第3章-紫外-可见分光光度法
紫外-可见分光光度法
I0
I
b
I0、I、C、 b、T、A量 的关系
3.透光率
T＝I/I0
百分透光率T％＝I/I0× 100％ 4.比色池厚度：b 5.样品浓度：C（mol/l，％） 6.吸光度：A＝－logT=lg(I0/I)
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二.Lambert-Beer定律 Lambert定律：C一定，A＝-logT=K1b Beer定律：b一定，A＝-logT=K2c 两定律合并：A＝a·b·c a=K1K2 a为吸收系数
n 极性溶剂
例
O
异辛烷 max
290nm
15.8
15
K带：由共轭双键中п-п*跃迁所产生的吸收峰。 如 CH2 =CH-CH-CH2等。
特点 ：（1）λmax=210-250nm （2） ε>104，为强吸收 （3） 溶剂的极性越大， λmax越大
200nm 250nm
16
Π*
Π*
Π 极性溶剂
注：每种物质的吸收度仅由本身的性 质和C决定，与其它物质无关。
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吸光度A具有加和性，对同一物质来说 浓度（C） 吸光度 （A） 0 0 1C A
2C 3C 4C 2A 3A 4A 正偏离 工作曲线 负偏离 C1 C 线性范围：线性范围越 大越好。
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A
三、偏离Beer定律的因素 A＝a·b·c 影响吸收系数a的因素有： 1、物质的性质 2、波长的不同 3、其它因素 如溶剂的影响等 1)化学因素：离解、缔合、配位等化 学变化，使吸光物质形态发生变化。 溶剂、pH、温度等影响。
特点: (1)在非极性的溶剂中，B带230270nm产生细微振动
19
（2）在极性的溶剂中，细微结构消失，中 心吸收带λmax=256nm附近，ε在200左右。 （3）被取代时，细微结构消失 （4）B带是有机化合物的特征谱带 256nm
第三章紫外可见分光光度法ppt课件
2、影响紫外吸收光谱的主要因素
二苯乙烯顺式反式异构体的紫外吸收光谱
2、影响紫外吸收光谱的主要因素
(2) 跨环效应 跨环效应指非共轭基团之间的相互作用。 如对亚甲基环丁酮在214nm处出现一中等强度的吸收 带，同时284nm处出现R带。 这是由于结构中虽然双键与酮基不产生共轭体系，但 适当的立体排列，使羰基氧的孤电子对与双键的π电子 发生作用，相当于n→π*跃迁的R带向长波移动。
苯的紫外吸收光谱（异辛烷溶剂中）
4、E带——芳香族化合物特征吸收带
由苯环结构中3个乙烯的环 状共轭系统的π →π*跃迁所 引起。 分为E1和E2两个吸收带。 E1 吸 收 带 约 在 184nm ， εmax=60000 ，强吸收带。 E2 吸 收 带 在 204nm 以 上 ， εmax=8000 ，强吸收带。
2、K带——Konjugation(共轭作用)
由共轭双键中π →π*跃迁引起。 吸收峰出现在200nm以上，吸收强度大（ε＞105）。 随着共轭双键的增加，吸收峰红移，吸收强度有所增加。 如丁二烯λmax =217nm为K带。
3、B带——benzenoid(苯)
芳香族（包括杂芳香族） 特征吸收带。 由苯等芳香族化合物的π →π*跃迁所引起的吸收带 之一。 吸 收 峰 出 现 在 230~270nm 之间，中心波长256nm。 在极性溶剂中，B带精细 结构变得不明显或消失。
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1、有机化合物的紫外吸收光谱
(2)不饱和烃及共轭烯烃 含孤立双键或叁键的简单不饱和脂肪化合物，可以产生σ→σ* 和π→π*两种跃迁。 最大吸收波长λmax小于200nm。 具有共轭体系的不饱和化合物，共轭体系越长，跃迁时所需能 量越小，吸收峰红移越显著。 如1,3,5,7,9,11-十二烷基六烯λmax为364nm，εmax为138000。
有机波谱分析--紫外-可见光谱法
②呈一宽峰，且有精细结构。 ③当苯环被烷基以外的基团取代或溶剂极性增大时，精细
结构将会减弱甚至消失。
（4）E 带：芳香族化合物的特征谱带。
Ethylene
●E1带：苯环中“乙烯键”的π→π*跃迁产生的吸收带。 λmax=180～200nm，远紫外区； εmax=5×104L·mol-1·cm-1，强吸收。（不常用）
3.互变异构
4.氢键效应 1）溶质分子间氢键
使n→*共轭受限，轨道能差增大，波长蓝移。
2）分子内氢键：能差减小，波长红移。
例如：邻硝基苯酚和间硝基苯酚
分子内氢键
max=278nm =6.6103
无分子内氢键
max=273nm =6.6103
邻硝基苯酚， 由于分子内氢键的形成，红移了5nm。
3）溶质与溶剂间形成的氢键（属于溶剂效应）
波谱范围：10~800nm
（1）远紫外光区10~200nm （2）近紫外光区200~400nm （3）可见区400~800nm.
一般的紫外光谱是指近紫外区。
1、紫外光谱产生的条件
2、有机分子的化学键类型
★构成分子的化学键主要有 键、 键，还 有未成键孤
对电子构成的非键（n 键）。
★ 5种轨道分别是：
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2）单环共轭烯烃(乙醇溶剂) ◆母体值： ①共轭二烯不在同一环内
217nm
②共轭二烯在同一环内
◆扩展共轭： ◆取代基增加值： 烷基 卤素 ◆环外双键
253nm
＋30nm
＋5nm ＋17nm ＋5nm
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●注意： (1)母体值只是指共轭二烯母体本身的λ值,不包括C=C-C=C
紫外-可见分光光度法
2.2.2 波长扫描：分别将两个比色皿装上空 白溶液和样品溶液，放入比色槽中，拉动 拉杆使光路孔对准空白溶液，按[Start/Stop] 键进行谱图扫描（如想终止扫描再次按 [Start/Stop]键），待仪器自动进行基线校正， 提示拉入样品自动测试，测试完毕后有扫 描图谱出现，下方有相应的数据处理选项 ①Process ②Baseline（重新进行基线校正） ③Print。
朗伯-比尔定律是紫外-可见分光光度法的理 论基础。
Alg1lgI0 ECL TI
式中，A为吸光度，T为透光率，I0、I分别为入射光
和透过光的强度；E为吸光系数，当c用物质的量浓 度表示，L用厘米表示，用ε代替E，称为摩尔吸光 系数，单位为（L·mol-1·cm-1）；当c用百分浓度 （g/100mL），L用厘米表示时，用E1cm1%表示E，称 为比吸光系数。它们的关系如下：
4 要点与注意事项
4.1 开机前将样品室内的干燥剂取出， 仪器自检过程中禁止打开样品室盖。
4.2 比色皿内溶液以皿高的2/3～4/5为 宜，不可过满以防液体溢出腐蚀仪器。 测定时应保持比色皿清洁，池壁上液 滴应用滤纸擦干，切勿用手捏透光面。 测定紫外波长时，需选用石英比色皿。
2. 使用 仪器自检结束后（7个自检项目均出现
OK字样），按[MAIN MENU]键（主 菜单），屏幕显示如下5个功能项： 1. Phtometry（定量运算）；2. Wavelength Scan（波长扫描模式）；3. Time Scan （时间曲线扫描）；4. System（系统校 正）；5. Data display（光度直接测量 模式）。根据需要测量的实验项目按相
§3. 紫外-可见分光光度计
主要部件的性能与作用 基本结构:
第3章 紫外-可见分光光度法
h
h n
3
2
h
2
2
h
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配位场跃迁
• d−d 跃迁 – 配位体存在时，5个能量相等的d 轨道发生分裂，成为几 组能量不等的 d 轨道 – 当其离子吸收电磁辐射的能量后，处于低能态的d 轨道上 的电子可以跃迁至高能态的 d 轨道 – d 电子层尚未充满的第一、第二过渡元素 – [Cu(H2O)4]2+、[CuCl4]2−、[Cu(NH3)4]2+
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显色剂
• 无机显色剂 – 配合物常不够稳定、灵敏度和选择性也不高 – 硫氰酸钾：用于测定铁、钼、钨和铌等 – 钼酸铵：用于测定硅、磷和钒等 – 过氧化氢：用于测定钛 • 有机显色剂 – 可与金属离子生成稳定的螯合物 – 选择性和灵敏度都较高
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磺基水杨酸
• “OO型”螯合显色剂 • 主要用于测定Fe3+
单组分分析
• 标准曲线法
8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8
A
c
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多组分分析
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多组分分析
解线性方程组法
P49
15 16
72
1.783 L /( mol cm ) 1.46 105 L /( mol cm ) 5 1.22 10 0.077 3 HIn , 400 L /( mol cm ) 6 . 31 10 L /( mol cm ) 5 1.22 10 In ,528 0 0.753 4 In ,400 L /( mol cm ) 6 . 91 10 L /( mol cm ) 5 1.09 10
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紫外-可见分光光度法 PPT课件
若化合物在某波长处有强的吸收峰，而所含杂质在该波长处 无吸收或吸收很弱，则化合物的吸光系数将降低，若杂质在
该波长有比此化合物更强的吸收，将会使化合物的吸光系数
增大，且会使化合物的吸收光谱变形。（举一个间接的例子
吧，前一段时间快检车抽到一批吗叮啉，红外快检认定是假
药，送到所里以后，我们用薄层法做了一下，发现样品也显
百分吸收系数 377
吸收度值 277nm 0.461
0.461×0.2609×100.00×200.00
含量=-----------------------------------×100%=96.97%
377×0.0658×5.00×0.2×100
二、多组分定量测定 解线性方程组法 等吸收双波长消去法 系数倍率法 导数光谱法
面神经麻痹的病理变化早期主要为面神经水肿髓鞘和轴突有不同程度的变性以在茎乳突孔和面神经管内的部分尤为显著w五测定时除另有规定外应以配制供试品溶液的同批溶剂为空白对照测定吸光度实际上是透光率而在测定光强弱时不只是由于被测物质的吸收所致还有溶剂和容器的吸收光的色散和界面反射等因素都可使透射光减弱用空白对照可排除这些因素的干扰
由上图可以看出吸收光谱的特征： ⑴曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称 最大吸收波长，以λmax表示。 ⑵曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，所对应的波 长，称最小吸收波长，以λmin 表示。 ⑶曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，形状像 肩的部位，称肩峰，以λsh表示。
⑷在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处， 吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。
利用物质的吸收光谱进行定量、定性及结构 分析的方法称为吸收光谱分析法。紫外－可 见吸收光谱是一种分子吸收光谱，它是由于 分子中原子的外层电子跃迁而产生的。
紫外可见分光光度法
由图可见ΔT =1%, T 在20%～ 65%之间时, 浓度相对误差较小, 此为 最佳读数范围。
所以要求选择适宜的吸光度范围 （0.2-0.7）, 以使测量结果的误差最 小。
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措施: （a）控制溶液的浓度；（b） 选择不同厚度的比色
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溶液颜色与光吸收的关系
当一束太阳光照射某一溶液时, 太阳光中某一颜色的光 被吸收, 其互补色光透过溶液, 刺激人的眼睛, 使人感觉到它 的颜色。
实例:
1)高锰酸钾吸收绿光显紫 红色；
2)重铬酸钾吸收蓝光显黄 色；
3)邻菲罗啉铁溶液吸收蓝 绿光显红色。
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可见光波长及其互补光
(如国产710型，730型)； 3.双波长双光束分光光度计
(如国产WFZ800-5型）
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紫外可见分光光度的使用
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721分光光度计操作步骤
➢ 1.预热仪器。为使测定稳定, 将电源开关打开, 使仪器预热20min, 为了防止光电管疲劳, 不要连续光照。预热仪器和不测定时应将比 色皿暗箱盖打开, 使光路切断。
ε: 摩尔吸收系数，单位L·mol -1·cm-1。（讲解78页 例题）
摩尔吸收系数越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测
定该物质的灵敏度越高。
ε > 105: 超高灵敏；
ε = (6～10）×104 : 高灵敏；
ε < 2×104
: 不灵敏。
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吸光度的加和性
(完整word版)紫外-可见分光光度法
紫外-可见分光光度法1 简述紫外-可见分光光度法是在190-800nm 波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和含量测定的方法。
定量分析通常选择物质的最大吸收波长处测出吸光度，然后用对照品或吸收系数求算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定；对已知物质定性可用吸收峰波长或吸光度比值作为鉴别方法；若该物质本身在紫外光区无吸收，而其杂质在紫外光区有相当强度的吸收，或杂质的吸收峰处该物质无吸收，则可用本法作杂质检查。
物质对紫外辐射的吸收是由于分子中原子的外层电子跃迁所产生，因此，紫外吸收主要决定于分子的电子结构，故紫外光谱又称电子光谱。
有机化合物分子结构中如含有共轭体系、芳香环等发色基团，均可在紫外区（200~400nm ）或可见光区（400~850nm ）产生吸收。
通常使用的紫外-可见分光光度计的工作波长范围为190~900nm 。
紫外吸收光谱为物质对紫外区辐射的能量吸收图。
朗伯-比尔（Lambert-Beer ）定律为光的吸收定律，它是紫外-可见分光光度法定量分析的依据，其数学表达式为: A=logT1=ECL 式中 A 为吸光度;T 为透光率;E 为吸收系数;C 为溶液浓度;L 为光路长度。
如溶液的浓度（C ）为1%（g/ml ），光路长度（L ）为lcm ，相应的吸光度即为吸收系数以%11cm E 表示。
如溶液的浓度（C ）为摩尔浓度（mol/L ），光路长度为lcm 时，则相应有吸收系数为摩尔吸收系数，以ε表示。
2 仪器紫外-可见分光光度计主要由光源、单色器、样品室、检测器、记录仪、显示系统和数据处理系统等部分组成。
为了满足紫外-可见光区全波长范围的测定，仪器备有二种光源，即氘灯和碘钨灯，前者用于紫外区，后者用于可见光区。
单色器通常由进光狭缝、出光狭缝、平行光装置、色散元件，聚焦透镜或反射镜等组成。
色散元件有棱镜和光栅二种，棱镜多用天然石英或熔融硅石制成，对200~40Onm波长光的色散能力很强，对600nm以上波长的光色散能力较差，棱镜色散所得的光谱为非匀排光谱。
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第3章 紫外-可见分光光度法一、内容提要1、电子跃迁类型 σ→σ*跃迁、π→π*跃迁、n →π*跃迁、n →σ*跃迁、电荷迁移跃迁、配位场跃迁。
2、常用术语1）最大吸收波长：曲线上的峰(吸收峰)所对应的波长，以m ax λ表示。
2）最小吸收波长：曲线上的谷(吸收谷)所对应的波长，以m in λ表示。
3）肩峰：在吸收峰旁边存在一个曲折，对应的波长以sh λ表示。
4）末端吸收：在200nm 附近，吸收曲线呈现强吸收却不成峰形的部分。
5）生色团：分子中可以吸收光子而产生电子跃迁的原子基团。
有机化合物的生色团主要是含有π→π*或n →π*跃迁的基团（＞C ＝C ＜、＞C ＝O 、＞C ＝S 、—N ＝N —、—N ＝O 等）。
6）助色团：含有非键电子的杂原子饱和基团（如—OH 、—SH 、—OR 、—SR 、—NH 2、—Cl 、—Br 、—I 等），它们本身不能吸收波长大于200nm 的光，但当它们与生色团相连时，能使该生色团的吸收峰向长波长方向移动，并使吸收强度增强。
7）红移和蓝移：化合物常因结构的变化（发生共轭作用、引入助色团等）或溶剂的改变而导致吸收峰的最大吸收波长m ax λ发生移动。
m ax λ向长波长方向移动称为红移；m ax λ向短波长方向移动称为蓝移。
8）增色效应和减色效应：因化合物的结构改变或其他原因而导致吸收强度增强的现象称为增色效应，有时也称为浓色效应；反之，导致吸收强度减弱的现象称为减色效应，有时也称为淡色效应。
9）吸收带：不同类型的电子跃迁在紫外-可见光谱中呈现的不同特征的吸收峰。
10）强带和弱带：摩尔吸收系数大于104的吸收带为强带；摩尔吸收系数小于102的吸收带为弱带。
3、吸收带1）R 带：跃迁类型为n →π*，波长范围为250～500nm ，吸收强度ε<102。
溶剂极性增大时蓝移。
R 带是杂原子的不饱和基团（＞C ＝O 、－NO 、－NO 2、－N ＝N －等）的特征。
2）K 带：跃迁类型为π→π*（共轭），波长范围为210～250nm ，吸收强度ε>104。
共轭双键延长时红移，且吸收强度增大。
溶剂极性增大时红移。
3）B 带：跃迁类型为苯环的骨架伸缩振动与苯环内的π→π*跃迁，波长范围为230～270nm ，吸收强度ε≈200。
蒸气状态下可呈现精细结构。
B 带是芳香族（包括杂芳香族）化合物的特征吸收带之一4）E带：E1带的跃迁类型为苯环上孤立乙烯基的π→π*跃迁，E2带的跃迁类型为苯环上共轭二烯基的π→π*跃迁，E1带波长约为180nm，E2带波长为200nm以上，吸收强度ε≈104（E1带），ε≈103（E2带）。
5）影响吸收带的因素4、测量条件的选择1）测量波长的选择最大吸收原则吸收最大、干扰最小2）吸光度范围的选择为了减小吸光度或浓度测定结果的相对误差，应控制吸光度在0.2～0.7范围内，最好为0.434。
3）参比溶液的选择包括溶剂空白、试剂空白、试样空白等。
5、显色反应本身无吸收或只有弱吸收的物质，在一定条件下加入试剂，经过适当的化学反应定量转变为有色化合物后再行测定。
这种选用适当的试剂与不吸收紫外-可见光的被测物质定量反应生成对紫外-可见光有较大吸收的物质的反应称为显色反应，反应中所加试剂称为显色剂。
对显色反应的要求包括：灵敏度较高、定量关系确定、选择性好、显色产物稳定性好、显色剂与显色产物之间应有显著的颜色差别（显色产物与显色剂的最大吸收波长的差别应在60nm 以上）。
6、显色条件的选择影响显色反应的主要因素有显色剂用量、溶液酸度、反应时间、温度、溶剂等。
通常采用单因素变化法确定各影响因素的最佳取值范围。
7、紫外-可见分光光度计1）主要部件光源：钨灯或卤钨灯（可见光区）、氢灯或氘灯（紫外光区）。
单色器：常用的色散元件有棱镜和光栅。
吸收池：玻璃吸收池只能用于可见光区；而石英吸收池既适用于紫外光区，也适用于可见光区。
检测器：包括光电池、光电管、光电倍增管、光二极管阵列检测器。
2）类型3）分光光度计的校正波长的校正、吸光度的校正、比色皿的校正（在测定波长处比较盛有空白溶液的各比色皿的百分透光率，要求相互间不应超过0.5%）。
8、分析方法1）定性分析对比法：在相同条件下分别测得未知试样和标准样品的紫外-可见吸收光谱，将两者进行对照、比较，如果它们完全相同，则待测试样与标准样品可能是同一种化合物；反之，如果存在明显差别，则肯定不是同一种化合物。
计算法：Woodward-Fieser 规则可用于计算共轭体系和α, β-不饱和醛酮类化合物的最大吸收波长；Scott 规则可用于计算芳香族羰基的衍生物在乙醇中的最大吸收波长。
2）单组分的定量分析吸收系数法：bE A c ⋅=%11cm 样样 或 b A c ⋅=ε样样。
对照法：对对样样A c A c =。
标准曲线法：配制一系列不同浓度c 的对照品溶液，在相同条件下分别测定吸光度A ，利用最小二乘法计算A -c 线性回归方程，根据回归方程对被测物质进行定量分析。
3）多组分的定量分析 解线性方程组法：y y x x y x y x C E C E A A A 11111+=+=+y y x x y x y x C E C E A A A 22222+=+=+双波长分光光度法——等吸收法：()b c E E A A A A A x x1x 2x1x212-=-=-=∆4）结构分析不饱和有机化合物分子的π→π*和n →π*跃迁的吸收谱带处于紫外-可见光区，因此，紫外-可见吸收光谱可以提供这些化合物的共轭体系和某些生色团、助色团的特征信息，从而用来推断化合物的骨架结构和官能团、判断异构体等。
二、重点和难点本章重点：电子跃迁类型、吸收带、测量条件的选择、定量分析方法。
本章难点：影响吸收带的因素、显色条件的选择、多组分定量分析方法。
三、思考题与习题选解10. 某有色溶液在1cm 比色皿中测得吸光度为0.500。
将该溶液稀释到原浓度的一半，并转移至3cm 的比色皿中，试计算在相同波长下测得的吸光度和透光率。
解221121c b c b A A = 750.0500.01213111222=⨯⨯==A c b c b A%18=T11. 测定电镀废水中的铬（Ⅵ），取500mL 水样，经浓缩及预处理后，转移至100mL 容量瓶中定容，移取20mL 试液，调节酸度后，加入二苯碳酰二肼溶液显色，并定容为25mL 。
在5.00cm 比色皿中于540nm 波长处测得吸光度为0.680。
已知)cm m ol /(L 102.44⋅⨯=ε。
求水样中铬（Ⅵ）的质量浓度。
解L /mol 1024.3L /mol 00.5102.4680.064-⨯=⨯⨯==b Ac ε L /m g 042.0L /m g 105000.10020259961.511024.336)VI (Cr =⨯⨯⨯⨯⨯=-ρ12. 用硅钼蓝比色法测定钢中硅的含量。
根据下列数据绘制标准曲线 硅标准溶液的浓度（mg/mL ）0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 吸光度A0.2120.4190.6300.8411.011测定试样时，称取钢样0.500g ，溶解后转移至50mL 容量瓶中，用与标准溶液相同的测量条件测得吸光度为0.521。
求试样中硅的质量分数。
解以最小二乘法进行线性回归，得0166.0040.4+=ρAAρ将521.0=A 代入上式，得mL /mg 125.0=ρ%25.1%10010500.00.50125.03Si =⨯⨯⨯=w 13. 用磺基水杨酸比色法测铁，以1.000g 铁铵矾（NH 4Fe(SO 4)2·12H 2O ）溶于500mL 水制成铁的标准溶液。
取6.0mL 该标准溶液，于50mL 容量瓶中显色，测得吸光度为0.480。
吸取5.00mL 待测试液，稀释至250mL ，移取2.00mL 至50mL 容量瓶中，与标准溶液同样显色，测得吸光度为0.500。
求试液中铁的质量浓度。
解由题意可知，铁标准溶液的浓度为L /g 2316.0L /g 22.482845.5510500000.13Fe =⨯⨯=-ρ显色液中铁的浓度为L /g 02779.0L /g 0.500.62316.0Fe=⨯='ρ 因此，L /g 02895.0L /g 02779.0480.0500.0=⨯=⋅=标标样样ρρA A试液中铁的浓度为L /g 2.36L /g 00.525000.25002895.0=⨯⨯=x ρ14. 称取维生素C 试样0.0500g ，溶于100mL 0.02mol/L H 2SO 4溶液中，精密吸取此溶液2.00mL ，定容至100mL ，以1cm 石英比色皿于243nm 波长下测得吸光度为0.551。
已知维生素C 的吸收系数560%1cm 1=E 。
求维生素C 的质量分数。
解m L 100/g 1084.9m L 100/g 1560551.04%1cm 1VC -⨯=⨯=⋅=bE Aρ%4.98%1000500.000.21001084.94VC =⨯⨯⨯=-w15. 甲基红的酸式体（HIn ）和碱式体（In −）的最大吸收波长分别为528nm 和400nm ，在不同实验条件下以1cm 比色皿测得吸光度如下表，求甲基红的浓度c x 。
浓度（mol/L ） 酸度 A 528 A 400 1.22×10−5 0.1mol/L HCl 1.783 0.077 1.09×10−50.1mol/L NaHCO 30.00 0.753 c xpH = 4.181.4010.166解)cm mol /(L 1046.1)cm mol /(L 1022.1783.155528,HIn ⋅⨯=⋅⨯=-ε )cm mol /(L 1031.6)cm mol /(L 1022.1077.035400,HIn ⋅⨯=⋅⨯=-ε 0528,In =-ε )cm mol /(L 1091.6)cm mol /(L 1009.1753.045400,In⋅⨯=⋅⨯=--ε 根据吸光度的加和性，得0HIn 528,HIn 528+=c A ε--+=In 400,In HIn 400,HIn 400c c A εε代入数据，得L /mol 1060.9L /mol 1046.1401.165HIn -⨯=⨯=c L/mol 1053.1L /mol 1091.61060.91031.6166.06463400,InHIn400,HIn 400In --⨯=⨯⨯⨯⨯-=-=--εεc A c L /mol 1011.1L /mol )1053.11060.9(566In HIn ---⨯=⨯+⨯=+=-c c c x16. 某药物浓度为1.0×10−3mol/L ，在270nm 波长下测得吸光度为0.400，在345nm 波长下测得吸光度为0.010。