第二章可见紫讲义外外分光光度法
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紫外-可见分光光度法 (2)全
第二章 紫外-可见分光光度法 (Ultraviolet and Visible Spectrophotometry, UV-Vis)
2.1 紫外-可见吸收光谱 2.2 紫外-可见光度计仪器组成 2.3 吸收光谱的测量-----Lambert-Beer 定律(新增) 2.4 分析条件选择(新增) 2.5 UV-Vis分光光度法的应用
的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化E为各种形式能量变
化的总和：
ΔΕ ΔΕe ΔΕv ΔΕr
其中Ee最大：1-20 eV; Ev次之：0.05-1 eV; Er最小：0.05 eV
可见，电子能级间隔比振动能级和转动能级间隔大1~2个数量级， 在发生电子能级跃迁时，伴有振-转能级的跃迁，形成所谓的带状光谱。
用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，前者适于紫外区和 可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。
四、检测器：硒光电池、PMT、PDA
二、紫外可见光度计仪器 分光光度计分为单波
长和双波长仪器。
1. 单波长分光光度计 (a) 单光束 (b) 双光束（空间分隔） (c) 双光束（时间分隔）
如CH2=CH2的-*跃迁，max=165~200nm；而1,3-丁二烯， max=217nm 2）异构现象：使异构物光谱出现差异。
如 CH3CHO 含 水 化 合 物 有 两 种 可 能 的 结 构 ： CH3CHO-H2O 及 CH3CH(OH)2; 已烷中，max=290nm，表明有醛基存在，结构为前
不同物质结构不同或者说 其分子能级的能量(各种能级 能量总和)或能量间隔各异， 因此不同物质将选择性地吸收 不同波长或能量的外来辐射， 这是UV-Vis定性分析的基础。
定性分析具体做法是让不 同波长的光通过待测物，经待 测物吸收后，测量其对不同波 长 光 的 吸 收 程 度 ( 吸 光 度 A) ， 以吸光度A为纵坐标，辐射波 长为横坐标作图，得到该物质 的吸收光谱或吸收曲线，据吸 收曲线的特性(峰强度、位置 及数目等)研究分子结构。
2.1 紫外-可见吸收光谱 2.2 紫外-可见光度计仪器组成 2.3 吸收光谱的测量-----Lambert-Beer 定律(新增) 2.4 分析条件选择(新增) 2.5 UV-Vis分光光度法的应用
的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化E为各种形式能量变
化的总和：
ΔΕ ΔΕe ΔΕv ΔΕr
其中Ee最大：1-20 eV; Ev次之：0.05-1 eV; Er最小：0.05 eV
可见，电子能级间隔比振动能级和转动能级间隔大1~2个数量级， 在发生电子能级跃迁时，伴有振-转能级的跃迁，形成所谓的带状光谱。
用于盛放样品。可用石英或玻璃两种材料制作，前者适于紫外区和 可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。
四、检测器：硒光电池、PMT、PDA
二、紫外可见光度计仪器 分光光度计分为单波
长和双波长仪器。
1. 单波长分光光度计 (a) 单光束 (b) 双光束（空间分隔） (c) 双光束（时间分隔）
如CH2=CH2的-*跃迁，max=165~200nm；而1,3-丁二烯， max=217nm 2）异构现象：使异构物光谱出现差异。
如 CH3CHO 含 水 化 合 物 有 两 种 可 能 的 结 构 ： CH3CHO-H2O 及 CH3CH(OH)2; 已烷中，max=290nm，表明有醛基存在，结构为前
不同物质结构不同或者说 其分子能级的能量(各种能级 能量总和)或能量间隔各异， 因此不同物质将选择性地吸收 不同波长或能量的外来辐射， 这是UV-Vis定性分析的基础。
定性分析具体做法是让不 同波长的光通过待测物，经待 测物吸收后，测量其对不同波 长 光 的 吸 收 程 度 ( 吸 光 度 A) ， 以吸光度A为纵坐标，辐射波 长为横坐标作图，得到该物质 的吸收光谱或吸收曲线，据吸 收曲线的特性(峰强度、位置 及数目等)研究分子结构。
紫外-可见分光光度法
30.01mg→100ml 5→50ml 浓度为30.01ug/ml
E=A / C C为100ml溶液中所含被测物质的重量 （按干燥品或无水物计算），g
（C = 0.003001g ×（1-水分）/ 100ml)
二.鉴别: 按各该品种项下的规定，测定供试品
溶液在有关波长处的最大及最小吸收，有 的并须测定其各最大吸收峰值或最大吸收 与最小吸收的比值，均应符合规定。
在高精度的分析测定中（紫外区尤其 重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池 材料本身的吸光特征以及吸收池的光程长 度的精度等对分析结果都有影响。
玻璃吸收池因为能吸收紫外光，故只 能用于320nm以上的可见光区。
石英吸收池因不吸收紫外光而常用 于3０0nm以下的紫外光区，但也可用于 可见光区。
最常用的光路长度为: 1cm的吸收池。
表示方法：
（1）百分吸收系数（E）：
以
E 1% 1cm
表示。
E=A/C(%)×L(cm)
中国药典规定的吸收系数即为
E 1% 1cm
。
在用吸收系数法计算含量时，E11c%m 通常要
大于100
（2）摩尔吸收系数（ε）：
当溶液的浓度（C）为1mol/L,光路长 度（L）为1cm时，相应的吸光度为摩尔吸 收系数，以ε表示。
通常使用的紫外-可见分光光度计的工作波长 范围为190～900nm。
第二节 光吸收基本定律和吸收系数
1.光吸收基本定律： 比尔—郎伯（Beer—Lambert）定律
为光吸收基本定律，是分光光度分析的 理论基础。 Lambert于1730年提出了光 强度与吸收介质厚度的关系。1852年 Beer提出了光强度与吸收介质中吸光物 质浓度之间的关系。
光源为空心阴极灯。每种元素都 有各自的空心阴极灯，因此原子 吸收光谱是锐线光谱。
E=A / C C为100ml溶液中所含被测物质的重量 （按干燥品或无水物计算），g
（C = 0.003001g ×（1-水分）/ 100ml)
二.鉴别: 按各该品种项下的规定，测定供试品
溶液在有关波长处的最大及最小吸收，有 的并须测定其各最大吸收峰值或最大吸收 与最小吸收的比值，均应符合规定。
在高精度的分析测定中（紫外区尤其 重要），吸收池要挑选配对。因为吸收池 材料本身的吸光特征以及吸收池的光程长 度的精度等对分析结果都有影响。
玻璃吸收池因为能吸收紫外光，故只 能用于320nm以上的可见光区。
石英吸收池因不吸收紫外光而常用 于3０0nm以下的紫外光区，但也可用于 可见光区。
最常用的光路长度为: 1cm的吸收池。
表示方法：
（1）百分吸收系数（E）：
以
E 1% 1cm
表示。
E=A/C(%)×L(cm)
中国药典规定的吸收系数即为
E 1% 1cm
。
在用吸收系数法计算含量时，E11c%m 通常要
大于100
（2）摩尔吸收系数（ε）：
当溶液的浓度（C）为1mol/L,光路长 度（L）为1cm时，相应的吸光度为摩尔吸 收系数，以ε表示。
通常使用的紫外-可见分光光度计的工作波长 范围为190～900nm。
第二节 光吸收基本定律和吸收系数
1.光吸收基本定律： 比尔—郎伯（Beer—Lambert）定律
为光吸收基本定律，是分光光度分析的 理论基础。 Lambert于1730年提出了光 强度与吸收介质厚度的关系。1852年 Beer提出了光强度与吸收介质中吸光物 质浓度之间的关系。
光源为空心阴极灯。每种元素都 有各自的空心阴极灯，因此原子 吸收光谱是锐线光谱。
02-紫外可见分光光度法全
例：Cd2+浓度为140 umol ·L-1 ，双 硫腙法显色测定波长为520nm，液
层厚度2cm，吸光度为0.22，求 和
透光率T。
解： (1) A = b c
0.22 = 2 140 10-6
= 785.7 L ·mol-1 ·cm-1
(2) A =－lgT = 0.22 lgT = －0.22 T = 10－0.22 = 0.60 = 60%
（ε=200-2000L /（mol*cm ），如苯环。
（4） 210-250 nm有强吸收峰，表明可能含有2个共轭双键 ；在260nm,300 nm,330 nm有强吸收峰，说明是3个或3个以 上双键的共轭体系。
（5)若吸收峰延伸至可见光区，则可能是长链共轭或稠环 化合物
习题P46第21,22题
第三节 紫外可见分光光度法的定量分析 P9
照射分子，由于分子、原子或离子的能级是量子化的，不
连续的，只有光子的能量(h)与被照射物质粒子的基态和
激发态能量之差(E)相等时，才能被吸收。
△ E = h （ h为普朗克常数）
不同物质的基态和激发态的能量差不同，选择吸收光
子的能量也不同，即吸收的波长不同。
2、光的种类 P7
➢具有单一波长的光叫单色光，比如红，蓝光等。 ➢由不同波长的光组成的光叫复色光。比如日光等 ➢如两种适当颜色的单色光按适当的强度比例混合 能得到白光，则这两种颜色的光叫做互补色光。
A = K·b ·c
c：物质的量浓度(mol ·L-1) K:吸光系数。
b：为液层厚度(cm)
应用的条件：
入射光必须是单色光； 吸收发生在稀的均匀的介质中； 吸收过程中，吸收物质互相不发生作用。
3、吸光系数（K）
比色分析和紫外可见分光光度法
1、紫外可见分光光度法 （1）紫外分光光度法：利用物质分子对紫外光的 选择性吸收，用紫外分光光度计测定物质对紫外光的 吸收程度来进行定型、定量分析的方法。 波长范围：200～400nm。 （2）可见分光光度法：利用物质分子对可见光的 选择性吸收特性，用可见分光光度计测量有色溶液对 可见光的吸收程度以确定组分含量的方法，则称为可 见分光光度法。 波长范围：400～800nm。 紫外分光光度法和可见分光光度的区别在于测定 波长范围不同，通常合称为紫外、可见分光光度法。
a
t
图2-2 溶液对光的作用
（1）透光率T 透过光强度与入射光强度之比，用“T”表示， 即： T=（It / I0）×100% T越大，透光程度越大，对光的吸收就越小； T越小，有色溶液透光程度越小，对光的吸收程度 就越大。 （2）吸光度A 入射光强度I0与透过光强度It之比的对数称为吸 光度，用“A”表示，即： A=lg（I0/ It）=lg（1/T） I0/ It越大，有色溶液透光程度越小，对光吸收 程度越大；反之，I0 / It越小，有色溶液透光程度越 大，对光吸收程度越小。
光谱中400 ~ 800nm 范围内的光作 用于人的眼睛，能引起颜色的感觉，故 称可见光。不同波长的可见光引起不同 的视觉效果，从而产生不同颜色。白光 是由不同颜色的光按一定的强度比例混 合而成的；如果将一束平行的白光通过 棱镜，则白光分解为红、成、黄、绿、 青、蓝、紫七种色光，各种颜色的色光 其波长范围如图表所示。
第三节 朗伯-比耳定律
一、朗伯、比耳定律 1、透光率、吸光度 溶液吸收光的程度与溶液的性质、浓度、入射光 的强度、波长以及溶液液层厚度等因素有关。 一束平行光（单色光）通过溶液（或固体、气体） 时，一部分光被溶液反射，一部分光被溶液吸收，一 部分光透过溶液，如果入射光强度为I0 ，吸收光强度 为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir，那么， I0=Ia+It+Ir 在进行光度分析时，同一实验的各种溶液均采用 质料、大小、形状都相同的比色皿，故Ir相同，其影 响相互抵消，则： I0=Ia+It
a
t
图2-2 溶液对光的作用
（1）透光率T 透过光强度与入射光强度之比，用“T”表示， 即： T=（It / I0）×100% T越大，透光程度越大，对光的吸收就越小； T越小，有色溶液透光程度越小，对光的吸收程度 就越大。 （2）吸光度A 入射光强度I0与透过光强度It之比的对数称为吸 光度，用“A”表示，即： A=lg（I0/ It）=lg（1/T） I0/ It越大，有色溶液透光程度越小，对光吸收 程度越大；反之，I0 / It越小，有色溶液透光程度越 大，对光吸收程度越小。
光谱中400 ~ 800nm 范围内的光作 用于人的眼睛，能引起颜色的感觉，故 称可见光。不同波长的可见光引起不同 的视觉效果，从而产生不同颜色。白光 是由不同颜色的光按一定的强度比例混 合而成的；如果将一束平行的白光通过 棱镜，则白光分解为红、成、黄、绿、 青、蓝、紫七种色光，各种颜色的色光 其波长范围如图表所示。
第三节 朗伯-比耳定律
一、朗伯、比耳定律 1、透光率、吸光度 溶液吸收光的程度与溶液的性质、浓度、入射光 的强度、波长以及溶液液层厚度等因素有关。 一束平行光（单色光）通过溶液（或固体、气体） 时，一部分光被溶液反射，一部分光被溶液吸收，一 部分光透过溶液，如果入射光强度为I0 ，吸收光强度 为Ia，透过光强度为It，反射光强度为Ir，那么， I0=Ia+It+Ir 在进行光度分析时，同一实验的各种溶液均采用 质料、大小、形状都相同的比色皿，故Ir相同，其影 响相互抵消，则： I0=Ia+It
第二章 紫外-可见分光光度法
入射光通过溶液时，除一部分被吸光粒子吸收
外，还有部分因散射而损失，使透光度减小，
A实。所以往往发生正偏离。 • 化学因素引起的偏离 吸光物质常因离解、缔合而形成新化合物或 互变异构等化学变化而改变其浓度，导致了偏 离。例如 K2Cr2O7在水溶液中存在下列平衡：
2 2CrO4 Cr2O H 2O + 2 H 2 2 7 稀释或增大pH值 浓缩或减小pH值
如图所示，假设有一束强度为I0的单色平行
光，垂直通过一横面积为s的均匀介质。 当光强度为Ix的单色光通过
吸收层(db)后，光强度减弱
了dIx，则厚度为db的吸收
层对光的吸收率为-dIx/Ix，
另一方面，由于db为无限小，所以截面积上所有 吸光质点所占的面积之和(ds)与横截面积(s)之 比(ds/s)可视为该截面积上光子被吸收的几率， 即：-dIx/Ix=ds/s
降低由于单色光不纯造成负偏的方法： • 选择吸收曲线的max作入射光波长。因为吸收 曲线峰值顶部曲线较平坦，入射光谱带内各波长 的值相近。选择max，偏离光吸收定律较小。 只有当干扰物质存在并对待测物质的max产生
吸收时，才选择没干扰的其它波长作入射光波
长。
• 选择高分辨率仪器，使入射光波长范围尽可
5.传播速度c
c=· 单位：cm/s 二.微粒性 光的微粒性特征为：光由光子组成，而光子 具有能量，其能量与波长之间的关系为： E=h· =hc/ h—普朗克常数 6.626×10-34J· s 由上式可知，不同波长的光具有不同的能量， 波长愈长，光的能量愈低；反之，则愈高。
§2-2 分子光谱概述
若干个振动能级；在同一 电子能级和同一振动能级 中，因转动能量不同而分 为若干个转动能级。 若用E电、E振、E转分别表示三个能级， 则三者的关系为：E电＞E振＞E转。
外，还有部分因散射而损失，使透光度减小，
A实。所以往往发生正偏离。 • 化学因素引起的偏离 吸光物质常因离解、缔合而形成新化合物或 互变异构等化学变化而改变其浓度，导致了偏 离。例如 K2Cr2O7在水溶液中存在下列平衡：
2 2CrO4 Cr2O H 2O + 2 H 2 2 7 稀释或增大pH值 浓缩或减小pH值
如图所示，假设有一束强度为I0的单色平行
光，垂直通过一横面积为s的均匀介质。 当光强度为Ix的单色光通过
吸收层(db)后，光强度减弱
了dIx，则厚度为db的吸收
层对光的吸收率为-dIx/Ix，
另一方面，由于db为无限小，所以截面积上所有 吸光质点所占的面积之和(ds)与横截面积(s)之 比(ds/s)可视为该截面积上光子被吸收的几率， 即：-dIx/Ix=ds/s
降低由于单色光不纯造成负偏的方法： • 选择吸收曲线的max作入射光波长。因为吸收 曲线峰值顶部曲线较平坦，入射光谱带内各波长 的值相近。选择max，偏离光吸收定律较小。 只有当干扰物质存在并对待测物质的max产生
吸收时，才选择没干扰的其它波长作入射光波
长。
• 选择高分辨率仪器，使入射光波长范围尽可
5.传播速度c
c=· 单位：cm/s 二.微粒性 光的微粒性特征为：光由光子组成，而光子 具有能量，其能量与波长之间的关系为： E=h· =hc/ h—普朗克常数 6.626×10-34J· s 由上式可知，不同波长的光具有不同的能量， 波长愈长，光的能量愈低；反之，则愈高。
§2-2 分子光谱概述
若干个振动能级；在同一 电子能级和同一振动能级 中，因转动能量不同而分 为若干个转动能级。 若用E电、E振、E转分别表示三个能级， 则三者的关系为：E电＞E振＞E转。
第二章紫外-可见分光光度法(Ultraviolet-Visible
=40~80nm时，显色反应对比度为中等； 80nm时，显色反应具有较高的对比度。
一般要求显色剂与有色化合物的对比度 在60nm以上。
2. 对比度在实际分析测定中的意义 对比度实质上表示了显色反应颜色变化 的程度；反映了过量显色剂对测定体系的影 响。 如果显色反应的对比度大，则过量试剂 对测定的影响较小；反之，对比度小，则试 剂对测定的影响就比较大。
2.2 分子吸收光谱概述 1．分子吸收光谱产生的本质 在分子中，除了原子的核能En，质心在 空间的平动能Et外，还有电子运动能Ee，原 子之间的相对振动能Ev，以及分子转动能Er 等。 分子的总能量可写为： E=En + Et + Ee+ Ev+ Er
由于En在一般化学实验条件下不发生变 化，分子的平动能Et又比较小，因此当分子 能级发生跃迁时，能量的改变为： E=Ee + Er +Ev
而n→*、n→*和→*三种跃迁需要能
量相对较小，吸收峰位于近紫外区甚至可见 区，对于紫外-可见分析具有实用意义。
n→*、→*跃迁区别：
n→*（，10~
100L/mol· cm）跃迁产生的 吸收峰强度低于→*（，104L/ mol· cm）；
随着溶剂极性的增加，→*跃迁所产生的
c的单位为g· L-1，b的单位为cm时，κ以a表示，称为吸 光系数，其单位为L· g-1· cm-1， A=abc。
c的单位为mol· L-1，b的单位为cm，κ用ε表示，称为摩尔 吸光系数，其单位为L· mol-1· cm-1， A=εbc。
摩尔吸光系数ε的讨论：
（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数。 （2）不随浓度c和液层厚度b的改变而改变。 在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的 性质有关，与待测物浓度无关；
一般要求显色剂与有色化合物的对比度 在60nm以上。
2. 对比度在实际分析测定中的意义 对比度实质上表示了显色反应颜色变化 的程度；反映了过量显色剂对测定体系的影 响。 如果显色反应的对比度大，则过量试剂 对测定的影响较小；反之，对比度小，则试 剂对测定的影响就比较大。
2.2 分子吸收光谱概述 1．分子吸收光谱产生的本质 在分子中，除了原子的核能En，质心在 空间的平动能Et外，还有电子运动能Ee，原 子之间的相对振动能Ev，以及分子转动能Er 等。 分子的总能量可写为： E=En + Et + Ee+ Ev+ Er
由于En在一般化学实验条件下不发生变 化，分子的平动能Et又比较小，因此当分子 能级发生跃迁时，能量的改变为： E=Ee + Er +Ev
而n→*、n→*和→*三种跃迁需要能
量相对较小，吸收峰位于近紫外区甚至可见 区，对于紫外-可见分析具有实用意义。
n→*、→*跃迁区别：
n→*（，10~
100L/mol· cm）跃迁产生的 吸收峰强度低于→*（，104L/ mol· cm）；
随着溶剂极性的增加，→*跃迁所产生的
c的单位为g· L-1，b的单位为cm时，κ以a表示，称为吸 光系数，其单位为L· g-1· cm-1， A=abc。
c的单位为mol· L-1，b的单位为cm，κ用ε表示，称为摩尔 吸光系数，其单位为L· mol-1· cm-1， A=εbc。
摩尔吸光系数ε的讨论：
（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数。 （2）不随浓度c和液层厚度b的改变而改变。 在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的 性质有关，与待测物浓度无关；
紫外可见分光光度法课件
第二章 紫外-可见分光光度法
1
紫外-可见分光光度法
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱（UV-VIS光谱）
• 起源：价电子能级跃迁 由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分
子中价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生。 紫外光谱—又称为电子光谱—分子吸收光谱
问题1：为何UV-Vis光谱吸收带都比较宽??
pH值降低（加酸）→ E2、B带蓝移，ε减
pH值增大（加碱）→E2、B带红移，ε增大
6
第二节 紫外可见分光光度计
• 仪器校正
1、波长校正
• 苯的吸收峰校正波长（紫外光区）。在25ml容量瓶内，滴入一滴苯(A.R.)， 用无水乙醇稀释至刻度，摇匀后，以无水乙醇为空白，在200～280nm间用 lcm石英池测定吸收度。 如下： 229.2 233.5 238.9 243.2 248.5 254.5 260.6 268.4
图8-4 (+)和(-)丁醇-2的ORD谱线
2）发色团(如羰基) R带：270 nm 。ORD曲线在此处越过零点，进入另一个相
区。形成的一个峰和一个谷组成的ORD谱线—Cotton效应谱线 正的Cotton效应：当波长由长波一端向短波一端移动时， ORD谱线由峰向谷变化 负的Cotton效应： ORD谱线由谷向峰变化 ORD谱线与零线相交点的波长称为λK
2.3.1 蛋白质的圆二色性
在蛋白质或多肽中，主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键， 芳香氨基酸残基及二硫桥键。当平面圆偏振光通过这些光活性的 生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的 吸收不相同，产生吸收差值。由于这种吸收差的存在， 造成了偏 振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质 的圆二色性。
1
紫外-可见分光光度法
第一节 基本原理
一、紫外-可见吸收光谱（UV-VIS光谱）
• 起源：价电子能级跃迁 由于分子吸收紫外-可见光区的电磁辐射，分
子中价电子（或外层电子）的能级跃迁而产生。 紫外光谱—又称为电子光谱—分子吸收光谱
问题1：为何UV-Vis光谱吸收带都比较宽??
pH值降低（加酸）→ E2、B带蓝移，ε减
pH值增大（加碱）→E2、B带红移，ε增大
6
第二节 紫外可见分光光度计
• 仪器校正
1、波长校正
• 苯的吸收峰校正波长（紫外光区）。在25ml容量瓶内，滴入一滴苯(A.R.)， 用无水乙醇稀释至刻度，摇匀后，以无水乙醇为空白，在200～280nm间用 lcm石英池测定吸收度。 如下： 229.2 233.5 238.9 243.2 248.5 254.5 260.6 268.4
图8-4 (+)和(-)丁醇-2的ORD谱线
2）发色团(如羰基) R带：270 nm 。ORD曲线在此处越过零点，进入另一个相
区。形成的一个峰和一个谷组成的ORD谱线—Cotton效应谱线 正的Cotton效应：当波长由长波一端向短波一端移动时， ORD谱线由峰向谷变化 负的Cotton效应： ORD谱线由谷向峰变化 ORD谱线与零线相交点的波长称为λK
2.3.1 蛋白质的圆二色性
在蛋白质或多肽中，主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键， 芳香氨基酸残基及二硫桥键。当平面圆偏振光通过这些光活性的 生色基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的 吸收不相同，产生吸收差值。由于这种吸收差的存在， 造成了偏 振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质 的圆二色性。
第二章 紫外-可见分光光度法
分子吸收电磁辐射而发生电子能级间的跃 迁和振动能级间的跃迁时，总伴有转动能 级间的跃迁。由于转动能级间隔太小，一 般光谱仪的分辨能力不足以把这些谱线分 开，诸谱线便连成一片，表现为带状。所 以，分子吸收光谱时一种带状光谱。
Instrumental Analysis
16
Huaihua University Chemistry and chemical egineering Department
在分子中，除了原子的核能En，质心在空 间的平动能Et外，还有电子运动能Ee，原子 之间的相对振动能Ev以及分子转动能Er等。 分子的总能量可写为： E=En + Ee+ Ev+ Er+ Et 由于En在一般化学实验条件下不发生变化， 分子的平动能Et又比较小，因此当分子能 级发生跃迁时，能量的改变为： DE=DEe + DEr +DEv
紫外-可见分光光度法优点： 较高的灵敏度； 较好的准确度； 选择性好； 操作简便、快速； 仪器设备简单、价格低廉。
Instrumental Analysis
3
Huaihua University Chemistry and chemical egineering Department
10-2 nm 10 nm
1.远紫外（真空紫外）吸收带
烷烃化合物的吸收带，如C-C、C-H基团中，为s→s*跃迁，λmax < 170nm，范围在10-
200nm。
2.末端吸收带
饱和卤代烃、胺或杂原子的单键化合物的吸收带，为n→s*跃迁，其范围从远紫外区末端
到近紫外区，在200nm附近。
3.R带
共轭分子的含杂原子基团的吸收带，如C=O，N=O，NO2，N=N等。为n→p*跃迁，弱吸 收带， emax<100 ，随溶剂极性增加，R带会发生蓝移，附近如有强吸收带，R带有时会红 移。
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第二章可见紫外外分光光度法
精品
吸光光度法的基本原理
颜色的产生白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光
能复合成白光的两种颜色的光叫互
补色光。物质所显示的颜色是吸 收光的互补色。
一、光的基本性质
光的波长λ(cm)、频率 γ (Hz) ，它们与光速c的 关系是：
c
在真空介质中，光速为2.9979×1010cm/s。单个 光子能吸收或发射能量时，能量E与上述三要素的关
紫外区：氢、氘灯。 发射185～400 nm的连 续光谱。
2.单色器（波长选择器）
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任 波长单色光的光学系统。
①入射狭缝：光源的光由此进入单色器； ②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； ③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；
④聚焦装置：透镜或 凹面反射镜，将分光 后所得单色光聚焦至 出射狭缝；
第二节 紫外可见分 光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
一、基本组成
general process
光源
单色器
样品室
检测器
显示
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具 有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
可见光区：钨灯作 为光源，其辐射波长范 围在320～2500 nm。
E h h c
分子能级跃迁
分子能级跃迁较原子 能级跃迁更为复杂。 分子内部除了电子运 动状态外，还有核间 的相对运动，即核的 振动和分子围绕着重 心的转动。
E E v E r E e
振动能变化、转动能变化以及电子运动能量变化
有色溶液的颜色为什么会有深浅？
1、同一种物质对不同波长的光吸收能力是 否存在差异？
目视比色法 光电比色法 分子吸收分光光度法（分光光度分析法）
分光光度分析法是以物质对光的选 择性吸收为基础的分析方法。
根据物 质所吸 收光的 波长范 围不同
可见分光光度法 紫外分光光度法
几乎所有的无 机离子和许多有机 化合物可以用分光 光度法进行测定。 如微生物培养基中 的氮、磷以及各种 微量元素的测定。
系是： E h h c
E－－光子的能量；h－－普朗克常数（6.625×10－34J·s）
二、能级与跃迁
分子中的电子总是处在某 一运动状态中，每一种状 态都具有一定的能量，属 于一定能级。当它得到时， 电子由于受到光、热、电 等的激发，得到适当的能 量，从一个能级转移到另 一个能级，称为跃迁。
3.双波长
将不同波长的两束单色光(λ1、λ2) 快束交替通过同一 吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△=
1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。
A 原理
双光束光度计动画示意
动画
双波长光度计光路示意图
四、光的吸收定律
1.朗伯—比耳定律
• 布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和 1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。
2、不同的物质对相同波长的光的吸收是否 存在差异？
分子只会选择吸收满足能级差能量的波长
各种分子内部结构不同，分子的能级也千 差万别，各种能级之间的间隔也互不相同， 这样就决定了它们对不同波长的光线的选 择性吸收。
吸收曲线
反映了它在不同的光谱区域内 吸收能力的分布，可以从波形， 波峰的强度、位置及数目来了
• 1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物
浓度之间也具有类似的关系。A∝c
朗伯定律：A=K2*L
比尔定律：A=K3*C
透过光的强度It；与入射光的强 度Io比之比称为透光度或透光率， 用T表示。 T＝ It / Io
朗伯-比尔定律的表达式 A＝lg（I0/It)= kL c 式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；
通常，待测物质的 含量1～10－5％时， 能够用分光光度法 准确测定。所以它 主要用于测定微量 组分。
分光光度分析法：
光源
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
单色器
样品
检测器
基于发射的电磁辐射与待测物质相互作
用后所产生的辐射信号与物质组成及结构
关系所建立起来的分析方法。
基本特点：
1、一般光分析法均包含三个基本过程； （1）能源提供能量； （2）能量与被测物之间的相互作用； （3）产生信号。 2、选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色 谱分析）； 3、涉及大量光学元器件。
L：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位mol·L－１； k：摩尔吸光系数，单位L·mol－１·cm－１； 或: A＝lg（I0/It)= a L c c：溶液的浓度，单位g·L－１
a：吸光系数，单位L·g－１·cm－１ a与k的关系为：
⑤出射狭缝。
光栅 和棱 镜分 光原 理
3.样品室
样品室放置各种类型的吸收池 （比色皿）和相应的池架附件。吸 收池主要有石英池和玻璃池两种。 在紫外区须采用石英池，可见区一 般用玻璃池。
4.检测器
利用光电效应将透过吸收池的 光信号变成可测的电信号，常用的 有光电池、光电管或光电倍增管。
5. 结果显示记录系统
检流计、数字显示、微机进行 仪器自动控制和结果处理
二、分光光度计的类型
1.单光束
简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度， 一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高 的稳定性。
2.双光束
自动记录，快速全波段 扫描。可消除光源不稳定、 检测器灵敏度变化等因素的 影响，特别适合于结构分析。 仪器复杂，价格较高。
（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线 形状相似λmax不变。
（3）而对于不同物质，它们的吸收曲线形状 不同。
（4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在
λmax处吸光度A 的差异最大。
（5）吸光度具有加和性，A = A1 + A2 + A3 + ……。
三、比色法
通过显色反应，比较待测溶液与标准溶液 颜色的深浅来确定待测物质的含量为比色 法。
解物质内部信息
改变通过某一吸收物 质的入射光的波长， 并记录某物质在每一
波长处的吸光度 （A），然后以波长 为横坐标，以吸光度 为纵坐标作图，这样
的谱图称为该物质的 吸收光谱或吸收曲线。
叶绿素的结构和吸收光谱
吸收曲线的讨论
（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不 同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长 λmax
精品
吸光光度法的基本原理
颜色的产生白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光
能复合成白光的两种颜色的光叫互
补色光。物质所显示的颜色是吸 收光的互补色。
一、光的基本性质
光的波长λ(cm)、频率 γ (Hz) ，它们与光速c的 关系是：
c
在真空介质中，光速为2.9979×1010cm/s。单个 光子能吸收或发射能量时，能量E与上述三要素的关
紫外区：氢、氘灯。 发射185～400 nm的连 续光谱。
2.单色器（波长选择器）
将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任 波长单色光的光学系统。
①入射狭缝：光源的光由此进入单色器； ②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； ③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；
④聚焦装置：透镜或 凹面反射镜，将分光 后所得单色光聚焦至 出射狭缝；
第二节 紫外可见分 光光度计
仪器
紫外-可见分光光度计
一、基本组成
general process
光源
单色器
样品室
检测器
显示
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具 有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
可见光区：钨灯作 为光源，其辐射波长范 围在320～2500 nm。
E h h c
分子能级跃迁
分子能级跃迁较原子 能级跃迁更为复杂。 分子内部除了电子运 动状态外，还有核间 的相对运动，即核的 振动和分子围绕着重 心的转动。
E E v E r E e
振动能变化、转动能变化以及电子运动能量变化
有色溶液的颜色为什么会有深浅？
1、同一种物质对不同波长的光吸收能力是 否存在差异？
目视比色法 光电比色法 分子吸收分光光度法（分光光度分析法）
分光光度分析法是以物质对光的选 择性吸收为基础的分析方法。
根据物 质所吸 收光的 波长范 围不同
可见分光光度法 紫外分光光度法
几乎所有的无 机离子和许多有机 化合物可以用分光 光度法进行测定。 如微生物培养基中 的氮、磷以及各种 微量元素的测定。
系是： E h h c
E－－光子的能量；h－－普朗克常数（6.625×10－34J·s）
二、能级与跃迁
分子中的电子总是处在某 一运动状态中，每一种状 态都具有一定的能量，属 于一定能级。当它得到时， 电子由于受到光、热、电 等的激发，得到适当的能 量，从一个能级转移到另 一个能级，称为跃迁。
3.双波长
将不同波长的两束单色光(λ1、λ2) 快束交替通过同一 吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。△=
1～2nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。
A 原理
双光束光度计动画示意
动画
双波长光度计光路示意图
四、光的吸收定律
1.朗伯—比耳定律
• 布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和 1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。
2、不同的物质对相同波长的光的吸收是否 存在差异？
分子只会选择吸收满足能级差能量的波长
各种分子内部结构不同，分子的能级也千 差万别，各种能级之间的间隔也互不相同， 这样就决定了它们对不同波长的光线的选 择性吸收。
吸收曲线
反映了它在不同的光谱区域内 吸收能力的分布，可以从波形， 波峰的强度、位置及数目来了
• 1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物
浓度之间也具有类似的关系。A∝c
朗伯定律：A=K2*L
比尔定律：A=K3*C
透过光的强度It；与入射光的强 度Io比之比称为透光度或透光率， 用T表示。 T＝ It / Io
朗伯-比尔定律的表达式 A＝lg（I0/It)= kL c 式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；
通常，待测物质的 含量1～10－5％时， 能够用分光光度法 准确测定。所以它 主要用于测定微量 组分。
分光光度分析法：
光源
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
单色器
样品
检测器
基于发射的电磁辐射与待测物质相互作
用后所产生的辐射信号与物质组成及结构
关系所建立起来的分析方法。
基本特点：
1、一般光分析法均包含三个基本过程； （1）能源提供能量； （2）能量与被测物之间的相互作用； （3）产生信号。 2、选择性测量，不涉及混合物分离（不同于色 谱分析）； 3、涉及大量光学元器件。
L：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位mol·L－１； k：摩尔吸光系数，单位L·mol－１·cm－１； 或: A＝lg（I0/It)= a L c c：溶液的浓度，单位g·L－１
a：吸光系数，单位L·g－１·cm－１ a与k的关系为：
⑤出射狭缝。
光栅 和棱 镜分 光原 理
3.样品室
样品室放置各种类型的吸收池 （比色皿）和相应的池架附件。吸 收池主要有石英池和玻璃池两种。 在紫外区须采用石英池，可见区一 般用玻璃池。
4.检测器
利用光电效应将透过吸收池的 光信号变成可测的电信号，常用的 有光电池、光电管或光电倍增管。
5. 结果显示记录系统
检流计、数字显示、微机进行 仪器自动控制和结果处理
二、分光光度计的类型
1.单光束
简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度， 一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高 的稳定性。
2.双光束
自动记录，快速全波段 扫描。可消除光源不稳定、 检测器灵敏度变化等因素的 影响，特别适合于结构分析。 仪器复杂，价格较高。
（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线 形状相似λmax不变。
（3）而对于不同物质，它们的吸收曲线形状 不同。
（4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有差异，在
λmax处吸光度A 的差异最大。
（5）吸光度具有加和性，A = A1 + A2 + A3 + ……。
三、比色法
通过显色反应，比较待测溶液与标准溶液 颜色的深浅来确定待测物质的含量为比色 法。
解物质内部信息
改变通过某一吸收物 质的入射光的波长， 并记录某物质在每一
波长处的吸光度 （A），然后以波长 为横坐标，以吸光度 为纵坐标作图，这样
的谱图称为该物质的 吸收光谱或吸收曲线。
叶绿素的结构和吸收光谱
吸收曲线的讨论
（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不 同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长 λmax