Waters HILIC Atlantis BEH XBridge色谱柱特性与方法建立
HILIC色谱柱介绍
亲水作用色谱（HILIC）是近年来色谱领域研究的热点之一。
本文简介了HILIC的起源、定义、分离特点；比较了HILIC和反相色谱（RPLC）的选择特性，讨论了HILIC与质谱联用技术的特点，并对其使用中的注意事项进行了总结。
1.HILIC的概念亲水色谱（HILIC）是一种用来改善在反相色谱中保留较差的强极性物质保留行为的色谱技术。
它通过采用强极性固定性，并且结合高比例有机相/低比例水相组成的流动相来实现这一目的。
而这样的流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（ESI-MS）的灵敏度。
2.HILIC的分离机制HILIC的分离机理在目前还存在着争议，主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换（3）偶极-偶极相互作用。
更多的试验现象则表明HILIC的保留机理包含氢键作用、偶极作用和静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来。
3.HILIC影响保留的主要因素普遍认为HILIC保留行为受到多种参数的影响，如固定相的官能团、有机改性剂的含量、流速、柱温、流动相缓冲体系的pH值、缓冲盐的种类和浓度。
影响样品在固定相上的保留行为的最主要因素都是流动相中有机相的比例，例如乙腈的含量的增加会显著增加样品的保留因子。
在HILIC分离模式中，溶剂洗脱能力由弱到强为：四氢呋喃<丙酮<乙腈<异丙醇<乙醇<甲醇<水,流动相中水是最强的洗脱溶剂。
一般采用乙腈-水体系作为流动相，其中水相的比例为5%-40%以保证其显著的亲水作用。
如图1所示，将流动相中的水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性的减小，待测物在柱上的保留就会增强。
Figure1.HILICretentionasafunctionofpolarmodifier.100mmlengthACQUITYUPLC BEHHILICcolumn.Peaks:1=methacrylicacid,2=cytosine,3=nortriptyline,4= nicotinicacid.4.HILIC与RP-HPLC的比较传统的反相色谱（RPLC）对强极性和亲水性的小分子物质的保留和分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例的水相才能实现其保留，然而高比例的水相会导致一系列问题，比如固定相的反浸润和ESI-MS灵敏度的下降。
色谱柱技术
流样动品相:阿:米6替5/林35 甲醇/20mM磷酸盐溶液pH7.0
©2011 Waters Corporation
12
内容提要
Waters色谱柱发展历史及分类简介 超纯硅胶色谱柱平台简介
— HSS, SunFire, Symmetry
杂化颗粒色谱柱平台简介
— BEH, XBridge, XTerra
离子交换作用
O-Si
O-Si
O- (CH ) H+N OO-S- i 3 2
O-Si
O-Si
O-Si OO--Si
O-Si
当p带离H流负)﹥动电5时相性,为(硅大醇部基解
Base 对物严碱的重性保拖化留尾合及
两实验使用相同的传统C8硅胶柱
©2011 Waters Corporation
8
如何解决碱性化合物和螯合物的峰形问题?
极性化合物色谱柱平台简介
— 反相保留机理举例 — HILIC保留机理举例
新！CSH技术介绍
©2011 Waters Corporation
13
高纯硅胶柱可用于解决您 所有的应用难题吗?
©2011 Waters Corporation
14
是否遇到这样的问题？
分磷离酸三钠环缓类冲抗液忧(pH郁7剂, 时50色°谱C)峰为形流随动时相间的变化
— 反相保留机理举例 — HILIC保留机理举例
新！CSH技术介绍
©2011 Waters Corporation
2
Waters 现代色谱柱一览
超纯硅胶色谱柱
ACQUITY UPLC HSS C18/C18 SB HPLC HSS SunFire™ Symmetry® SymmetryShield
XBridge BEH C4蛋白专用色谱柱说明书
XBridge BEH C 4, 300Å, 3.5, 5和10 µm 蛋白专用色谱柱能为生物大分子提供出色的峰形、极高的效率和良好的回收率，而这类生物大分子对于较小孔径或较长链键合相的色谱柱来说太大或疏水性太强而无法实现分离。
对填料基质和键合相的选择是为了在高pH 和低pH ，以及高温下均能提供出色的稳定性。
XBridge BEH C 4, 300Å蛋白专用填料在通过cGMP 和ISO9002认证的工厂采用超纯试剂制造而成。
每批XBridge BEH C 4反相蛋白专用色谱柱填料均已使用蛋白测试混合物进行鉴定，采用窄范围的技术指标进行质量控制，确保色谱柱的重现性能。
每一根色谱柱的柱效都进行了单独测试，并且每根色谱柱随附有性能测试色谱图以及合格证书。
II. 入门指南 a. 色谱柱安装b. 色谱柱平衡c. 初始柱效测定d. 对新色谱柱进行基准检查的 实用性功能测试III. 色谱柱使用 a. 样品制备b. pH 操作限值c. 溶剂d. 压力e. 温度IV. 缩放分离V. 故障排除VI. 色谱柱清洗、再生和储存a. 清洗与再生b. 储存 VII. 将色谱柱连接到HPLCa. 色谱柱接头和系统管路注意事项b. 测量系统谱带展宽体积 VIII. 测量梯度系统体积(或驻留体积)[ 维护和使用手册 ]II. 入门指南每根XBridge BEH C4蛋白专用色谱柱均具有合格证书和性能测试色谱图。
合格证书为每批填料所特有，包括批号、未键合颗粒和键合颗粒的分析，以及色谱结果和检测条件。
性能测试色谱图为每根色谱柱特有，其中包含以下信息：批号、色谱柱序列号、USP理论塔板数、USP拖尾因子、保留因子和色谱条件。
这些数据应当保存以备将来参考。
a. 色谱柱安装注：下述步骤给出的流速用于4.6 mm内径色谱柱的典型3.5 ìm填料。
请根据将要安装的色谱柱内经，相应地按比例升高或降低流速。
waters xbridge protein beh色谱柱使用说明
waters xbridge protein beh色谱柱使用说明1. 引言1.1 概述在生物医学研究和制药领域中，蛋白质是至关重要的研究对象。
为了更好地理解蛋白质的结构和功能，科学家们需要利用高效的色谱柱来进行分离和纯化。
Waters XBridge Protein BEH色谱柱作为一种先进的工具，能够提供快速、高效、稳定的蛋白质纯化解决方案。
1.2 文章结构本文将对Waters XBridge Protein BEH色谱柱进行详细介绍，并提供使用说明和操作技巧。
首先，我们将概述该色谱柱的基本情况，包括其结构和特点。
接着，我们将讨论该色谱柱的工作原理，并阐述其在不同应用领域中的优势和适用性。
然后，我们将详细介绍如何准备样品并装载到色谱柱中，以及如何设置合适的色谱条件来实现最佳分离效果。
最后，我们将介绍一些注意事项、常见问题解答以及安全须知与储存要求。
通过阅读本文，读者能够全面了解Waters XBridge Protein BEH色谱柱的使用方法，并能够在实验中取得准确可靠的结果。
1.3 目的本文旨在向用户提供关于Waters XBridge Protein BEH色谱柱的详细说明，帮助用户正确并高效地使用该色谱柱进行蛋白质纯化。
我们希望通过本文的阐述，读者能够深入了解该色谱柱的特点和应用领域，并能够根据具体实验需求，熟练掌握样品准备、色谱条件设置以及数据分析与结果解读等技巧，从而为自己的科研工作或制药生产提供有力支持。
2. Waters XBridge Protein BEH色谱柱2.1 色谱柱概述：Waters XBridge Protein BEH色谱柱是一种高性能液相色谱（HPLC）柱，主要用于蛋白质和肽段的分离和纯化。
该色谱柱具有独特的粒径和孔隙结构，能够提供出色的分离效果和样品回收率。
2.2 工作原理：Waters XBridge Protein BEH色谱柱采用亲水性强的氢化硅胶作为填料材料，通过调节流动相中溶剂成分和温度等条件，实现对不同蛋白质和肽段的选择性分离。
3-HPLC 色谱柱介绍
色谱柱使用保养知识
©2014 Waters Corporation
3
内容
色谱柱应用基础 HPLC色谱柱介绍
色谱柱使用保知识
©2014 Waters Corporation
4
高效液相色谱柱简介
色谱柱是一根填满填料的管子
柱管的材料(塑料,玻璃,不锈钢…)和尺寸(内径,长短)不尽相同
Waters HPLC色谱柱
©2014 Waters Corporation
1
Waters 色谱柱发展历史
ACQUITY UPLC® BEH Amide ACQUITY UPLC® BEH Glycan XBridge Amide XSelect HSS HPLC Columns ACQUITY UPLC® HSS Cyano & PFP columns XSelectTM HSS Cyano & PFP columns XP 2.5 µm Columns
管内的填料更是种类繁多,主要分为三大类 – 硅胶基质 – 聚合物基质 – 无机和有机硅胶杂化基质 色谱柱的性能主要取决于填料的性质和填充技术
©2014 Waters Corporation
5
硅胶颗粒的形状
不规则形状 (Irregular)
– 大硅胶颗粒研磨，筛分
– 不粒尺寸和表面积限制
有机基质 (高聚物)
杂化颗粒技术(具硅-碳键机制)
©2014 Waters Corporation 30
第一代杂化颗粒的合成过程
Waters 专利技术 荣获2000年全球 R&D 100 大奖
硅甲基嵌入型聚乙氧基 硅烷 (MPEOS)
©2014 Waters Corporation
液相色谱柱使用原则和waters超高压柱特点
液相色谱柱使用原则和waters超高压柱特点1、何谓常规反相色谱柱？那些在硅胶或杂化基质颗粒上键合了如C18、C8、C4或苯基等键合相的色谱调料所装的色谱柱，按反相色谱条件进行操作和分离。
反相是液相色谱中最常使用的分离模式，而C18柱是最常使用的反相色谱柱之一。
2、新色谱柱开启和安装的推荐步骤：1、使用新鲜洁净的水与乙腈。
冲洗系统，确保系统干净，不含任何缓冲盐和污染物。
2、取用色谱柱时避免磕碰掉落。
3、将色谱柱入口端接到系统上，柱出口端先不要连接，色谱柱身上有箭头表明正确流向。
4、在0.1mL/min流速条件下用纯乙腈润洗色谱柱，然后在2分钟内将流速升至0.5mL/min。
5、当溶剂均匀的从柱出口端流出，停流速，将色谱柱出口端接到系统检测器上（这样可以避免气泡进入检测系统，并且可快速达到基线平衡）。
6、重启流速，按照步骤4的方法逐渐提高流速，至常规分析时所使用的流速。
7、参考柱效测试报告中的方法，使用该流动相条件平衡色谱柱，通常需要使用5-10倍柱体积的流动相，直至压力与基线稳定。
8、测试柱效。
注：1、当使用2.1mm内径色谱柱时，建议优化系统以减少谱带展宽，包括：使用检测器微量流通池，减少进样器loop环体积，使用较小内径（如0.005或0.12mm）的系统管路。
确保管路与色谱柱连接恰当，无死体积。
2、当使用小颗粒填料（如2.5um）短柱进行高效快速分离时，需要考虑一下因素：1）、确保管路与色谱柱连接恰当、无死体积，尽量优化系统减少谱带展宽；2）、提高采样频率至10点/秒以上；3）、较小粒径的色谱柱产生的柱压较高，而较小粒径要达到最优色谱效率所需的线速度较高，请根据所用LC系统的实际情况条件流速；4）、可使用较高的柱温来补偿小颗粒造成的压力升高，例如40℃。
使用杂化颗粒反相色谱柱时，可使用45℃或者更高。
3、进行实际样品分析的推荐步骤：1、确保流动相洁净，每隔24-48小时就应新配水相流动相，并同时更换或仔细清洗流动相溶剂瓶，以避免流动相长菌。
Waters XBridge XP和 或XBridge Premier BEH色谱柱维护和使用手
1目录I. 简介II. 入门指南III.色谱柱使用a. 样品制备b. pH 范围c. 溶剂d. 压力e. 温度IV. 色谱柱清洗、再生和存放V.eCord 智能芯片技术 VI.其他信息VII.注意事项I. 简介非常感谢您选择Waters™ XBridge™ XP 和/或XBridge Premier BEH 色谱柱。
XBridge BEH 填料由通过cGMP 和ISO 9001认证的工厂使用超纯试剂生产。
每批XBridge BEH 填料均采用酸性、碱性和中性分析物进行了色谱分析测试，并依据窄范围的技术指标进行质量控制，确保色谱柱具有可重现的理想性能。
每根色谱柱都经过单独测试，并由eCord™智能芯片提供性能色谱图和批次分析证书。
XBridge Premier BEH 色谱柱提供带或不带VanGuard™完全集成技术[FIT]保护柱两种规格。
VanGuard FIT 保护柱专为延长分析柱使用寿命而设计，可防止不需要的样品基质或颗粒物进入色谱柱，而不会影响分离性能。
保护柱可轻松更换，以便恢复分离性能，延长分析柱的使用寿命。
此外，XBridge Premier BEH 色谱柱采用创新的MaxPeak™高性能表面技术，能够尽量减少分析物/表面相互作用，避免可能因此造成的样品损失，从而提高分析物回收率、分析灵敏度和重现性。
XBridge XP 和XBridge Premier 2.5 µm BEH 色谱柱a. eCord 安装b. 色谱柱安装c. 色谱柱平衡d. 初始柱效测定e. 色谱柱QR 码f. XBridge XP 色谱柱 - VanGuard 保护柱g. VanGuard FIT 保护柱a. 清洗与再生b. 存放a. 简介b. 安装c. 生产信息d. 色谱柱使用信息a. 延长ACQUITY BEH 色谱柱 使用寿命的技巧b. BEH HILIC 色谱柱入门c. BEH Amide 色谱柱入门II. 入门指南每根XBridge BEH 色谱柱的色谱柱包装盒或eCord 智能芯片中都随附COA 报告和性能测试色谱图。
waters色谱柱-XBridge 色谱柱
XBridge™色谱柱专门为液相色谱方法开发和快速纯化而设计，用户能够在整个pH范围内使用种类多样的流动相体系和很宽的温度范围进行方法开发，从而建立稳定耐用的分析方法。
XBridge OBD™制备色谱柱在高pH条件下分离和纯化碱性化合物能够得到更高的纯度，并且上样量可提高几十倍。
XBridge色谱柱具有非常稳定的性能和更长的寿命，即使在最苛刻的条件下。
它采用革命性的创新技术生产，而且按照行业内最严苛的质量标准进行质量控制，因此成为用户针对挑战性色谱分离的值得信赖的解决方案。
XBridge色谱柱具有如下优势
∙HPLC方法无间隙转换到UPLC®
∙极端pH条件下的更长的寿命和可靠性
∙OBD制备柱的卓越性能
XBridge 色谱柱的特性参数。