人成骨细胞原代培养
人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定
中国组织工程研究 第19卷 第32期 2015–08–06出版Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5155www.CRTER .org肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。
通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaCorresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, ChinaAccepted: 2015-07-01人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定肖建红1，张阳春2，张常然1，杨 兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700)文章亮点：1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。
骨骼肌细胞原代培养
骨骼肌细胞原代培养骨骼肌细胞是我们身体中最重要的肌肉组织之一，通过细胞的原代培养可以帮助我们更好地研究肌肉的生理和病理过程。
本文将介绍骨骼肌细胞原代培养的方法和意义。
一、骨骼肌细胞原代培养的方法1. 细胞来源骨骼肌细胞可以从人体或动物体内获得。
人体来源的骨骼肌细胞可以通过手术获取，动物来源的骨骼肌细胞可以通过解剖或抽取组织获得。
2. 细胞分离将获得的骨骼肌组织进行消化，分离出单个的骨骼肌细胞。
常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶，通过适当的温度和时间来进行消化。
3. 细胞培养将分离出的骨骼肌细胞放入培养皿中，加入适当的培养基，提供细胞所需的营养物质和生长因子。
培养基的配方和组成会因实验目的的不同而有所差异。
4. 细胞传代原代培养的骨骼肌细胞会在培养过程中逐渐增殖，达到一定的细胞数量后，可以进行细胞传代。
传代可以保持细胞的稳定性和生物学特性。
二、骨骼肌细胞原代培养的意义1. 生理研究通过骨骼肌细胞原代培养，可以研究肌肉的生理功能和调控机制。
例如，可以研究肌肉收缩机制、肌肉代谢和能量平衡等方面的问题。
2. 病理研究骨骼肌细胞原代培养还可以用于研究肌肉疾病的发生机制和治疗方法。
例如，可以利用培养的肌肉细胞模拟某些疾病的发生过程，寻找治疗的靶点和药物。
3. 药物筛选骨骼肌细胞原代培养可以用于药物的筛选和评价。
通过在培养的肌肉细胞中加入不同的药物，观察细胞的反应和变化，可以评估药物的疗效和毒副作用。
三、骨骼肌细胞原代培养的注意事项1. 细胞来源的选择在进行骨骼肌细胞原代培养前，需要选择合适的细胞来源。
不同的细胞来源可能会影响培养结果和实验的可行性。
2. 培养条件的优化骨骼肌细胞原代培养需要适宜的培养条件，包括培养基的配方、温度、湿度和CO2浓度等。
这些条件需要根据实验的要求进行优化。
3. 细胞的纯度和活性在骨骼肌细胞原代培养过程中，需要保证细胞的纯度和活性。
细胞的纯度可以通过筛选和分离的方法进行提高，细胞的活性可以通过细胞活力试剂盒进行检测。
iCell原代软骨细胞培养体系
iCell原代软骨细胞培养体系
产品编号：PriMed-iCELL-020
产品规格：500ml/kit
产品价格：1980
产品介绍：
iCell原代软骨细胞培养体系是一个为体外生长的人、大鼠、小鼠、兔等哺乳动物的软骨细胞设计的理想的完全培养基方案。
本体系是一个基于碳酸氢盐的缓冲体系，可以在孵育的5%的CO2的气体环境下维持一个围绕pH7.2的酸碱缓冲体系。
本体系是一个无菌的液体混合系统，其中包含必须和非必须氨基酸、维生素、激素、生长因子、微量元素和一些其他的有机和无机化合物以及一个低浓度的胎牛血清（5%）。
本培养体系是基于固定配方配制的液态培养体系，可以为体外培养的人、大鼠、小鼠、兔等哺乳动物的软骨细胞提供一个确定适宜的平衡营养环境，并且可以选择性的促进软骨细胞的扩增。
运输和保存：
放置于含有生物冰袋的保温箱中低温运输（体系中的各组分请按上述列表中的条件进行储存）
产品使用：
1.本产品仅能用于科研
2.本产品未通过直接用于活体动物和人的审核
3.本产品未通过用于活体诊断的审核。
原代培养
45
细胞克隆
• 克隆（clone）: 指单个细胞通过有丝分裂形成的 细胞群体。
• 细胞克隆化培养（cell cloning culture）:指将单 个细胞在一定支持物上（如软琼脂或甲基纤维素） 增殖培养而产生的细胞群落。
• 有均一性
27
细胞系（cell line）：原代培养经首次传代成功后即成 细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞谱系所组 成。 有限细胞系（finite cell line）：不能继续传代或传代数 有限 连续细胞系(continuous cell line)：可连续传代，即 “已建成的细胞系”（established cell line）
再用0.25%胰蛋白酶-柠檬酸盐消化液处理 • 用EDTA溶液洗细胞，再用0.25%胰蛋白酶-1mmol/L
EDTA消化细胞 • 用1mmol/L EDTA洗细胞，然后用0.25%胰蛋白酶和
200μ/ml胶原酶，配合柠檬酸盐或EDTA消化细胞 • 机械刮削法 • 在培养液中加入分散酶(0.1mg/ml)或蛋白酶(0.1～
24
培养液的更换 培养液的pH值下降 细胞浓度 细胞类型 细胞形态学
视频
25
第四节 细胞系与细胞克隆
26
组织培养常用术语
原代培养（primary culture）：从直接取 自生物体细胞、组织或器官开始的培养。
传代培养（passage culture）：将细胞从 一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即 称为传代培养。
开蛋壳，玻璃棒挑出鸡胚
8
小鼠胚胎的剖取过程（13天 ）
9
Байду номын сангаас
人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达
人骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中成骨相关基因的动态表达目的：系统研究人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）体外成骨诱导分化过程中成骨相关基因的表达变化。
方法：应用密度梯度离心法分离hBMSCs，取第2代细胞通过流式检测及多向诱导分化方法进行干细胞鉴定；应用RT-PCR法对hBMSCs在体外成骨诱导不同时间点的成骨相关基因表达进行检测。
结果：第2代hBMSCs表达间充质干细胞表面标志CD44、CD90，具有成脂和成骨分化潜能。
成骨相关基因在诱导早期部分表达，中期均有表达，基因表达大部分在14天达高峰，与矿化相关的基因表达在21天达高峰。
结论：hBMSCs体外成骨诱导过程中成骨相关基因呈动态表达，其表达时序与成骨细胞生理发育基本相似。
Abstracts:ObjectiveTo investigate the osteogenic related genes expression during in vitro osteogenic differentiation of human bone mesenchymal stem cells (hBMSCs).MethodshBMSCs were isolated by density gradient centrifugation. Surface markers and cell cycle were analyzed by flow cytometry. The multiple differentiation potential of hBMSCs were identified using in vitro osteogenic and adipogenic induction. The osteogenic related genes expression of hBMSCs at different induction time point were evaluated by semiquantitative RT-PCR analysis.ResultsThe hBMSCs were derived from bone marrow and expressed CD44 and CD90, markers of mesenchymal stem cell. The second passage of hBMSCs showed adipogenic and osteogenic differentiation potential. During the osteogenic induction process,hBMSCs expressed part of osteogenic related genes in early stage, and all of them in middle stage.The peak expression of most of genes were on the 14th day, and the mineralization associated genes on the 21st day. ConclusionsThe osteogenic related gene expression of hBMSCs shows a dynamic progress during in vitro osteogenic induction, which is consistent with in vivo development of osteoblast.Key words:hBMSCs;in vitro differentiation;osteogenic genes;expression pattern骨缺损的修补和重建是修复重建外科临床面临的常见问题。
成骨细胞培养
成骨诱导液：地塞米松，β-磷酸甘油，维生素C，OB或3T3-E1：α-MEM+10%FBS+50ug/ml ascorbic acid+10mM β-glycerophosphatePG(磷酸甘油)和Vc配好放四度，Vc尽量分装保存，减少与空气接触，三种分开配，不能配一起，培养液也是现用现配成骨细胞分离培养：无菌条件下取出新生鼠的颅盖骨，置入冷PBS中，剔除附着的结缔组织。
用PBS液清洗3次，将其置入盛有DMEM培养基的培养皿中，剪成0.5 mm×0.5 mm大小碎块，约30块，加入0.25%胰蛋白酶5 mL，置入孵箱中消化20 min，血清终止消化，弃上清液，加入1.0 g/L Ⅰ型胶原酶10 mL，置于孵箱中消化90 min，1 000 r/min 离心10 min，使细胞沉淀，用PBS洗涤细胞2次，200目滤网过滤去除骨碎片。
所沉淀物以含体积分数10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 mg/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞，吹打均匀，接种至多个25 cm2培养瓶。
于37 ℃，含体积分数5%CO2培养箱培养。
48 h后换液，以后隔日换液1次。
成骨细胞的培养，纯化及传代：在原代培养过程中，每48 h换液1次至细胞融合成单层，密度长至80%融合时，1∶3的比例进行传代培养。
将原代培养细胞用0.25%胰酶消化，制成细胞悬液，采用差速贴壁法进行成骨细胞的纯化。
成骨细胞鉴定：活细胞形态观察细胞：培养后每日用倒置相差显微镜观察细胞形态变化及生长状况并拍照。
Giemsa染色：将纯化后的第2代细胞调整细胞浓度至5×107 L-1，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种0.75 mL，以后每3 d换液。
待细胞分布均匀、约80%融合时，PBS洗3次，甲醇固定10 min，Giemsa 染液染2 min，蒸馏水冲洗，显微镜下观察拍照。
碱性磷酸酶活性检测细胞化学染色：细胞接种方法同上，体积分数95%乙醇固定30 min，按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。
原代和传代细胞的培养和维持
原代和传代细胞的培养和维持一、原代细胞的培养与维持1、静置贴壁细胞(包括半贴壁细胞的培养)凡经消化液处理实体组织来源的细胞要通过充分漂洗，以尽量除去消化液的毒性，细胞接种时浓度要稍大一些，至少为5×108细胞/L，培养基可用Eagle(MEM)或DNEM培养，小牛血清浓度为10%～80%．在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。
贴壁细胞长成网状或基本单层时，由于营养缺乏，代谢产物增多，pH变酸，不适宜细胞生长，此时细胞还未长成单层，未达到饱和密度，仍需继续培养，因此，需采取换液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长繁殖的需要。
其换液方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。
2、悬浮细胞的培养凡来自外周血、胸腹水、脾脏、淋巴结、骨髓的淋巴细胞、造血干细胞以及白血病细胞，在原代培养时要尽量去除红细胞．若要将淋巴细胞及白血病细胞进行长期培养，淋巴细胞中要加入生长因子，白血病细胞中要加入少量的原患者血清，以利细胞生长，待细胞开始增殖甚至结成小团块，培养基中pH变酸，说明细胞生长繁殖良好，一般每隔3天需半量换液一次（换液时尽量使细胞不丢失），待细胞增殖加快，浓度明显增加，pH发生明显变化时，此时可考虑传代。
悬浮细胞在未达到饱和密度时，但培养基中的营养成分并不能维持细胞的营养需求时，只能采用半量换液的方式．二、原代细胞培养的首次传代 (Subculture)这种使原代细胞经分散接种的过程称之为传代。
每进行一次分离再培养称之为传一代，传至5～10代以内的细胞通常称为次代培养细胞，传至10~20代以上的细胞，通常确定为传代细胞（或称传代细胞系）。
传代细胞系的建立，关键是初代培养的首次传代。
应注意如下几点：(1)细胞生长密度不高时，或未能达到覆盖整个瓶底时不能急于传代。
(2)原代培养的贴壁细胞多为混杂细胞，形态各异，往往是上皮样细胞和成纤维样细胞并存，采用胰蛋白酶消化时要掌握好消化时间，因成纤维细胞易于脱壁，上皮细胞不易脱壁，因此，可根据需要选用适当的消化时间及时中止消化。
细胞生物学实验细胞原代培养
• 2、离散细胞培养：有单细胞贴壁或分裂成片
培养观察一般项目
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次。 观察的内容包括：
严重者细胞脱壁悬浮。
9．将植块置于12孔培养板的培养孔中央，每孔5块，间隔约2mm，
布局合理，粘膜面向上，轻轻按压每块植块，使其紧贴培养板的
表面；
10．沿培养孔的边缘，缓慢加入约0.5ml的完全MEM培养液，
勿使培养液与植块接触；
11．将培养板置于370 C
、
５％CO2培养箱中预孵育1小时；
12．每孔加完全MEM培养液2ml，轻拿轻放，切勿使植块飘
• 学习观察体外培养细胞的形态及生 长状况。
实验原理
• 模仿体内生长环境，使来自机体 的细胞、组织、器官能够在人工 培养条件下生存、生长、繁殖。
•
培养用主要仪器设备
1、纯水设备：纯水仪 2、干燥消毒设备：电热干燥箱、高压蒸汽消毒锅、
过滤器及0.22 m滤膜； 3、超净工作台 4、培养设备： 普通培养箱、CO2培养箱； 5、贮存设备：冰箱、液氮罐 6、观察设备：倒置显微镜 7、其他设备：天平、离心机、水浴锅等
关闭超净工作台内的紫外光灯,点燃酒精灯 (一切操作均需在酒精灯火焰下进行)
将消毒过的所用物品放入超净工作台中
植块培养法培养鸡心肌细胞步骤
一、配M199完全培养液：
M199基础培养液 90％
小牛血清
10％
青霉素 链霉素
100IU/ml 100g/ml
过滤除菌。
二、获取心脏
① 消毒鸡胚蛋：泡入70％酒精 ② 取出鸡胚，Hank’s液洗涤。 ③ 取出心脏，放入Hank’s液中。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
人成骨细胞原代培养
1.人成骨细胞的分离和培养：
在无菌条件下取自体骨移植患者少量的松质骨，装入无菌HANK’S液中，迅速运送至实验室，充分剥离骨膜及软组织，把将骨块置于盛有DMEM培养液的培养皿中修整为
1mm×1mm×1mm大小的碎块，将松质骨块置入含有2∼3mlPBS的EP管中，用力摇动数次，然后静止30秒，令骨块沉下，小心倒掉含有造血组织和细胞的上清液，无菌PBS冲洗3次。
在松质骨块粒内加入红细胞裂解液(碳酸氢钠840mg、乙二胺四乙酸37.2mg、氯化铵8.023g、双蒸水1000mL，pH为7.2)，体积比为1∶2，裂解8min，离心去上液，至骨片发白放入离心管内。
2.酶消化法：
加入10倍的2.5g/L胰蛋白酶，在37℃恒温箱振荡预消化20min，胎牛血清终止消化，弃去消化液，PBS清洗两遍。
再加入体积比为1∶8的0.1%的Ⅰ型胶原酶密封置于37℃水浴箱内振荡消化1h，1000r/min离心5min，弃上清，沉淀用PBS洗涤后再1000r/min离心5min，沉淀用DMEM-F12完全培养液重新悬浮反复吹打均匀，将细胞悬液通过200目不锈钢筛网，去除可能存在的非成骨细胞和杂质成分，保留骨粒。
剩余骨粒重复Ⅰ型胶原酶消化，共3次。
然后将3次消化所得的细胞悬液用血球计数板计数，制成5×107L-1的细胞浓度(台盘蓝染色显示存活的细胞不少于95%)，接种于无菌培养皿中，在体积分数5%CO2、95%湿度培养箱中37℃条件下培养。
48h后换液，弃去悬浮细胞，每隔2d换液1次，细胞接近融合时传代。
3.组织块法：
将消化过的骨块，先用血清润湿，然后用吸管均匀接种至25 cm2的培养瓶中，翻转培养瓶，小心加入5 mL DMEM-F12完全培养液后，放入体积分数5%CO2、95%湿度培养箱中37 ℃条件下培养4 h后小心翻瓶。
每周换液1次，第3周起每周换液2次，细胞接近融合时按1∶ 2传代。
传代后剩下的骨片，再加入DMEM完全培养液，37 ℃，体积分数5%CO2孵箱中孵育。
如此反复两三次。