酶谱法检测金属蛋白酶活性
明胶酶谱实验方法
明胶酶谱实验72kD（MMP-2）和92kD（MMP-9）抽提缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl,20 mmol/L CaCl2,1μmol/L ZnSO4,0.01% (v/v) Triton X-100,（0.5% PMSF）。
10mmol/LPMSF 溶液：取PMSF 粉末17.4mg, 加异丙醇溶解, 定容至100ml，置-20℃备用。
注意：PMSF在临提取组织时再加入，使终浓度为0.5%，配制时不加，不然易失效。
先用新鲜肾组织，蛋白量尽量加至最大。
如果按这个还做不出来，那就是你的实验技术问题了明胶酶是锌依赖的蛋白酶. EDTA是金属离子络合剂.加了就把明胶酶的锌离子络合了，完全抑制MMP的活性。
你加了这个我保证你一辈子也做不出来。
蛋白浓度一般是先摸索一个量。
就是分别上10,20,30,40,50,60,70,80,90,100ug跑一下电泳，先看结果。
条带看不见的，或者太透明的，都不能选。
就是要半明半暗的那种。
看是哪个道分解的，我们就选其中几个量上样。
(1)、5%浓缩胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液0.5ml1mol/L Tris-HCL( PH=6.8) 0.38ml10% SDS 30μl10%过硫酸铵(AP) 30μlTEMED 3μl3ml (2)、10%分离胶(现配现用)：d3H2O 2.1ml30%丙烯酰胺溶液 2.31ml1.5mol/l Tris-HCL(PH=8.8) 1.75ml10% SDS 70μl10%过硫酸铵(AP) 70μlTEMED 5.6μl1%明胶0.7ml7ml (3)、4×上样缓冲液（4o C保存）：0.32% Tris-HCL 6.4ml4%SDS 8ml50%甘油 3.2 ml溴酚蓝0.024gd3H2O 2.4ml20ml①wash buffer Ⅰ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg2.5% Triton X-100 12.5ml②wash buffer Ⅱ500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH )5 mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg③incubate buffer 500ml50mM Tris-HCl pH 7.6 3.0286g→400ml (调pH ) 50mM CaCl2 （110.99）0.2776g1μM ZnCl2 （136.30）0.068mg1% Triton X-100 5.0ml（五）注意事项1）孵育时间可以根据情况而定，可以延长。
酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶活性
➢ MMP-2又叫明胶酶A， 其蛋白主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生，分子量 为72kDa。
➢ MMP-9又称为明胶酶B，主要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产 生。分子量为92kDa，是MMPs中分子量最大旳酶。
➢ NGAL能与MMP-9以二硫键旳方式结合，能起到保护和调整MMP-9功能旳作用，所以NGAL 与肿瘤旳侵袭移动有亲密旳联络。
➢ 汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教讲课题组以转染有pcDNA3 空白质粒 载体旳SHEEC 细胞为对照，酶谱法检测成果表白，转染有pcDNA-NGAL (-) 旳SHEEC 细胞 分泌旳MMP-9 和MMP-2旳活性均明显降低；而与此同步，转染有pcDNA-NGAL (＋) 旳 SHEEC 细胞分泌旳MMP-9 和MMP-2旳活性均明显升高。表白经过有义、反义技术使NGAL 基因体现发生变化能够对SHEEC 细胞分泌旳MMP-9 和MMP-2 旳活性产生明显影响。
➢ 胶原是ECM旳主要成份，目前已发觉，至少有12种不同胶原类型，其中以I、Ⅱ、Ⅲ 型胶原是间质结缔组织中旳主要成份。Ⅳ型胶原则主要存在于基底膜内。
➢ 肿瘤细胞旳侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动旳有关基因及其体现调控模式旳变化 和增进细胞移动旳外界原因两者旳共同作用。
➢ 虽然肿瘤细胞侵袭旳分子机制还不是十分清楚，但已发觉许多调控细胞侵袭转移旳关 键分子及其信号通路。
脱色至蓝色背景和白色条带均十分明显时，用5％乙酸中断脱色； （4）待凝胶在5％乙酸中恢复到合适大小后，用凝胶图象处理系统分析成果，以白色条 带旳净光密度值相对定量样品中酶活性。
(多西环素)强力霉素影响基质金属蛋白酶活性和血管重构的实验研究
·１７０８·［文章编号］１０００—４７１８（２００６）０９—１７０８—０４强力霉素影响基质金属蛋白酶活性和血管重构的实验研究景颖，郑兴△，陈少萍，吴弘，张静（第二军医大学附属长海医院心内科，上海２００４３３）［摘要］目的：观察强力霉素对损伤动脉组织中基质金属蛋白酶（ＭＭＰ）活性的抑制作用，并探讨强力霉素对血管平滑肌细胞增殖、动脉内膜增生、管腔重构的影响。
方法：球囊导管扩张动脉的方法建立大鼠颈总动脉损伤模型。
治疗组用强力霉素３０ｍｇ·ｋｇ～·ｄ‘１干预。
明胶酶谱法测定损伤动脉组织中ＭＭＰｓ的活性。
用ＨＥ染色、ＶＶＧ染色、免疫组化标记仅一ａｃｔｉｎ和增殖细胞核抗原的方法观察损伤动脉内膜厚度、管腔重构及平滑肌细胞增殖的情况。
结果：①强力霉素治疗组ＭＭＰ一９活性在术后２４ｈ，３ｄ分别比对照组低２６．３％、３４．５％（Ｐ＜０．０１）；ＭＭＰ一２活性在术后７ｄ比对照组低４０．ｏ％（Ｐ＜０．０１）。
②强力霉素治疗使术后７ｄ内膜平滑肌细胞增殖率（４３．２３％±１．０６％）显著低于对照组（６２．７６％±１。
０２％）（Ｐ＜０．０１）；使术后１４ｄ、２８ｄ新生内膜厚度比对照组分别少３２．Ｏ％、３８．８％（Ｐ＜０．０１），而管腔面积比对照组多５８．０％、９０．４％（Ｐ＜０．０１）。
结论：强力霉素可以显著降低血管损伤后ＭＭＰｓ活性，抑制内膜平滑肌细胞的增殖、新生内膜增生以及管腔重构，提示它可能具有防治ＰＴＣＡ术后再狭窄的作用。
【关键词］血管成形术，气囊；多西环素；基质金属蛋白酶；肌，平滑，血管；血管重建［中图分类号］Ｒ３６３［文献标识码］ＡＥｆｆｅｃｔｏｆｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅｏｎｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｒｅ－ｍｏｄｅｌｉｎｇｉｎｂａｌｌｏｏｎ－－ｉｎｊｕｒｅｄｒａｔｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｉｅｓＪＩＮＧＹｉｎｇ，ＺＨＥＮＧＸｉｎｇ，ＣＨＥＮＳｈａｏ—ｐｉｎｇ，ＷＵＨｏｎｇ，ＺＨＡＮＧＪｉｎｇ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙ，ＣｈａｎｇｈａｉＨｏｓｐｉｔａｌ，ＴｈｅＳｅｃｏｎｄＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００４３３，Ｃｈｉｎａ）［ＡＢＳＴＲＡＣＴ］ＡＩＭ：Ｔｏｅｘａｍｉｎｅｔｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＭＭＰ）ａｃｔｉｖｉｔｙｂｙｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ（Ｄｏｘｙ）ａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎｖａｓｃｕｌａｒｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｓ（ＳＭＣｓ）ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．ＭＥＴＨＯＤＳ：Ｔｈｅｍｏｄｅｌｏｆｒａｔｃｏｍｍｏｎｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｙｉｎｊｕｒｙｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｂｙｂａｌｌｏｏｎ—ｄｉｌａｔａｔｉｏｎ．Ｄｏｘｙｗａｓａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄｔｏｔｈｅａｎｉｍａｌｓｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐａｔｄｏｓｅｏｆ３０ｍｇ·ｋｇ～·ｄ～．ＴｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＭＭＰｓｉｎｔｈｅｔｉｓｓｕｅｏｆｉｎｊｕｒｅｄｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｉｅｓｗａｓｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｇｅｌａｔｉｎｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ．Ｔｈｅｔｈｉｃｋｎｅｓｓａｎｄａｒｅａｏｆｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ，ｌｕｍｅｎａｒｅａａｎｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＳＭＣｓｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄｂｙｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃａｎａｌｙｓｉｓ．ＲＥＳＵＬＴＳ：１．ＭｔｅｒＤｏｘｙｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＭＭＰ一９ｉｎｔｈｅｃａｒｏｔｉｄａｒｔｅｒｉｅｓＷａｓｒｅｄｕｃｅｄｂｙ２６．３％ａｎｄ３４．５％ｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈａｔｉｎｒａｔｓｗｉｔｈｏｕｔＤｏｘｙｔｒｅａｔｍｅｎｔａｔ２４ｈｏｕｒｓａｎｄ３ｄａｙｓａｆｔｅｒｂａｌｌｏｏｎｉｎｊｕｒｙ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｐ＜０．０１）．ＴｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＭＭＰ一２Ｗａｓａｌｓｏｒｅｄｕｃｅｄｂｙ４０．Ｏ％ａｔ７ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｊｕｒｙ（Ｐ＜０．０１）．２．Ｔｈｅｔｈｉｃｋｎｅｓｓｏｆｎｅｏｉｎｔｉｍａｌｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙ３２．０％ａｎｄ３８．８％（Ｐ＜０．０１）ａｎｄｔｈｅｌｕｍｅｎ小ｅａｗａｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｂｙ５８．０％ａｎｄ９０．４％ａｔ１４ａｎｄ２８ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｊｕｒｙｉｎｔｈｅＤｏｘｙ—ｔｒｅａｔｅｄｒａｔｓｃｏｍｐａｒｅｄｔｏｔｈｏｓｅｉｎｃｏｎｔｒｏｌｒａｔｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ（Ｐ＜０．０１）．ＤｏｘｙｔｒｅａｔｍｅｎｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｉｎｔｉｍａｌＳＭＣｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｆｒｏｍ６２．７６％±１．０２％ｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｓｔｏ４３．２３％±１．０６％ａｔ７ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｊｕｒｙ（Ｐ＜０．０１）．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ：Ｄｏｘｙｔｒｅａｔｍｅｎｔ咖ｈｉｂｉｔｓｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＭＭＰｓ，ｔｈｅＳＭＣｓｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｉｍａｌ，ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｔｈａｔＤｏｘｙｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｓｕｓｅｆｕｌｉｎｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓａｆｔｅｒＰＴＣＡ．［ＫＥＹＷＯＲＤＳ］Ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ，ｂａｌｌｏｏｎ；Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ；ＭａｔｒｉｘｍｅｔａＵｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ；Ｍｕｓｃｌｅ，ｓｍｏｏｔｈ，ｖａｓｃｕｌａｒ；Ｖａｓｃｕ－ｌａｒｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ经皮腔内冠状动脉成形术（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｔｒａｎｓｌｕ－ｍｉｎａｌｃｏｒｏｎａｒｙａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ，ＰＴＣＡ）后再狭窄（ｒｅｓｔｅｎｏ—ｓｉｓ，ＲＳ）的防治是血管介入学领域内的热点课题。
蛋白酶活性的测定方法
精品文档蛋白酶活性的测定方法（GB/T23527-2009）1 原理蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。
磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林 - 酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。
由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。
利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。
2 仪器和设备2.1 分析天平：精度 0.0001g2.2 恒温水浴：精度土 0.2 C2.3 计时表2.4 分光光度计2.5 沸水浴器2.6 振荡混合器2.7 pH计：精度0.01pH单位3 试剂和溶液3.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液：称取乳酸（ 80%-90%）1 0 .6g, 加水溶解并定容至 1000ml。
乙液：称取乳酸钠（70% 16g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液 8ml, 加乙液 1ml, 摇匀，稀释一倍，即成 0.05mol/L 乳酸缓冲溶液。
3.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶准确称取磷酸氢二钠（ Na2HPO3.12H2O）6.02 和磷酸二氢钠（ NaH2PO3.2H2O） 0.5g, 加水定容至1000ml3.3 硼酸缓冲液（pH=10.5）适用于碱性蛋白酶甲液：称取硼酸钠19.08g, 加水溶解并定容至 1000ml。
乙液：称取氢氧化钠 4.0g, 加水溶解并定容至 1000ml. 使用溶液：取甲液500ml, 加乙液 400ml, 摇匀，用水稀释至 1L。
3.4 0.4mol/L 碳酸钠溶液：准确称取无水碳酸钠 42.4g, 以蒸馏水溶解定溶至 1000ml.3.5 0.4mol/L 的三氯醋酸液：准确称取 65.4 三氯醋酸, 以蒸馏水溶解定溶至 1000ml3.6 0.5mol/L 的 NaOH：准确称取2g NaOH溶解并定至100ml3.7 10.00mg/ml 酪素溶液称取酪素 1.000g, 准确至 0.001g, 用少量的 0.5mol/L 的氢氧化钠溶液（若为酸性蛋白酶则用浓乳酸 2-3 滴）润湿,, 加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100ml容量瓶中 , 用适宜的缓冲液稀释至刻度 , 此溶液在冰箱内贮存 , 有效期为三天 .3.8 100卩g/ml酪氨酸标准溶液3.8.1准确称取预先于105C干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L 的盐酸 60ml 溶解后定容至 100ml, 即为 1.00mg/ml 的酪氨酸溶液 .精品文档3.8.2 吸取 1.00mg/ml 酪氨酸标准溶液 10.00ml, 用 0.1mol/L 盐酸定容至100ml,即得100.0卩g/ml L-酪氨酸标准溶液.3.9 酶样的制备准确称取 1.000g 固体酶或移取 1ml 液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研 , 然后将上清液倒入 100ml 容量瓶, 沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次 , 最后全部移入容量瓶 , 稀释到刻度 , 用四层纱布过滤。
基础学习实验4-酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的活性
NGAL的三级结构
由N 端的310螺旋、C 端的α螺旋和中间的和中间的八段反平行的β折叠所构成，这
八段反平行式β折叠构成了一个β折叠桶结构。
此β折叠桶结构一端是开放的，为与配体结合提供了进口；而另一端则被短的N 端 310螺旋所封闭。在β折叠桶底部内侧排列着疏水的芳香族和脂肪族氨基酸残基， 形成了一个疏水核或疏水内部，为结合亲脂性配体提供了位点。
实验设计
1. 查阅相关资料，讨论MMP-2与MMP-9在食管癌各发展阶段的活性检 测能否作为监控癌症发展的一个指标，应该注意什么问题，其临床意 义如何？ 2. 若发现MMP-2与MMP-9在癌症病人中出现异常，谈谈你可能采取的
含有2个锌离子和5个钙离子
右图可见一个小分子化合物位于酶活性中心，并与一个锌离子结合
NGAL能与MMP-9以二硫键的方式结合，能起到保护和调节MMP-9功能的作用，所以NGAL
与肿瘤的侵袭移动有密切的联系。
汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组以转染有pcDNA3 空白质粒 载体的SHEEC 细胞为对照，酶谱法检测结果表明，转染有pcDNA-NGAL (-) 的SHEEC 细胞 分泌的MMP-9 和MMP-2的活性均明显降低；而与此同时，转染有pcDNA-NGAL (＋) 的 SHEEC 细胞分泌的MMP-9 和MMP-2的活性均明显升高。表明通过有义、反义技术使NGAL 基因表达发生改变可以对SHEEC 细胞分泌的MMP-9 和MMP-2 的活性产生明显影响。
（2）明胶酶，包括MMP-2和MMP-9,其作用底物主要是Ⅳ型胶原和明胶，还可降解Ⅶ、
Ⅸ、Ⅹ型胶原,但不能降解间质胶原； （3）间充质溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和MMP-11，其作用底物主要是
基质金属蛋白酶活性测定进展
酶 联 免疫 法 （ Ｌ Ｓ 可 以 定 量 测 定 血 清 、 浆 、 液 、 胞 Ｅ ＩＡ） 血 唾 细 培 养 物 上 清 或其 他 相 关 液 体 中 Ｍ ＭＰ ２和 ＭＭＰ ９含 量 ， － 目前 已开发 出 了基 于 此 原 理 的 试 剂 盒 ， 类 试 剂 盒应 用 双 抗 体 夹 心 此
ห้องสมุดไป่ตู้
解， 它们 分 别 是 ： 氨 酸 蛋 白酶 、 胱 氨 酸 蛋 白 酶 、 冬 氨 酸 蛋 丝 半 天 白酶 和 ＭＭＰ 。ＭＭＰ 是 其 中 最 重 要 和最 复 杂 的 一 类 ， 被 ｓ ｓ 并 认 为 在 肿 瘤 的 发展 过 程 中具 有 核 心 作 用 。 ＭＭＰ 在 肿 瘤 发 展 ｓ 中起 关 键 性 作 用 ， 涉 及 血 液疾 病 、 瘤 的进 展 、 它 肿 自身 免 疫 疾 病 ｌ 、 管 生 成 、 瘤 侵 袭 和 转 移 、 局 部 缺 血 。尤 其 是 ３血 ］ 肿 脑 ］
被 微 孔 板 ， 成 固 相 抗 体 ， 包 被 单 抗 的 微 孔 中 依 次 加 入 制 往
ＭＭＰ９抗 原 、 物 素 化 的 抗 兔 ＭＭＰ ９抗 体 、 Ｐ标 记 的 亲 － ・ 生 一 ＨＲ
和 素 ， 过 彻底 洗涤 后 用 底 物 ３ ３， ， 四 甲基联 苯 胺 （ 经 ， ５５ ＴＭＢ ）
在 肿 瘤转 移 过 程 中发 挥 了 重要 作 用 。 在生 物 体 内 ＭＭＰ 的 检 ｓ
测 以 及 ＭＭＰ 抑 制 剂 的 活性 评 价 ， 需 要 可 靠 的 ＭＭＰ 酶 活 ｓ 都 ｓ
算样品浓度 。
高效 液 相 色 谱 法 ［ ］ １ ４
基质金属蛋白酶(MMP)明胶酶谱法电泳分析试剂盒产品说明书
基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法电泳分析试剂盒产品说明书（中文版）主要用途基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法（gelatin-zymography）电泳分析试剂是一种旨在通过明胶聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，在分离、蛋白复性、底物水解、染色等一系列步骤下，观察并半定量深蓝色背景中的无色清晰的基质金属蛋白酶条带，根据分子量确定特异基质金属蛋白酶及其活性的权威而经典的技术方法。
该技术经过精心研制、成功实验证明的。
其适用于各种细胞萃取样品（动物、人体、植物、昆虫等）、培养上清悬液、血清和关节滑液或脑脊液等基质金属蛋白酶-2，9，以及13等活性及其抑制剂的检测。
产品即到即用，性能稳定，操作便捷，敏感度高，条带清晰，重复性好。
技术背景基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。
其功能在于分解细胞外基质成分。
迄今为止发现的MMPs至少有28种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、组织再吸收（tissue resorption）、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。
根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类：（1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和蛋白多糖；（2）明胶酶（Ⅳ型胶原酶）：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原和弹性纤维；（3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ胶原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金属蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明胶、Ⅳ型胶原、MMP2。
体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。
晚期转移性乳腺癌血浆MMP-2、MMP-9检测与化疗疗效相关性研究
【 ｓ ｒ ｃ 】Ｏｂ ｅ ｔｖ ｏｅａｕ ｔ ｔｅｂｏｃｉｉ ｆ ｌｓ ｔ Ａｂ ｔａ ｔ ｊ ｃ ｉｅ Ｔ ｖｌａｅ ｈ ｉａｔ ｔ ｏ ａｍａｉ ＭＭＰ ａ ｄｔｅｒ ｅｅ ａ ｃ ｉ ｈ ｍｏｈ ｒｐ ｕｉ ｅ ｉ ｃ ｖｙ ｐ ｃ ｓｎ ｉ ｒｌ ｎ ｅｗ ｔ ｃ ｅ ｔｅａ ｅ ｔ ｆｃ ｙ ｈ ｖ ｈ ｃ ａ
【 关键词 ］ 晚期乳腺癌 ； ７ ７９ 【 文献标识码 】 Ａ 【 文章编号 】０ ５ ０ １ ２ １ Ｏ — ５ ０ ２ ９ — ６ ６（ ０ ２） １ １ — ３
Ｃ０ｒ ｅｌ ｉ ｒ ａｔ ｏｎａｌ ｓ ｕｄｙ ｔ ｏｎ ａｄｖａｎｃ ｅｄ ｅｔ ｔ ｉ ｅａｓ ａｎｃ ａｓ ａ ｍ ａｓ ａｔ ｃ ｂｒ ｔｃ ｅｒ ｐｌ ｍ
２１ １第卷 １ ０ 年月 ２第期 ２
・ 论
著 ・
晚期转移性乳腺癌血浆ＭＭＰ ２ － 、ＭＭＰ ９ 一
检 测 与化疗疗 效相关性研究
陈 蕾 许 丽艳
１汕头大学医学 院附属肿瘤医院， ． 广东汕头 ５ ５ ３ ； ． １０ １ ２ 汕头大学 医学院肿瘤病理研究室 ， 广东汕头 ５５ ３ １０ １ 【 摘要 】目的 探讨 血浆基质金 属蛋 白酶 活性与晚期转移性 乳腺癌化 疗疗效 的相关 性 。方 法 选 择经病理或 细胞学确诊 的 晚期转移 性乳腺癌 患者 ， 分别 于化疗前 后收集患者血浆 （ ． ｍＬ空腹 全血加 ０２ ｍＬ枸 橼酸钠 ）离心后放置 于 一 ０ １８ ．％ ， ７ ℃冰 箱冻存 备查 。用酶谱 法测定肿 瘤患 者血浆 ＭＭＰ ２及 ＭＭＰ ９的活性 ， 一 一 用凝 胶 图象处理 系统分析 ； 白色条带 的净 光密 以 度值 相 对 定量 样 品 中酶 的活性 。 结 果 ＭＭＰ ２ ＭＭＰ ９在 晚 期乳 腺 癌治 疗 前 后 的活 性水 平 测定 具 有统 计 学 意义 。 一、 一 （ ＜ ００ 结 论 晚期 乳腺癌患者 血浆 ＭＭＰ ２ ＭＭＰ ９活性与病情进展 和疗效有一定相关性 ， Ｐ ．５ ｏ 一、 一 而检测方法简单经 济 ， 具有一定 的临床指导价值 。
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原理
酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE，含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。
复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min/次，做2次或15min/次，4次。
静置于Trition中是不妥的。
）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。
2试剂的配制
（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含1.0mg/ml 明胶，配好后1周内使用，明胶含量低灵敏度高）
A．分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）
10% SDS聚丙烯酰胺凝胶10ml（包括）
ddH2O 4.5ml
30%储备胶（0.8%BIS+29.2%丙烯酰胺）2ml
1.5mol/l Tris（PH 8.8）
2.5ml
10% SDS 100ul
10%过硫酸铵（APS）100ul
TEMED 8ul
1%明胶（1g明胶-->100ml，37°C水浴溶解）0.5ml
B.浓缩胶的配制
浓缩胶6ml
ddH2O 4.5ml
30%储备胶0.75ml
1mol/l Tris-HCL( PH 6.8) 0.76ml
10% SDS 60ul
10%过硫酸铵60ul
TEMED 6ul
（3）5×Tris –甘氨酸电极缓冲液
0.125mol/l Tris-HCL，1.25mol/l 甘氨酸，0.5%SDS（PH 8.3）
（4）4 ×上样缓冲液
0.32% Tris-HCL 6.4ml
4%SDS（PH7.2）8ml
16%甘油3.2 ml
溴酚蓝0.024g
ddH2O 2.4ml
(5) 洗脱液:2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl<6.057g/L> ，5mmol/L
CaCl2<0.5549g/L>，pH7. 6 （40分钟两次，中间换液）
（6）漂洗液：50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2，pH7. 6 （20分钟2次）
（7）孵育液：50mmol/LTris,pH7.5,150mmol/LNaCl,10mmol/LCaCl2,0.02%NaN3（孵育42小时）
（8）染色液：0.05% Coomassic 亮蓝R-250，30%甲醇，10%乙酸（染色3小时）（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5% （分别30min、1h、2h脱色）
3实验步骤
1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。
2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中2000rpm 离心10min，-70℃储存备用。
3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。
与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。
（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）
4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE 电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。
5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5% Triton X-100，50mmol/L Tris -HCl ，5mmol/L CaCl2，pH7. 6) 中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X - 100 外其余同洗脱液) 漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液( 50mmol/L Tris - HCl , 5mmol/ CaCl2 , 0. 02% Brij-35 ,pH7.6) 中37℃孵育42h。
6.孵育结束后经染色液(0.05% Coomassic 亮蓝、30%甲醇、10%乙酸) 染色3h,及脱色液A、B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10 % ,乙酸浓度分别为10 %、10 %、5%) 分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2（72KD）和MMP -9（92 KD）为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。
注意事项
1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。
2.明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。
3.用大梳子
4.孵育液的PH最好在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。
5.孵育的37度不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的PH值，在普通孵箱即可。
6.明胶要4度保存，配好后1周内使用
凝胶制备
1.玻璃板对齐后放入夹中，垂直卡紧，加满水检漏。
2.配10%分离胶，APS和TEMED作用为促凝，最后灌胶前加。
若板不漏水，则将水倒出，并用吸水纸洗净后灌胶，灌至大约3/4处，上面加满水压平。
3.配浓缩胶，同样地，APS和TEMED最后加，分离胶灌入约30min后观察小烧杯中剩余分离胶是否已凝，同时仔细观察可见玻板水和胶间有一条折线，说明胶已凝固。
4.将上面的水倒去，吸水纸洗净，灌入浓缩胶，灌满，注意一定不要有气泡，然后将梳子插入，注意保持水平，约30min后凝固可用。
5.拔梳子在电泳缓冲液中拔，加样孔用小针筒冲洗干净再上样，注意上样时勿使样品逸至邻孔，样品混匀时要轻，不要产生气泡，否则加样时易导致逸出而使结果不准确。