标记MSCs的效果最好，随着孵育时间的延长，Brdu标记率逐渐增高，标记72h后标记率在90%以上.结论：MSCs在体外一定条件下可定向诱导分化为成骨细胞，用Brdu标记MSCs的最佳浓度为10μmol/L，最佳时间是72h.
【关键词】骨髓间充质干细胞；诱导分化；成骨细胞；5溴脱氧尿嘧啶核苷
0引言
骨髓间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞.因MSCs取材方便、对机体的损伤小、具有较强的传代增殖能力和免疫耐受性等特点而受到越来越多的关注.本实验的目的是利用MSCs具有分化潜能的特点，在体外诱导该细胞定向分化为成骨细胞.并用Brdu标记连续传代的MSCs，观察最佳标记时间及标记剂量，从而为追踪Brdu标记的MSCs移植入体内后的存活、生长及分化奠定基础.
1材料和方法
1.1材料健康雄性SD大鼠，体质量55～70g.由西安交通大学医学院实验动物中心提供.
1.2方法
1.2.1大鼠骨髓MSCs的体外分离培养将大鼠引颈处死后置于750mL/L乙醇浸泡约5min，无菌条件下分离出大鼠的股骨和胫骨.用PBS冲洗出骨髓细胞，经5mL针管反复吹打制成单细胞悬液，用200目的不锈钢网过滤，收集滤液.在密度为1.073kg/L的percoll（Phamacia）分离液上缓慢加入收集的滤液，2500r/min离心20min，收集滤液与分离液之间的白膜层细胞，用DMEM（Gibco）洗涤两次，1000r/min离心5min.用加有100mL/L胎牛血清（杭州四季青公司）的DMEM重悬细胞，1×108个/L种于两个直径为6cm的培养皿中培养，2d后更换培养液，加入完全培养基.并将吸出的旧培养液分别移入另两个平皿中继续培养，再过2d更换
成完全培养基.以后每3～4d换液1次，弃去没有贴壁的悬浮细胞.待细胞生长融合到约80%，用0.2g/LEDTA和2.5g/L胰蛋白酶（宝信公司）消化，1∶2传代培养.
1.2.2传代后大鼠MSCs向成骨细胞的分化胰酶消化生长良好的第3代（P3）细胞，以1×107个/L密度种于6cm培养皿中，平皿中预先加入0.5cm×1.0cm无菌盖玻片.待细胞长到约80%融合后，加入含200mL/L胎牛血清的DMEM诱导24h，弃去.加入诱导液，其中含0.1μmol/L 地塞米松、50μmmol/L维生素C,10μmmol/Lβ甘油磷酸钠、IGF1（Chemikon）,胰岛素和100mL/L 胎牛血清.同时，设立正常对照组，只加入含100mL/L胎牛血清的培养基，其余均不加.分别诱导7，14和21d.取出盖玻片，PBS冲洗，40g/L多聚甲醛固定15min.然后应用抗Ⅰ型胶原mAb（Sigma）和ABC法（ABC试剂盒购于北京中杉公司）进行Ⅰ型胶原免疫组织化学染色.加入诱导液组，以PBS和正常鼠血清分别替代一抗作为阴性对照；应用组织化学钙钴法显示碱性磷酸酶（AKP），以不加底物β甘油磷酸钠的孵育液作为阴性对照.
1.2.3Brdu标记MSCs消化P3细胞，以0.5×108个/L将MSCs接种于12孔培养皿，在将要加入Brdu的培养皿中预先放入无菌盖玻片.当细胞铺满皿底40%时加入Brdu（Sigma）溶液，使其终浓度分别为5，10和15μmol/L.孵育12，24，48，72和96h后取出盖玻片，用PBS 冲洗，40g/L多聚甲醛固定15min，应用抗BrdumAb（Sigma）和ABC法进行免疫组织化学染色显示Brdu，除在正常血清封闭前以2mol/L盐酸变性30min外，其余均按试剂盒说明书进行操作.以PBS和正常鼠血清分别替代一抗作为阴性对照.另外，将用10μmol/LBrdu标记的MSCs进行传代培养，观察细胞传代后的标记效果.。