四间充质干细胞的培养及鉴定一
cxcr2基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞的构建与鉴定
基金项目:国家自然科学基金项目(８１８７１６９７)作者简介:张莉(１９９１－)ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎬ主要研究重症机制及防治研究ꎮ通信作者:雷迎峰ꎬ副教授ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｙｆｌｅｉ＠ｆｍｍｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎻ侯立朝ꎬ博士生导师ꎬ教授ꎬＥ￣ｍａｉｌ:４５２７８４３６＠ｑｑ.ｃｏｍ 论㊀著ｃｘｃｒ２基因修饰小鼠骨髓间充质干细胞的构建与鉴定张莉１ꎬ刘永飞２ꎬ叶传涛３ꎬ边培育３ꎬ雷迎峰４ꎬ侯立朝１１.空军军医大学西京医院麻醉与围术期医学科ꎬ陕西西安７１００３２２.空军军医大学唐都医院麻醉科ꎬ陕西西安７１００３８３.空军军医大学唐都医院传染科ꎬ陕西西安７１００３８４.空军军医大学微生物学教研室ꎬ陕西西安７１００３２摘要:目的㊀构建小鼠ＣＸＣ型趋化因子受体２(ＣＸＣＲ２)基因ｃｘｃｒ２过表达的骨髓间充质干细胞(Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓ￣ｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌꎬＢＭＳＣ)并进行鉴定ꎮ方法㊀全骨髓贴壁法分离培养小鼠ＢＭＳＣꎬ采用流式细胞术检测干细胞抗原１(ｓｔｅｍｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎ￣１ꎬＳＣＡ￣１)㊁ＣＤ４４㊁ＣＤ４３㊁ＣＤ４５㊁ＩＡ/ＩＥ表达率ꎬ并诱导成骨分化ꎮ以含有小鼠ｃｘｃｒ２的质粒为模版进行ＰＣＲ扩增ꎬ将获得的ｃｘｃｒ２克隆到慢病毒载体ꎬ命名为ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎻ将其与慢病毒包装质粒共转染ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞ꎬ收获慢病毒后ꎬ通过离心法感染ＢＭＳＣꎬ经过１μｇ/ｍＬｚｅｏｃｉｎ压力选择建立了稳定表达ＣＸＣＲ２的小鼠ＢＭＳＣ(ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ)ꎮ采用流式细胞术和ＲＴ￣ＰＣＲ分别检测其ＣＸＣＲ２蛋白和ｍＲＮＡ表达水平ꎬＴｒａｎｓｗｅｌｌ趋化实验检测其迁移能力ꎮ结果㊀９０％以上的第３代ＢＭＳＣ表达ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１ꎬ几乎不表达ＩＡ/ＩＥ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５ꎬ且成功诱导成骨分化ꎮ菌液ＰＣＲ㊁质粒双酶切后ꎬ琼脂糖凝胶电泳鉴定结果得到特异㊁大小正确的条带及测序鉴定正确ꎬ表明成功构建了ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ表达质粒ꎮ流式细胞术和ＲＴ￣ＰＣＲ结果显示ꎬＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ的ＣＸＣＲ２蛋白和ｍＲＮＡ表达水平均明显高于对照组ＢＭＳＣꎬ差异有统计学意义(Ｐ<０.００１)ꎮＴｒａｎｓｗｅｌｌ结果显示ꎬＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ迁移能力高于对照组ＢＭＳＣꎬ差异有统计学意义(Ｐ<０.０１)ꎮ结论㊀利用慢病毒系统成功构建了稳定表达ＣＸＣＲ２的ＢＭ￣ＳＣꎬｃｘｃｒ２基因修饰ＢＭＳＣ后可明显增加ＢＭＳＣ的迁移能力ꎮ关键字:ＣＸＣ型趋化因子受体２ꎻ小鼠ꎻ骨髓间充质干细胞ꎻ细胞迁移中图分类号:Ｒ７８文献标志码:Ａ文章编号:１００５￣５６７３(２０１９)０１￣００１９￣０７ＤＯＩ:１０.１３３０９/ｊ.ｃｎｋｉ.ｐｍｉ.２０１９.０１.００４Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｘｃｒ２ｇｅｎｅｉｎｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓＺＨＡＮＧＬｉ∗ꎬＬＩＵＹｏｎｇ￣ｆｅｉꎬＹＥＣｈｕａｎ￣ｔａｏꎬＢｉａｎＰｅｉ￣ｙｕꎬＬＥＩＹｉｎｇ￣ｆｅｎｇꎬＨＯＵＬｉ￣ｃｈａｏ∗ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＡｎｅｓｔｈｅｓｉｏｌｏｇｙꎬＸｉｊｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌꎬＡｉｒＦｏｒｃｅＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＸｉ'ａｎ７１００３２ꎬＳｈａａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅꎬＣｈｉｎａＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ:ＬＥＩＹｉｎｇ￣ｆｅｎｇꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｙｆｌｅｉ＠ｆｍｍｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎻＨＯＵＬｉ￣ｃｈａｏꎬＥ￣ｍａｉｌ:４５２７８４３６＠ｑｑ.ｃｏｍＡｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(ＢＭＳＣ)ｗｉｔｈｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｏｕｓｅｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｃｘｃｒ２ｇｅｎｅ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＢＭＳＣｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｗｈｏｌｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｄｈｅｒｅｎｔｍｅｔｈ￣ｏｄꎬａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒａｔｅｓｏｆｓｔｅｍｃｅｌｌａｎｔｉｇｅｎ１(ＳＣＡ￣１)ꎬＣＤ４４ꎬＣＤ４３ꎬＣＤ４５ꎬＩＡ/ＩＥｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅ￣ｔｒｙꎬａｎｄｔｈｅｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗａｓｉｎｄｕｃｅｄ.Ｔｈｅｃｘｃｒ２ｃＤＮＡｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄꎬａｎｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｏｆｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｏｕｓｅｃｘｃｒ２ｇｅｎｅｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄꎬａｎｄｎａｍｅｄａｓｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ.ＨＥＫ￣２９３Ｔｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｏ￣ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｐａｃｋａｇｉｎｇｐｌａｓｍｉｄｓａｎｄｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ.ＴｈｅＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｔｈｒｏｕｇｈｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＢＭＳＣｗｉｔｈｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺｖｉｒｕｓ.ＣＸＣＲ２ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄＲＴ￣ＰＣＲ.Ｔｈｅｍｉ￣ｇｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣｗａｓｔｅｓｔｅｄｂｙＴｒａｎｓｗｅｌｌｅｘｐｅｒｉ￣ｍｅｎｔ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ＣＤ４４ａｎｄＳＣＡ￣１ｗｅｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙｏｖｅｒ９０％ｏｆｔｈｅｔｈｉｒｄｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＢＭＳＣｃｅｌｌｓꎬｂｕｔＩＡ/ＩＥꎬＣＤ３４ａｎｄＣＤ４５ｈａｒｄｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄꎬａｎｄｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｉｎｄｕｃｅｄ.ＡｆｔｅｒＰＣＲａｎｄｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬｔｈｅａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｂａｎｄｓｗｅｒｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄｃｏｒｒｅｃｔ.ＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｗａｓｉｄｅｎｔｉｃａｌꎬｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺｐｌａｓｍｉｄｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃ￣ｔｅｄ.ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙａｎｄＲＴ￣ＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＣＸＣＲ２ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｍＲＮＡｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌＢＭＳＣ.ＴｈｅｔｒａｎｓｗｅｌｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙｏｆＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣｗａｓａｐｐａｒｅｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌＢＭＳＣ(Ｐ<０.００１).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅＢＭＳＣｓｓｔａｂｌｙｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＣＸＣＲ２ｗｅｒｅｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｓｙｓｔｅｍ.Ｔｈｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｘｃｒ２ｃａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎａｂｉｌｉ￣ｔｙｏｆＢＭＳＣ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＣＸＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ２(ＣＸＣＲ２)ꎻＭｏｕｓｅꎻＢｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(ＢＭＳＣ)ꎻＣｅｌｌｍｉｇｒａ￣ｔｉｏｎ㊀㊀间充质干细胞(ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌꎬＭＳＣ)是一类具有自我增殖㊁多向分化潜能的成体干细胞[１]ꎮＭＳＣ具有很强的免疫调节功能ꎬ在免疫和炎症性疾病的治疗中具有良好的潜力[２－４]ꎮ鉴于ＭＳＣ移植后归巢靶组织的数量有限㊁产生的治疗性和抗炎分子效力不够强ꎬ最近多项研究对ＭＳＣ进行基因修饰ꎬ从而增加了ＭＳＣ的治疗效能[５－７]ꎮＣＸＣ型趋化因子受体２(ＣＸＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ２ꎬＣＸＣＲ２)属于Ｇ蛋白是偶联受体家族ꎬ是趋化因子ＣＸＣＬ１㊁ＣＸＣＬ２㊁ＣＸＣＬ３㊁ＣＸＣＬ５㊁ＣＸＣＬ６㊁ＣＸＣＬ７和ＣＸＣＬ８的配体[８]ꎮ趋化因子在炎症性疾病中广泛表达ꎬ趋化因子与趋化因子受体结合能调节中性粒细胞㊁单核细胞的迁移ꎬ将它们募集到炎症部位发挥相应的作用ꎮ研究通过构建ｃｘｃｒ２基因修饰的ＢＭＳＣꎬ并观察修饰后ＢＭＳＣ到达炎症部位的迁徙能力ꎬ为后续炎症性疾病的ＢＭＳＣ治疗策略奠定基础ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀细胞与质粒㊀ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞株㊁Ｓｔｂｌ３感受态细胞㊁ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ㊁ｐＬｅｎｔｉ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ㊁ｐＣＭＶ３￣ＧＦＰＳｐａｒｋ￣ＣＸＣＲ２载体质粒㊁辅助包装质粒ｐｓＰＡＸ２和ｐＭＤ２.Ｇ均由空军军医大学微生物实验室保存并提供ꎮ１.２㊀实验动物㊀ＳＰＦ级４~６周Ｃ５７ＢＬ/６小鼠４只ꎬ１６~１８ｇꎬ均购自空军军医大学动物实验中心ꎮ１.３㊀主要试剂及仪器㊀ＤＭＥＭ培养基㊁青霉素㊁链霉素均购自ｈｙｃｌｏｎｅ公司ꎻ胎牛血清购自Ｓｉｇｍａ公司ꎻ成骨诱导分化培养基试剂盒购自广州赛业公司ꎻＰＥ标记抗小鼠ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１㊁ＩＡ/Ｅ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５抗体均购自ＢＤ公司ꎻＰＥ标记ＣＸＣＲ２抗体购自Ｂｉｏ￣ｌｅｇｅｎｄ公司ꎻ质粒大量提取ＤＮＡ试剂盒购自Ｏｍｅｇａ公司ꎻ先锋ＲＮＡ快速提取试剂盒㊁ＤＮＡ凝胶回收试剂盒㊁质粒小量提取ＤＮＡ试剂盒均购自Ａｘｙｇｅｎ公司ꎻＰｒｉｍｅＳＴＡＲＤＮＡ聚合酶㊁限制性内切酶ＮｈｅＩ㊁ＭｌｕＩ㊁ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ㊁Ｔ４ＤＮＡ连接酶㊁逆转录试剂盒㊁ＴａｋａｒａＳＹＢＲｇｒｅｅｎ试剂盒均购自Ｔａｋａｒａ公司ꎻ转染试剂ＭＡＸ由本室配制ꎻｍＣＸＣＬ２蛋白购自亿翘神州公司ꎮＣＯ２培养箱㊁Ｔ２５细胞培养瓶均购自Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司ꎻＩＸ７１倒置荧光显微镜购自Ｏｌｙｍｐｕｓ公司ꎻ流式细胞仪购自于美国ＢＤ公司ꎻ４ħ离心机购自德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司ꎻ超速离心机购自Ｂｅｃｋｍａｎ公司ꎻＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０ＰＣＲ仪购自罗氏公司ꎮ１.４㊀ＢＭＳＣ的分离、鉴定㊀采用全骨髓贴壁法培养小鼠ＢＭＳＣ[９]ꎮ将小鼠颈椎脱臼法处死ꎬ置于７５％乙醇中浸泡消毒５ｍｉｎꎻ于超净台中剪开皮肤ꎬ剥开肌肉ꎬ分离小鼠双侧股骨ꎬ剪去两端软骨ꎻ用１ｍＬ注射器吸取含１０％血清㊁１％双抗的ＤＭＥＭ培养基反复冲洗骨髓腔ꎬ直至骨髓腔发白ꎻ收集细胞悬液于Ｔ２５培养瓶中ꎮ将其放入３７ħ５％ＣＯ２培养箱中培养ꎬ首次４８ｈ后换液ꎬ以后视细胞状态而定ꎬ约２ｄ换液１次ꎮ传至第３代ꎬ常规消化细胞ꎻ按流式抗体说明书通过流式细胞术检测干细胞表面标志分子ＣＤ４５㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１㊁ＩＡ/ＩＥꎬ并按诱导分化培养基试剂盒说明书诱导ＢＭＳＣ成骨分化ꎬ茜素红染色鉴定ꎮ１.５㊀ｃｘｃｒ２过表达的慢病毒载体构建及慢病毒包装１.５.１㊀ｃｘｃｒ２基因片段的制备㊀根据Ｇｅｎｂａｎｋ中的ｃｘｃｒ２设计引物ꎬ以质粒(ｐＣＭＶ３￣ＧＦＰＳｐａｒｋ￣ＣＸＣＲ２)为模板进行ＰＣＲ扩增ꎮ引物序列如下:Ｆ:ＧＡＣＧＴＣＧＣＴＡＧＣＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＡＴＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡ(含ＮｈｅＩ和ＢａｍＨＩ酶切位点)ꎻＲ:ＧＡＣＧＴＣＡＣＧＣＧＴＧＡＧＧＧＴＡＧＴＡＧＡＧＧＴＧＴＴＴＧ(含ＭｌｕＩ酶切位点)ꎮ引物由擎科泽西生物技术公司合成ꎮＰＣＲ反应体系为模板ＤＮＡ２μＬꎬ上㊁下游引物各１.５μＬꎬ５ˑＰｒｉｍｅＳＴＡＲＢｕｆｆｅｒ１０μＬꎬｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ４μＬꎬＰｒｉｍｅＳＴＡＲＤＮＡ聚合酶０.５μＬꎬ加超纯水至５０μＬꎮＰＣＲ反应条件为:９８ħ变性１０ｓꎬ５５ħ退火５ｓꎬ７２ħ延伸７５ｓꎬ３０个循环ꎮＰＣＲ产物进行１.０％琼脂糖凝胶电泳鉴定后ꎬ按照ＤＮＡ凝胶回收试剂盒说明书回收ＤＮＡ片段ꎮ１.５.２㊀重组质粒ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ的构建及鉴定㊀用ＮｈｅＩ和ＭｌｕＩ分别对ｃｘｃｒ２ＰＣＲ产物和ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ进行双酶切ꎬ并分别进行胶回收ｃｘｃｒ２基因片段和ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ＧＺꎬ用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接后ꎬ用Ｓｔｂｌ３感受态细菌转化ꎬ涂布含有氨苄抗性的琼脂培养基ꎬ过夜培养后挑出单克隆并接种ꎬ３７ħ培养１２~１６ｈ后ꎬＰＣＲ鉴定得到阳性克隆保存甘油菌ꎬ并收集菌体沉淀ꎬ按质粒小量提取ＤＮＡ试剂盒说明书提取质粒ꎬ命名为ｐＣＩ￣ｎｅｏ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎮ之后ꎬ将其与ｐＬｅｎｔｉ￣ＣＤ４０Ｌ￣ＧＺ用ＢａｍＨＩ和ＳａｌＩ酶切ꎬ分别获得目的片段ｃｘｃｒ２￣ＧＺ和ｐＬｅｎｔｉ载体ꎬ连接后将连接产物转化Ｓｔｂｌ３感受态细菌ꎬ操作同前法ꎬ菌液ＰＣＲ鉴定单克隆菌落ꎬ鉴定正确菌落委托擎科泽西生物技术公司进行双向测序ꎬ测序结果于ＮＣＢＩ￣ＢＬＡＳＴ网站(ｈｔｔｐｓ://ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ/)进行比对ꎬ序列正确菌落命名为ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎮ１.５.３㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ慢病毒的包装㊀将重组质粒ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ１２μｇ与ｐｓＰＡＸ２９μｇ㊁ｐＭＤ２.Ｇ６μｇ混合后ꎬ加入转染试剂(ＭＡＸ溶液)８１μＬꎬ轻柔混匀ꎬ待其形成ＤＮＡ￣脂质体复合物后ꎬ转染ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞ꎮ将细胞放置于３７ħ５％ＣＯ２培养箱孵育４８ｈꎬ收集上清后加入ＤＭＥＭ培养液ꎬ７２ｈ后再次收集上清液ꎬ使用０.４５μｍ滤器过滤细胞碎片ꎬ收集病毒上清液ꎬ２０％蔗糖作为垫子ꎬ以１０００００ˑｇ离心４ｈꎬ超速离心法沉淀浓缩和纯化慢病毒ꎬ收集并分装ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ病毒液ꎬ于－８０ħ保存ꎮ１.６㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ稳定转染ＢＭＳＣ的构建及筛选㊀将第３代的小鼠ＢＭＳＣ铺于６孔板中ꎬ培养至细胞汇合度达到６０％~７０％时ꎬ每孔加入２ｍＬｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ病毒液和ＤＭＥＭ培养基的混合液(按１ʒ１比例)３７ħꎬ１０００ˑｇ离心感染２ｈꎬ弃去病毒液ꎬ加入含有１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养基于３７ħ５％ＣＯ２培养箱中继续培养ꎬ４８ｈ后荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎꎬＧＦＰ)的表达ꎮ然后加入含有１μｇ/ｍＬｚｅｏｃｉｎ的培养液２ｍＬ进行筛选ꎬ每３~４ｄ更换该培养液ꎬ直至不表达绿色荧光的细胞全部死亡ꎮ经过１４~２１ｄ的筛选后ꎬ获得了稳定表达ＣＸ￣ＣＲ２的小鼠ＢＭＳＣ(ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ)ꎬ同时设置未处理的ＢＭＳＣ作为对照组ꎮ１.７㊀稳定转染细胞系鉴定１.７.１㊀流式细胞术检测ＣＸＣＲ２蛋白表达㊀常规消化ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣꎬ加入预冷的缓冲液(ＰＢＳ加入１％胎牛血清)洗涤２次后ꎬ调整细胞浓度为１ˑ１０５个/孔后加入１μＬＰＥ标记ＣＸＣＲ２抗体ꎬ避光冰浴３０ｍｉｎꎻ洗涤２次后ꎬ用２００μＬＰＢＳ重悬ꎬ用流式细胞仪检测ＣＸＣＲ２蛋白的表达ꎮ１.７.２㊀Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ检测ｃｘｃｒ２ｍＲＮＡ的表达㊀按照先锋ＲＮＡ快速提取试剂盒说明书分别提取未感染正常ＢＭＳＣ和ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ的总ＲＮＡꎬ并用微黑子核酸测定仪定量ꎮ取５００ｎｇ总ＲＮＡ用逆转录试剂盒制备ｃＤＮＡꎬ然后按照ＴａｋａｒａＳＹＢＲｇｒｅｅｎ试剂盒说明书用Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０ＰＣＲ仪进行荧光定量ＰＣＲꎮ根据目的基因设计Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ引物ꎬ序列如下:ｃｘｃｒ２:Ｆ:ＡＴＧＣＣＣＴＣＣＴＡＴＴＣＴＧＣＣＡＧＡＴꎻＲ:ＧＴＧＣＴＣＣＧＧＴＴＧＴＡＴＡＡＧＡＴＧＡＣ￣３ꎻβ￣ａｃｔｉｎ:Ｆ:ＴＧＡＣＧＧＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧꎻＲ:ＡＡＧＣＴＧＴＡＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＧＴꎮ以β￣ａｃｔｉｎ为内参基因ꎬ检测试验组(ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ)及对照组(ＢＭＳＣ)细胞中上述目的基因ｍＲ￣ＮＡ的相对表达量ꎮＰＣＲ引物由擎科泽西生物技术公司合成ꎮ１.８㊀Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ趋化试验㊀在２４孔Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ的上室中接种ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ或ＢＭＳＣꎬ接种密度为１ˑ１０５个/孔ꎬ下室加入６００μＬ趋化缓冲液或正常缓冲液ꎮ实验分为４组:①小室上室加入培养的ＣＸＣＲ２￣ＢＭ￣ＳＣꎬ下室加入含１００ｎｇ/ｍＬｍＣＸＣＬ２正常培养液ꎬ命名为ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻ②小室上室加入培养的ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣꎬ下室不加任何刺激物ꎬ命名为ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣正常组ꎻ③小室上室加入培养的ＢＭ￣ＳＣꎬ下室加入含１００ｎｇ/ｍＬｍＣＸＣＬ２正常培养液ꎬ命名为ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻ④小室上室加入培养的ＢＭＳＣꎬ下室不加任何刺激物ꎬ命名为ＢＭＳＣ￣正常组ꎮ每组均放置于３７ħ㊁５％ＣＯ２培养箱孵育１２ｈ后用棉签擦去上室内细胞ꎬ用４％多聚甲醛固定１５ｍｉｎꎬ倒置风干后用０.１％的结晶紫染色２０ｍｉｎꎬ在显微镜下对上室底部反面的细胞进行计数ꎬ每组设３个复孔ꎬ每孔随机计数５个视野(２００ˑ)下迁移至膜背面的细胞数ꎮ１.９㊀统计学方法㊀应用ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍ５和ＳＰＳＳ１７软件进行统计分析ꎮ基因ｍＲＮＡ的相对表达量采用ｔ检验进行比较ꎻ各组迁移的细胞数采用单因素方差分析进行比较ꎬ两两比较采用ＳＮＫ检验ꎬＰ<０.０５为差异有统计学意义ꎮ２㊀结㊀果２.１㊀ＢＭＳＣ分离及鉴定２.１.１㊀小鼠ＢＭＳＣ形态㊀在显微镜下可以看到ꎬ刚分离的骨髓细胞大多悬浮并呈圆形ꎬ２４ｈ后见大量贴壁细胞ꎬ７２ｈ后贴壁细胞大多呈纺锤型㊁梭形和圆形ꎬ大约１２ｄ细胞长满ꎮ随着培养时间和传代次数的增加ꎬ细胞形态逐渐形似呈梭形ꎬ见图１ꎮ㊀注:Ａ.培养３ｄ的细胞形态ꎻＢ.培养１２ｄ的细胞形态ꎮ图１㊀小鼠ＢＭＳＣ形态(２００ˑ)Ｆｉｇ.１㊀Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(２００ˑ)２.１.２㊀ＢＭＳＣ表面标志分子流式鉴定㊀流式结果显示ꎬ超过９０％的细胞表达ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１ꎬ但几乎不表达ＩＡ/ＩＥ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５ꎬＢＭＳＣ表面标志分子鉴定ꎬ见图２ꎮ㊀注:Ａ.ＣＤ４４ꎻＢ.ＳＣＡ￣１ꎻＣ.ＣＤ４５ꎻＤ.ＣＤ３４ꎻＥ.ＩＡ/ＩＥꎮ图２㊀ＢＭＳＣ表面标志分子鉴定Ｆｉｇ.２㊀Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｆｏｒｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ２.１.３㊀诱导ＢＭＳＣ成骨分化㊀成骨诱导２１ｄ后ꎬ细胞呈结节状ꎬ茜素红染色呈红色ꎬ见图３ꎮ表明成骨分化诱导成功ꎮ提示分离获得的小鼠ＢＭＳＣ符合国际细胞治疗协会制定的间充质干细胞标准ꎮ图３㊀ＢＭＳＣ成骨诱导分化(２００ˑ)Ｆｉｇ.３㊀Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆｏｒｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(２００ˑ)２.２㊀ｃｘｃｒ２慢病毒载体的构建㊀琼脂糖电泳结果显示ꎬ扩增的目的条带单一㊁特异ꎬ之后菌液ＰＣＲ鉴定㊁酶切鉴定㊁测序分析结果均表明成功构建了慢病毒载体ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺꎬ见图４ꎮ２.３㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ稳定转染ＢＭＳＣ的构建及筛选㊀将ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ质粒与慢病毒包装质粒共同转染ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞ꎬ获得慢病毒后浓缩感染ＢＭ￣ＳＣꎬＢＭＳＣ经过Ｚｅｏｃｉｎ压力选择３周后ꎬ可在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光ꎬ对照组未见绿色荧光ꎬ见图５ꎮ２.４㊀稳定转染细胞系鉴定㊀流式鉴定大约７８.５％的细胞表达ＧＦＰꎬ７５.７％的细胞表达ＣＸＣＲ２ꎮＲｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ结果显示ꎬ试验组的ｃｘｃｒ２ｍＲＮＡ表达水平明显高于对照组ꎬ差异具有统计学意义(Ｐ<０.００１)ꎮ提示ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ构建成功ꎬ见图６ꎮ㊀注:Ａ.ｃｘｃｒ２基因片段的制备ꎻＢ.ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ菌液ＰＣＲ鉴定ꎻＣ.ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ质粒双酶切鉴定ꎻＤ.测序结果在ＮＣＢＩＢＬＡＳＴ比对ꎮ图４㊀ｃｘｃｒ２真核表达载体的构建Ｆｉｇ.４㊀Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｃｘｃｒ２ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒ㊀注:Ａ.过表达ＣＸＣＲ２的ＢＭＳＣ的荧光图片ꎻＢ.未感染正常对照ＢＭＳＣ的荧光图片ꎮ图５㊀ｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ稳定转染ＢＭＳＣ荧光表达(４００ˑ)Ｆｉｇ.５㊀ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢＭＳＣｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｂｙｐＬｅｎｔｉ￣ｃｘｃｒ２￣ＧＺ(４００ˑ)㊀注:Ａ.流式细胞仪检测ＧＦＰ表达ꎻＢ.流式细胞仪检测ＣＸＣＲ２表达ꎻＣ.Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ检测过表达ＣＸＣＲ２的小鼠ＢＭＳＣ中ｃｘｃｒ２ｍＲＮＡ表达ꎮ∗∗∗.Ｐ<０.００１ꎮ图６㊀ＣＸＣＲ２修饰的ＢＭＳＣ的鉴定结果Ｆｉｇ.６㊀ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＸＣＲ２ｍｏｄｉｆｉｅｄＢＭＳＣ２.５㊀ｃｘｃｒ２基因修饰的ＢＭＳＣ迁移能力增强㊀Ｔｒａｎ￣ｓｗｅｌｌ结果显示ꎬＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组在含有１００ｎｇ/ｍＬ的ｍＣＸＣＬ２的趋化液中穿过小室的数目明显高于ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎬＴｒａｎｓｗｅｌｌ实验检测细胞迁移ꎬ见图７ꎮ表明ｃｘｃｒ２基因修饰ＢＭＳＣ可增强其趋化潜能ꎮ㊀注:Ａ.ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻＢ.ＣＸＣＲ２￣ＢＭＳＣ￣正常组ꎻＣ.ＢＭＳＣ￣ｍＣＸＣＬ２组ꎻＤ.ＢＭＳＣ￣正常组ꎻＥ.２４ｈ后不同组别穿过膜下的细胞数ꎮ∗∗.Ｐ<０.０１ꎮ图７㊀Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验检测细胞迁移(２００ˑ)Ｆｉｇ.７㊀Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｂｙｔｒａｎｓｗｅｌｌａｓｓａｙ(２００ˑ)３㊀讨㊀论２０世纪７０年代ꎬＦＲＩＥＤＥＮＳＴＥＩＮ等[１０]首次利用贴壁法从骨髓分离得到ＢＭＳＣꎮ由于其来源方便ꎬ易于分离培养ꎬ且具有多向分化㊁免疫调节㊁输送治疗剂的能力ꎬ是较好的组织工程细胞和基因载体细胞ꎬ常被用于免疫与炎症性疾病的基础和临床研究[１１－１２]ꎮ通过静脉或腹腔移植的ＭＳＣ会沿着趋化梯度向受损组织迁移ꎬ在靶组织中检出率有限(只有不到１％)ꎬ大大降低了其治疗效应ꎮ可能的原因是ＭＳＣ表面趋化因子受体的表达较低ꎮ研究发现ꎬ趋化因子及其受体在ＢＭＳＣ的归巢中起着重要作用ꎬＢＭＳＣ表面的趋化因子受体通常支配着血管内循环细胞的黏附和滚动[１３－１４]ꎮＣＨＥＮ等[１５]研究发现ꎬｃｘｃｒ４过表达的ＢＭＳＣ在小鼠结肠炎模型中可增强ＢＭＳＣ向受损肠黏膜的归巢ꎬ对治疗结肠炎有较好的疗效ꎮＨＯＥＧＬ等[１６]研究发现ꎬ在内毒素所致的肺损伤中趋化因子ＣＸＣＬ１㊁ＣＸＣＬ２高表达ꎬＮＫ细胞通过ＣＸＣＲ２介导参与中性粒细胞向肺部炎症部位的募集ꎮ因此ꎬ对ＢＭＳＣ基因修饰趋化因子受体成为提高归巢能力的新策略[１７－１８]ꎮ研究通过全骨髓贴壁法分离培养ＢＭＳＣꎬ使用ＤＭＥＭ培养基进行培养ꎬ经过换液㊁传代去除了杂细胞ꎬ从而获得了纯度较高的ＢＭＳＣꎮ为了检测其是否符合干细胞标准ꎬ通过流式检测干细胞表面标志ＳＣＡ￣１㊁ＣＤ４４㊁ＣＤ４３㊁ＣＤ４５㊁ＩＡ/ＩＥꎬ结果显示ꎬ其高表达ＣＤ４４㊁ＳＣＡ￣１ꎬ几乎不表达ＩＡ/ＩＥ㊁ＣＤ３４㊁ＣＤ４５ꎬ通过诱导成骨分化观察到茜素红染色阳性的钙结节沉积ꎮ上述结果表明通过全骨髓贴壁法培养出符合细胞表型㊁具有分化潜能的ＢＭＳＣꎮ由于小鼠的ＢＭＳＣ具有感染率低的特点ꎬ研究通过慢病毒载体与慢病毒包装质粒共转染至ＨＥＫ￣２９３Ｔ细胞获得慢病毒ꎬ经超速离心沉淀法浓缩纯化ꎬ获得ｃｘｃｒ２过表达的慢病毒ꎮ通过离心法进行感染ꎬ利用抗性筛选提高阳性细胞的比例ꎬ从而使得ＣＸＣＲ２能稳定表达ꎮ荧光显微镜可以观察到稳定表达ＣＸＣＲ２的ＢＭＳＣ具有绿色荧光ꎻ流式细胞和ＲＴ￣ＰＣＲ结果显示ꎬＣＸＣＲ２蛋白和ｍＲＮＡ表达水平均明显高于正常ＢＭＳＣꎬ证实成功构建稳定表达ＣＸ￣ＣＲ２的ＢＭＳＣꎮ通过Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ趋化试验比较了ｃｘｃｒ２修饰的ＢＭＳＣ与普通ＢＭＳＣ的迁移和归巢ꎮ结果表明ꎬｃｘ￣ｃｒ２修饰的ＢＭＳＣ更容易迁移ꎬ提示ＣＸＣＲ２参与了ＢＭＳＣ的迁移与归巢ꎮ综上所述ꎬ研究成功构建了ｃｘｃｒ２修饰的ＢＭ￣ＳＣꎬ为进一步研究其直接移植治疗临床疾病及其作用机制奠定了基础ꎮ参考文献[１]㊀ＵＬＬＡＨＩꎬＳＵＢＢＡＲＡＯＲＢꎬＲＨＯＧＪ.Ｈｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ￣ｃｕｒｒｅｎｔｔｒｅｎｄｓａｎｄｆｕｔｕｒｅｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ[Ｊ].ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅＲｅｐꎬ２０１５ꎬ３５(２):１￣１８.[２]㊀ＲＯＳＴＡＭＩＭꎬＨＡＩＤＡＲＩＫꎬＳＨＡＨＢＡＺＩＭ.Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｅｎｇｉ￣ｎｅｅｒｅｄａｄｉｐｏｓｅｍｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｕｓｉｎｇＨＩＶ￣ｂａｓｅｄｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓａｓｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｄｉｓｅａｓｅｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＲｅｐｒｏ￣ｇｒａｍꎬ２０１８.ＤＯＩ:１０.１０８９/ｃｅｌｌ.２０１８.０００６.[３]㊀ＳＨＡＨＫꎬＺＨＡＯＡＧꎬＳＵＭＥＲＨ.Ｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏｔｒｅａｔｏｓｔｅｏ￣ａｒｔｈｒｉｔｉｓｗｉｔｈｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＩｎｔꎬ２０１８ꎬ２０１８:５３７３２９４.[４]㊀ＬＥＢＬＡＮＣＫꎬＭＯＵＧＩＡＫＡＫＯＳＤ.Ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓａｎｄｔｈｅｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ[Ｊ].ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕ￣ｎｏｌꎬ２０１２ꎬ１２(５):３８３￣３９６.[５]㊀ＣＨＥＮＸꎬＺＨＡＮＧＹꎬＷＡＮＧＷꎬｅｔａｌ.Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｍｏｄｉｆｉｅｄｗｉｔｈｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ￣１ｈａｖｅｅｎｈａｎｃｅｄｐａｒａｃｒｉｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎａｎｄａｔｔｅｎｕａｔｅｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ￣ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙａｎｄｏｘｉｄａ￣ｔｉｖｅｄａｍａｇｅｉｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌＢｉｏｃｈｅｍꎬ２０１８ꎬ４９(１):１０１￣１２２.[６]㊀ＸＵＸＰꎬＨＵＡＮＧＬＬꎬＨＵＳＬꎬｅｔａｌ.ＧｅｎｅｔｉｃｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩｔｙｐｅ２ｒｅｃｅｐ￣ｔｏｒｉｎｃｒｅａｓｅｓｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｔｏｉｎｊｕｒｅｄｌｕｎｇｉｎＬＰＳ￣ｉｎｄｕｃｅｄａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙｍｉｃｅ[Ｊ].ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＴｒａｎｓｌＭｅｄꎬ２０１８ꎬ７(１０):７２１￣７３０.[７]㊀ＳＴＥＷＡＲＴＡＮꎬＭＡＴＹＡＳＪＪꎬＷＥＬＣＨＫＯＲＭꎬｅｔａｌ.ＳＤＦ￣１ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｅｎｈａｎｃｅｓＧＡＰ￣４３￣ｐｏｓｉ￣ｔｉｖｅａｘｏｎａｌｇｒｏｗｔｈｆｏｌｌｏｗｉｎｇｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ[Ｊ].ＲｅｓｔｏｒＮｅｕｒｏｌＮｅｕｒｏｓｃｉꎬ２０１７ꎬ３５(４):３９５￣４１１.[８]㊀ＨＥＲＴＺＥＲＫＭꎬＤＯＮＡＬＤＧＷꎬＨＩＮＥＳＯＪ.ＣＸＣＲ２:ａｔａｒｇｅｔｆｏｒｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔ?[Ｊ].ＥｘｐｅｒｔＯｐｉｎＴｈｅｒＴａｒｇｅｔｓꎬ２０１３ꎬ１７(６):６６７￣６８０.[９]㊀ＳＯＬＥＩＭＡＮＩＭꎬＮＡＤＲＩＳ.Ａｐｒｏｔｏｃｏｌｆｏｒｉｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｍｏｕｓｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ[Ｊ].ＮａｔＰｒｏｔｏｃꎬ２００９ꎬ４(１):１０２￣１０６.[１０]㊀ＦＲＩＥＤＥＮＳＴＥＩＮＡＪꎬＣＨＡＩＬＡＫＨＪＡＮＲＫꎬＬＡＬＹＫＩＮＡＫＳ.Ｔｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｆｂｒｏｂｌａｓｔｃｏｌｏｎｉｅｓｉｎｍｏｎｏｌａｙｅｒｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆｇｕｉｎｅａ￣ｐｉｇｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｎｄｓｐｌｅｅｎｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＫｉ￣ｎｅｔｉｃｓꎬ１９７０ꎬ３:３９５￣４０３.[１１]㊀ＦＲＥＮＥＴＴＥＰＳꎬＰＩＮＨＯＳꎬＬＵＣＡＳＤꎬｅｔａｌ.Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ:ｋｅｙｓｔｏｎｅｏｆｔｈｅｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｎｉｃｈｅａｎｄａｓｔｅｐ￣ｐｉｎｇ￣ｓｔｏｎｅｆｏｒｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅｍｅｄｉｃｉｎｅ[Ｊ].ＡｎｎｕＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌꎬ２０１３ꎬ３１:２８５￣３１６.[１２]㊀ＬＩＸꎬＷＡＮＧＭꎬＪＩＮＧＸꎬｅｔａｌ.Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｎｄａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ￣ｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ:ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎꎬｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ￣ｔｉｏｎꎬａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＣｒｉｔＲｅｖＥｕｋａｒｙｏｔＧｅｎｅＥｘｐｒꎬ２０１８ꎬ２８(４):２８５￣３１０.[１３]㊀ＩＤＯＲＮＭꎬＴＨＯＲＳＰ.Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓａｎｄｅｘｅｒｃｉｓｅｔｏｔａｃｋ￣ｌｅｔｈｅｉｎａｄｅｑｕａｃｙｏｆＴｃｅｌｌｈｏｍｉｎｇｔｏｔｈｅｔｕｍｏｒｓｉｔｅ[Ｊ].Ｃｅｌｌｓꎬ２０１８ꎬ７(８):Ｅ１０８.[１４]㊀ＺＨＡＮＧＸꎬＨＵＡＮＧＷꎬＣＨＥＮＸꎬｅｔａｌ.ＣＸＣＲ５￣ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌｓｅｘｈｉｂｉｔｅｎｈａｎｃｅｄｈｏｍｉｎｇａｎｄｃａｎｄｅ￣ｃｒｅａｓｅｃｏｎｔａｃｔｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ[Ｊ].ＭｏｌＴｈｅｒꎬ２０１７ꎬ２５(６):１４３４￣１４４７.[１５]㊀ＣＨＥＮＺꎬＣＨＥＮＱꎬＤＵＨꎬｅｔａｌ.ＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓａｎｄＣＸＣｃｈｅｍｏｋｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒ４ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｍｐｒｏｖｅｄｔｈｅｔｈｅｒａｐｅｕ￣ｔｉｃｅｆｆｅｃｔｏｎｃｏｌｉｔｉｓｖｉａｍｕｃｏｓａｒｅｐａｉｒ[Ｊ].ＥｘｐＴｈｅｒＭｅｄꎬ２０１８ꎬ１６(２):８２１￣８２９.[１６]㊀ＨＯＥＧＬＳꎬＥＨＲＥＮＴＲＡＵＴＨꎬＢＲＯＤＳＫＹＫＳꎬｅｔａｌ.ＮＫｃｅｌｌｓｒｅｇｕｌａｔｅＣＸＣＲ２＋ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔｄｕｒｉｎｇａｃｕｔｅｌｕｎｇｉｎｊｕｒｙ[Ｊ].ＪＬｅｕｋｏｃｙｔｅＢｉｏｌꎬ２０１７ꎬ１０１(２):４７１￣４８０.[１７]㊀ＧＯＬＣＨＩＮＡꎬＲＥＫＡＢＧＡＲＤＡＮＭꎬＴＡＨＥＲＩＲＡꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏ￣ｍｏｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌ￣ｂａｓｅｄｔｈｅｒａｐｙ:ｓｐｅｃｉａｌｆｏｃｕｓｏｎｔｈｅｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｔｈｅｒａｐｙａｎｄｇｅｎｅｔｈｅｒａｐｙｆｏｒｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓｔｕｄｉｅｓ[Ｊ].ＡｄｖＥｘｐＭｅｄＢｉｏｌꎬ２０１８.ＤＯＩ:１０.１００７/５５８４＿２０１８＿２５６.[１８]㊀ＫＡＲＰＪＭꎬＬＥＮＧＴＧ.Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｈｏｍｉｎｇ:ｔｈｅｄｅｖｉｌｉｓｉｎｔｈｅｄｅｔａｉｌｓ[Ｊ].ＣｅｌｌＳｔｅｍＣｅｌｌꎬ２００９ꎬ４(３):２０６￣２１６.收稿日期:２０１８￣１０￣１６㊀修回日期:２０１８￣１２￣１２编辑:陈凌云。
小鼠真皮间充质干细胞的体外培养和标记
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大鼠附睾脂肪间充质干细胞的分离培养和鉴定
组 织工 程 的发 展 开 辟 了疾 病 治 疗 的新 路 径 ， 它
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第４ ２卷 第 ４期 ２０ ０ ８年 ８月
哈尔滨医科大学学报
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＡＲＢ Ｎ ＭＥＤＩ Ｉ ＣＡＬ Ｕ ＶＥＲＳ Ｙ ＮＩ ｎＩ
脐带间充质干细胞制备存储标准
脐带间充质干细胞制备存储标准脐带间充质干细胞（Wharton's Jelly Mesenchymal Stem Cells，WJ-MSCs）是一种来源于脐带的多潜能干细胞，具有广泛的临床应用前景。
为了确保脐带间充质干细胞的制备和存储质量，制定脐带间充质干细胞制备存储标准非常重要。
脐带间充质干细胞的制备和存储标准应包括以下几个方面：1.取材标准：脐带是脐带间充质干细胞的主要来源，因此在制备和存储过程中需要确保脐带的质量。
取材时，应确保脐带来自经过筛选和检测的健康母亲，脐带的无菌处理应符合相关规定。
2.分离和培养标准：脐带间充质干细胞的分离和培养是制备过程中的关键步骤。
应采用符合相关规定的分离和培养方法，确保脐带间充质干细胞能够获得最佳生长和增殖环境。
3.鉴定标准：在制备过程中，需要对脐带间充质干细胞进行鉴定。
鉴定标准可以包括表面标记物的检测、多向分化潜能的检测等指标，以确保制备的细胞具有干细胞的特性。
4.冻存标准：为了确保脐带间充质干细胞的长期保存，应采用合适的冻存方法和条件。
冻存标准可以包括冷冻液的选择、冷冻速率的控制、冷冻样品的保存温度等指标。
5.质量控制标准：脐带间充质干细胞的制备和存储过程中应进行严格的质量控制。
质量控制标准可以包括细胞数目的检测、细胞活力的检测、无菌检测等项目，以确保制备的细胞符合质量要求。
在制定脐带间充质干细胞制备存储标准时，需要参考国内外相关的法规和标准。
同时，制定标准时需要考虑到国内的实际情况和相关研究的最新进展。
制定标准应充分结合实际情况和科学研究，确保标准的可行性和科学性。
脐带间充质干细胞的制备和存储标准对于保证脐带间充质干细胞的质量和应用的安全性具有重要意义。
符合标准的脐带间充质干细胞可以应用于临床医学领域，对于治疗一些疾病和促进组织再生具有重要的作用。
因此，制定脐带间充质干细胞制备存储标准是当务之急，对于推动相关领域的研究和应用具有重要的意义。
干细胞研发实验报告
一、实验背景干细胞作为一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体，在再生医学、组织工程和疾病治疗等领域具有巨大的应用潜力。
本实验旨在探究人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）的分离、培养和诱导分化，为后续的临床应用和研究提供基础。
二、实验材料与仪器1. 材料：- 人脐带组织- DMEM/F12培养基（含10%胎牛血清）- 0.25%胰蛋白酶- 细胞计数板- 干细胞专用培养皿- 干细胞培养箱- CO2培养箱- 电子显微镜- 流式细胞仪2. 仪器：- 高速离心机- 超净工作台- 恒温培养箱- 光学显微镜- 冰箱- 移液器三、实验方法1. 人脐带间充质干细胞的分离：- 将人脐带组织剪成小块，用0.25%胰蛋白酶消化处理，离心去除细胞碎片。
- 将消化后的细胞悬液接种于干细胞专用培养皿中，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。
2. 细胞培养：- 每天更换新鲜培养基，观察细胞生长情况。
- 待细胞长满培养皿后，进行传代培养。
3. 细胞鉴定：- 采用流式细胞仪检测细胞表面标志物，如CD29、CD73、CD90和CD105。
- 采用免疫荧光染色检测细胞表面标志物，如CD29、CD73、CD90和CD105。
4. 细胞诱导分化：- 将hUCMSCs接种于新的培养皿中，加入诱导分化培养基（如含1%胰岛素、10 ng/mL骨形态发生蛋白-2和BMP-12的DMEM/F12培养基）。
- 每天更换诱导分化培养基，观察细胞形态和功能变化。
- 采用免疫荧光染色检测细胞分化标志物，如碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（OCN）。
四、实验结果1. 细胞分离：- 成功分离出hUCMSCs，细胞形态为长梭形，呈悬浮生长。
2. 细胞培养：- 细胞生长旺盛，传代培养过程中细胞活力保持良好。
3. 细胞鉴定：- 流式细胞仪检测结果显示，hUCMSCs表达CD29、CD73、CD90和CD105等干细胞标志物。
- 免疫荧光染色结果显示，hUCMSCs表达CD29、CD73、CD90和CD105等干细胞标志物。
大鼠骨髓间充质干细胞分离鉴定方法及生物学特性
大鼠骨髓间充质干细胞分离鉴定方法及生物学特性曹华;高建华;刘小龙;林思思【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2017(021)009【摘要】背景：如何能简便高效地获得均质性的骨髓间充质干细胞群是软骨组织工程研究的重点。
目的：分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,观察其生物学特性。
方法：抽取30只SD大鼠股骨以及胫骨骨髓,采用全骨髓贴壁培养法体外分离培养骨髓间充质干细胞,流式细胞仪测定细胞表面标记物的表达,细胞计数法观察细胞生长增殖能力,MTT法检测细胞存活率。
结果与结论：（1）刚分离培养的细胞呈圆形、椭圆形,部分细胞呈三角形,接种12-15 d后,细胞开始融合,传代后细胞增殖速度加快,传代2 h后细胞均匀分布在瓶底;（2）随着传代次数的增加,细胞增殖能力出现下降趋势,第1-5代细胞存活率均超过95%,显著高于第6代和第7代（P〈0.05）;（3）骨髓间充质干细胞表面CD34呈阴性表达,CD44呈阳性表达;（4）结果表明,采用全骨髓贴壁法可有效分离大鼠骨髓间充质干细胞,获得的细胞生长稳定,增殖能力强,可选用前5代细胞作为软骨组织工程的种子细胞。
【总页数】5页(P1357-1361)【作者】曹华;高建华;刘小龙;林思思【作者单位】[1]江西医学高等专科学校,江西省上饶市334000;[2]南昌大学医学部,江西省南昌市330006【正文语种】中文【中图分类】R394.2【相关文献】1.骨髓间充质干细胞分离鉴定及在糖尿病大鼠肾脏保护中的机制研究 [J], 康岩;李志杰;王丽娜;郭玉卿;刘璠;张洁2.大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定及免疫调节性能初探 [J], 张志强;刘义;李克秋;李光3.大鼠骨髓间充质干细胞分离鉴定方法及生物学特性 [J], 曹华;高建华;刘小龙;林思思4.大鼠骨髓间充质干细胞的分离鉴定及其在胶质瘤治疗中的作用 [J], 刘辉;张鹏幸;范菲艳;刘楠;任东妮;张永生;涂艳阳5.不同分离及培养方法对大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖和生物学特性的影响 [J], 贾贵清;张明鸣;杨平;程惊秋;陆燕蓉;伍晓汀因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
《脂肪间充质干细胞促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化》
《脂肪间充质干细胞促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化》一、引言在生物学和医学领域，巨噬细胞作为重要的免疫细胞，其在机体内的免疫调节和炎症反应中起着至关重要的作用。
根据其极化状态，巨噬细胞主要分为M1型和M2型两种亚型。
M1型巨噬细胞主要参与炎症反应和病原体清除，而M2型巨噬细胞则更多地参与组织修复和免疫调节。
近年来，脂肪间充质干细胞（ADSCs）在再生医学和免疫调节领域的应用逐渐受到关注。
本文旨在探讨脂肪间充质干细胞如何促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化，以及这一过程对免疫反应的影响。
二、方法本研究采用体外实验方法，使用ADSCs与M1型巨噬细胞共培养，观察其极化状态的变化。
通过流式细胞术、免疫荧光染色和Western blot等方法检测巨噬细胞的极化状态及相关信号分子的表达。
三、实验结果1. 脂肪间充质干细胞与M1型巨噬细胞的共培养实验结果显示，当ADSCs与M1型巨噬细胞共培养时，M1型巨噬细胞的极化状态发生了明显变化。
通过流式细胞术检测发现，共培养后M1型巨噬细胞的比例显著降低，而M2型巨噬细胞的比例显著增加。
2. 信号分子表达的变化通过Western blot检测发现，共培养后M1型巨噬细胞的相关标志物（如iNOS）表达降低，而M2型巨噬细胞的相关标志物（如Arg-1）表达升高。
这表明ADSCs成功促进了M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化。
3. 免疫调节作用通过免疫荧光染色观察发现，共培养后ADSCs与M2型巨噬细胞的相互作用增强，这可能有助于提高机体的免疫调节能力。
此外，共培养后的巨噬细胞在体内外的抗炎作用也得到了显著提高。
四、讨论本研究表明，脂肪间充质干细胞可以促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的转化。
这一过程可能涉及一系列复杂的生物学机制，包括信号分子的表达、细胞间的相互作用等。
此外，M2型巨噬细胞的增加有助于提高机体的免疫调节能力和抗炎作用。
因此，ADSCs在再生医学和免疫调节领域具有广阔的应用前景。
实验方案：成年猪MSCs的培养及鉴定
成年猪MSCs的培养新的实验方案实验材料：（1）取材准备：骨髓穿刺针，50ml离心管（1个含有抗生素无血清30mlL-DMEM,1个30ml含抗生素的PBS溶液，1个含有30ml枸橼酸钠抗凝剂，2个空离心管），酒精棉球，枸橼酸钠（105mmol/l,即32g/l，与血液以1:9比例稀释）。
（2）细胞分离准备：100ml无血清含抗生素的L-DMEM(洗液)，100ml含抗生素的PBS溶液，10ml离心管，5ml枪头和枪，离心管架，1.5ml离心管，1.5ml枪头和枪，percoll细胞分离液（1.073g/ml），毛细微管，35x10（小）培养皿，培养瓶（25cm2,75cm2）,10%血清L-DMEM,废液缸。
（3）溶液配制：电子天平，称量纸，钥匙，磁力搅拌器，转子，5ml注射器，100ml烧杯，250ml烧杯，100ml量筒，250ml滴流瓶，100ml滴流瓶，一套滤器，废液缸，瓶塞，ph计，1M盐酸，1M氢氧化钠，枸橼酸钠：3.2g/100ml. 3.2g枸橼酸钠+100mlDMEM肝素钠(140iu/mg)：200iu/ml0.01M PBS ：Nacl 8g, kcl 0.2g, Na2HPO4 1.44g ,KH2PO40.24g, 先加入800ml蒸馏水，然后调节Ph到7.2-7.4，最后加水定容到1L,高压灭菌20min,最后加入50μg/ml卡那霉素。
1.073g/ml percoll分离液：储存液，percoll原液：8.5%Nacl=9:1; 工作液：10ml储存液+7.544ml0.85%氯化钠。
L-DMEM洗液：将原粉L-DMEM倒入容器中，然后用注射器抽超纯水冲掉残余的原粉，然后加入800ml超纯水搅拌溶解后，加入3.7g/lNaHCO3,完全溶解后加入5.958g/l HEPES,完全溶解后，调节PH到7.2-7.4，过滤，然后加入50μg/ml卡那霉素和300μg/ml的两性霉素B。