第四章 性别控制技术

1959年Welshons和Jacobs等提出Y染色体决定雄性的理论， 引起了人们从染色体上寻找性别决定基因。 1966年，Jacobs等发现雄性决定因子位于Y染色体短臂上 1989年，Palmer等找到了Y染色体上的性别决定区(sex determining region of the Y chromosome，SRY)，它 的长度为35kb，编码79个氨基酸，在不同哺乳动物中有很 强的同源性。SRY序列的发现是哺乳动物性别决定理论的 重大突破。目前，用分子生物学方法确定胚胎细胞中是否 存在SRY基因来鉴定胚胎性别的技术已进入实际应用阶段。
可增强良种选育中的选择强度，加快遗传
改良的进度；
可以排除畜群中有害基因或不理想的基因
（如避免患有伴性遗传疾病后代的出生）。
四、性别控制的方法



主要两方面，一是受精之前，二是受精 之后。 受精前的性别控制 胚胎的性别鉴定 胎儿出生前的性别鉴定 生物技术
（一）受精前的性别控制
精子的分离 调节授精环境的pH值 控制授精时间
3、免疫磁珠技术
流式细胞分离法


流式细胞术（flow cytometry，FCM）是 近年迅速发展起来的细胞或细胞颗粒定 量分析和进行细胞分类研究的新技术。 流式细胞仪（flow cytometer）又称荧 光激活细胞分类器（FACS）是流体喷射 技术、激光光学技术、电子技术和计算 机技术综合性的高科技产品。
调节授精环境的pH值



Ｙ精子对疲劳和酸的耐受力较差。 向前等(1996)用pH7.2的精液人工授精，结果产公犊 72.3%，pH6.8产公犊39.1%。 段恩奎等(1991)在兔输精前经阴道输入不同浓度和 构型精氨酸改变生殖道pH，结果后代雌性比率与浓 度无关，而与pH有关，pH5.22雌兔率为39.1%， pH9.83雌兔率为61.90%,但与正常性比率差异不显著。 近几年来，有许多人做此方面的实验，有成功的报 道，也有否定的观点。
2、染色体组型鉴定法



经典胚胎性别鉴定方法。 (1) 采集胚胎细胞样品；(2) 专门训练有 素的技术人员；(3)费时。 2名有经验的技术人员约需5小时才能鉴定 12-15枚胚胎。 难以应用于生产之中，只能主要用来验证 其它性别鉴定方法的准确率。


操作过程 :先取少量的胚胎细胞，在含有秋 水仙素的培养液中培养，使细胞的有丝分裂 停留在中期； 用低渗溶液使细胞膨胀，细胞膜破裂释放染 色体，然后固定，用姬姆萨染色后在显微镜 下观察。由于有丝分裂被阻滞在中期，故染 色体缩短，形状规则，并有特异的带型。
（二）胚胎的性别鉴定

性染色质鉴定法 染色体组型鉴定法 Ｘ连锁酶活力测定法 雄性特异抗原鉴定法 SRY-PCR鉴定法 LAMP
早期胚胎分割方法

毛细管吹吸法 2到8-细胞期卵裂球（有的是16细胞，应在 致密化之前）
显微手术法


取囊胚的滋养层细胞或桑椹胚部分细胞



该法所获得的首例成活后代是经子宫内手术授 精出生的兔子。 英国剑桥动物生物有限公司最早于1993年开展 用分离精子进行牛IVF研究并获得成功。 分离精子的速度很慢 相对于人工授精的输精量（一千万个精子）而 言，它的分离速度太慢，每小时只能分离35万 个精子（2001年数据）。
流式细胞分离法


Commercial Sperm Sorting Facility, UK
MoFlo® SX
XY Inc. Fort Collins, CO
流式细胞分离法发展前景


随着分离精子速度的提高，将来可以提供足够数量的 用于人工授精的分离精子。例如，Beltsville公司利 用新型的精子分离专用喷嘴来提高精子分离速度。在 分离纯度为90％时，每小时可分离精子6百万个；如果 纯度只是要求在75％～80％，那么速度可达到每小时2 千万个。 另一方面，由于精子分离速度慢、成本高，人们一直 探讨采用只需少量精子的输精技术。如手术输精（子 宫内、输卵管内）、人工授精（子宫深部、子宫颈 部）、体外受精（IVF）和胞质内精子注射（ICSI）。
玻璃针、显微手术刀 显微操作仪简介 胚胎分割1 (模式:桑椹胚/囊胚) 胚胎分割2（2-到8-细胞期卵裂球）
注：两部片子中都不是太确切。

应用现代分子生物学技术对早期胚胎进 行快速、准确的性别鉴定是可行的，但 由于早期胚胎性别鉴定需从胚胎上取下 少量细胞，对胚胎有一定损害，经冷冻解冻处理后仅有少量胚胎存活，导致胚 胎移植的成功率下降，这就制约了提供 预知性别家畜胚胎的商业化进程。


通过核型分析来鉴定 胚胎性别，寻找不能 与 X 性染色体配对的 Y 染色体。 准确率几乎是100%
3、Ｘ连锁酶活力测定法




原理：早期雌胚中2条Ｘ染色体中的一条失活，在胚 胎基因组激活与Ｘ染色体失活的短暂时期内，2条Ｘ 染色体均可被转移，雌胚中与Ｘ关联酶浓度及活性为 雄胚的2倍。 小鼠8-细胞胚次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT) ， 结果14/15的胚胎性别与HPRT活性结果一致，其中雄 性准确率100%，雌性91%。 测定从桑椹胚到囊胚阶段小鼠胚胎6-磷酸葡萄糖脱氢 酶( G6PP)的活性，雌性准确率为72%，雄性57%。 对Ｘ染色体失活时间尚不明确,易误判。
性别比例基本上近于1:1，保持性别比例 平衡是生物进化的结果。 性别控制(sex control，SC)指通过人为 干预并按人们的愿望使雌性动物繁殖出 所需性别后代的一种繁殖新技术。
二、性别控制技术的发展概况



20世纪初，McChung(1902)在研究蝗虫精细胞时，首先 提出了性别决定的染色体理论。 此后，Stevens和Wilson 用昆虫进行一系列研究后指 出，雌雄个体中不同的性染色体与性别有关，并将性 染色体定义为X染色体和Y染色体。 随后，许多研究证实，哺乳动物的正常性别是由一对 性染色体决定的。动物个体的性别取决于受精时雌、 雄配子所携带的性染色体类别。

三、性别控制的意义
目的是在动物出生前即用人工方法控制
其性别，以改变后代的自然性别比例， 进而按照人们的意愿进行特定性别的畜 禽生产，显著提高畜牧业经济效益。 对高效优质的发展畜牧业具有重要意义 可使受性别限制的生产性状（如泌乳性 状）和受性别影响的生产性状（如肉用、 毛用性状等）能获得更大的经济效益；

精液在分离过程中的高倍稀释，会使精子活力下降。 而分离前洗脱精浆、稀释和分离都会降低精子质膜的 稳定性，从而导致提前获能。 虽然质膜稳定性降低可使精子能够马上具有受精能力， 能立刻用于体外受精，但另一方面却缩短了精子寿命， 使得精子在到达受精部位前或在体外保存过程中死亡。 价格昂贵 每台约25万美元。


主要组件：液流系统、激光器、荧光检 测器、散射光检测器、偏转板、细胞收 集器以及电子控制系统和计算机系统。 这种分类技术可以测定细胞的大小、数 量和类型，并可依赖荧光染色测定DNA含 量和蛋白质水平，同时根据其差异进行 分离。
流式细胞分离法


理论基础：X精子DNA含量比Y精子多（人：差异为 2.8％，家畜：差异3.0％～4.2％）。 将精子稀释并与荧光染料Hoechst33342共培养， 染料定量结合DNA。当精子通过检索仪时被定位从 而被激光束激发，X精子放射出较强的荧光信号, 通过仪器和计算机系统扩增、分析并分辨出X精子 与Y精子。
物理分离法（2）


白蛋白液柱分离法：在粘滞的白蛋白液柱中， Y精子的游动速率比X精子快。 传递逆流电流法：用热传递和逆流沉积法结 合电流的方法来分离人精子。比较轻的Y精子 移动缓慢，从而分别收集到X和Y精子。
物理分离法（3）

Y精子F小体检测 对男性染色体染色，发现 Y染色体长臂发出荧光比其他染色体强，并 且，在分裂期间细胞中发现很量的斑点（F 小体）。39%-47%人精子呈现F小体。F小体 并非在全部哺乳动物中见到，但在大猩猩和 家畜精子中均发现了F小体，因此可用于家 畜精子分离。
第四章
性别控制定义 性别控制技术概况
性别控制
性别控制的意义
性别控制的方法 性别控制技术前景
一、性别控制定义



畜牧生产中，肉、奶、蛋等重要经济性 状在性别间有差异，有的是限性性状。 奶 牛 蛋 鸡 长毛兔：产毛量母兔优于公兔
一、性别控制定义
在正常情况下，自然界动物群体公、母


受胎率低 精子受精力比正常精子低，解冻后的活力和顶体完 整率低等。分离过程不会影响受精，但可能会影响 早期胚胎和胎儿的发育 。 原因：荧光染色、稀释、冷冻、分离前后的保存、 分离过程中紫外线的照射及机械损伤等，都可能会 对精子产生不利影响。现已证实，分离过程会损伤 精子细胞膜，使活力、存储能力和受精能力下降。
控制授精时间代，近排卵时 易得雄性后代，预测和实际符合率70%。 猪：对22窝母猪试验，排卵前授精得母仔 55.6%，排卵后授精得公仔57.3%， （P<0.05）。排卵前E2、LH比排卵后高2.3、 6.3倍。
改变冻精的解冻温度

在一定温度范围内，冷冻精液的解冻温度与精 子的活力呈正相关。冻精解冻温度越高，精子 复活越快，其活力也越强，消耗的能量快而多 ，故存活时间短。这样相应的缩短了Y精子的 寿命，而延长了X精子的寿命，并增加了与卵 子结合的机会，从而提高生母率。


X、Y精子分记方法的发展 物理分离法 免疫分离法 流式细胞分离法
物理分离法


沉积分离法 电泳法 层流分离法 白蛋白液柱分离法 传递逆流电流法 Y精子F小体检测
物理分离法（1）



沉积分离法：根据X精子比Y精子稍重，故沉 降速率稍快。 电泳法：X精子带有较多的净负电荷，因此， X精子向正极移动的速度比Y精子快。 层流分离法：根据X精子和Y精子具有不同的 游动方式和行为来分离精子，X精子集中在 液柱的始端而Y精子集中在较远的一端。