高效聚磷菌的筛选
两株高效聚磷菌的筛选及其聚磷特性的研究2009
收稿日期:2008-9-19;修回日期:2008-10-17作者简介:傅宏兵(1970-),男,硕士研究生,专业方向为环境微生物技术;通讯作者:吴 涓(1969-),女,博士,副教授,研究方向为水污染控制及环境生物技术,E 2mail:wujuan@ustc .edu 。
基金项目:安徽省自然科学基金项目资助(070413132)doi ∶10.3969/j 1issn 11008-9632.20091061023两株高效聚磷菌的筛选及其聚磷特性的研究傅宏兵,吴 涓(安徽大学生命科学学院,合肥230039)摘 要:采用梯度驯化及平板分离技术,从巢湖底泥中筛选到两株高效聚磷菌,分别命名为P6与P8。
经过厌氧和好氧两个阶段的处理,两种菌株的聚磷率均达到80%以上。
实验结果表明,P8菌株在10℃～40℃以及pH 值4～11的较宽范围内都显示出稳定的聚磷效果,而P6菌株仅在30℃～35℃以及pH 值4～5的狭窄范围内达到较高的聚磷率。
不同碳氮源的影响实验表明,除了乳糖以外,P8菌株在所考察的多种碳氮源下都能表现出较高的聚磷率,当乙醇浓度为3.75g/L 时,聚磷率可达到92.9%;而P6菌株对碳氮源则有较严格的要求。
关键词:聚磷菌;筛选;生物量;聚磷率中图分类号:Q932335;X172文献标识码:A文章编号:1008-9632(2009)06-0023-04水体富营养化是全球普遍存在的严重环境问题,近些年来,随着工农业生产的高速发展和人们生活水平的不断提高,含磷的化肥、农药、洗涤剂的使用量不断上升。
水体中磷的含量日益增加。
虽然氮磷同为水体生物的重要营养物质,但是在所有的营养元素中,磷被认为是引起水体富营养化的最关键因素[1-3]。
然而,我国现有的污水处理厂主要集中于有机物的去除,对磷等营养物的去除率只达到10%～20%,其结果远达不到国家二级排放标准[4-5]。
因此,有效降低排放废水中的磷含量,已成为防治水体富营养化的重要途径之一。
高效溶磷菌的筛选、鉴定及其溶磷特性
邵锴,邱业先，徐婧.高效溶磷菌的筛选、鉴定及其溶磷特性[J ].江苏农业科学,2017,45(8) =253 -257. doi ： 10.15889/j . issn . 1002 - 1302.2017. 08. 068高效溶磷菌的筛选、鉴定及其溶磷特性邵锴，邱业先，徐婧(苏州科技学院，江苏苏州21000)摘要:为了从根际土壤中筛选出具有较高溶磷能力的菌株及优化溶磷条件,通过种子萌发初步研究溶磷促生效应。
通过稀释涂布法分离、筛选菌株,并进行ATB 细菌鉴定仪及16S rD N A 测序鉴定;采用单因子试验及正交试验优 化菌株溶磷发酵条件，利用种子发芽指标测定菌株的促生能力。
结果显示，筛选出菌株B D -1的溶磷能力最强，经 ATB 细菌鉴定仪及16S rD NA 测序，该菌株被鉴定为路德维希肠杆菌。
正交试验结果表明，在温度为30丈、摇床转速为180 r /mm 、接种量为2 ml ^、初始p H 值为7.0的条件下培养7 d 的溶磷效果最好，其溶磷量为181.73 g /L 。
种子萌 发试验结果表明,该溶磷菌对作物种子萌发具有一定的促进作用。
关键词:溶磷菌;微生物肥料;条件优化;解磷能力;种子萌发;鉴定;筛选;溶磷特性 中图分类号：S 154. 38 + 1文献标志码：A文章编号：1002 -1302(2017)08 -0253 -04江苏农业科学2017年第45卷第8期一 253 —磷是植物生长必需的营养元素之一，植物的光合作用和 体内的生化过程都必需有磷参与[1<，但其在土壤中主要以 难溶性矿物态存在[3]，难溶性矿物态磷无法被作物直接吸收 利用。
为提高作物产量，超过/ k /hm 2磷肥被施用于土壤 中[]，部分磷肥被作物吸收利用，大部分被转化成难溶性磷 返施于土壤。
大量化学磷肥的施用，伴随土壤板结、土壤酸 化、土壤贫瘠化日益严重。
因此，提高土壤中磷的利用效率对 降低化学磷肥的施用量具有十分重要的意义。
聚磷菌AP7的筛选及除磷特性研究
ｒ ＿ ］
董
聚磷菌 的筛选及除磷特 Ｉ研究 生
张 敬 任 丽科 学学院 ，四川 南充 ６ ７ ０ ） ５ ０ ２ 摘 要 ：从城 市污 水处理厂 好 氧池活性 污泥 中分 离获得 一株 高 效聚磷 茵Ａ ７ Ｐ ，经形态特 征和 生理 生化初 步鉴定该株 为恶
臭假 单胞 菌（ｓｕｏｏａ ｕｉ ） 实验 表明 ，菌株Ａ ７ 有典型 的厌 氧释磷和好 氧吸 磷 的特征 ，除磷率 为７ ．％。 Ｐｅｄｍ ｎｓｐｔ ａ。 ｄ Ｐ具 ０１ 关键 词： 活性污 泥；聚磷 菌；鉴定 ；除磷性 能
Ｄ Ｉ １ ．９ ９ Ｊｓｎ１ ７ —６ ９ ．０ ． ５Ｏ ７ Ｏ ： ５ ６ ／ ．ｓ． ６ １ ５ ６２ １ １ ． ０ ０ ｉ １
ｌ ｏ ａ ｉ ｎ ａ ａ ｅ ｔ ｒａ ｉ ｎ ｏ ｏ ｐ ｏ ｕ ｃ ｓ ｌ ｔ ｎｄ Ｃｈ ｒ ｃ ｅ ｉ ｔｏ ｆａＰｈ ｓ ｈ ｒ ｓ ｏ Ａｃ ｕｍｕｌ ｔ ｎ Ｂａ ｔ ｒａ ａ ｉ ｃ ｅ ｉ ｏ ７ ｗｉｈ Ｈｉ ｈ Ｃａ ａ ｉ ｔ ｆ ｏ ｐ ｏ ｕ ｍ ｏ ａ ｔ ｇ ｐ ｂ ｌ ｙｏ ｉ Ｐｈ ｓ ｈ ｒ ｓＲｅ ｖ ｌ
要 的作 用 。但 是 大 多 数 研 究 学 者 主 要 研 究 生 物 除 磷 工 艺 的 改 进 和 创 新 ，而 对 聚 磷 菌 聚 磷 机 理 研 究 进 展 比较 缓 慢 。对
ＺＨＡ ＮＧ ｎ ， Ｒ Ｎ Ｌ ． ｉ ｇ Ｃ ｌ ｇ ｉ Ｅ ｉ ｎ ， ＨＥ ｉ ． ｕ ｐ ＮＩ ｈａ ｎ （ ｏｌｇ ｆ ｉｌｉ ａ Ｓ ｉｎ ｅ ． ｈ ｎ ＿ ｔ ｒ ｌ ｉｅ ｓ ｙＮａ ｃ ｏ ｇ Ｓｃ ｕ ｎ ６ ７ ０ ） Ｃ ｌ ｅｏ ｏｏ ｉ ｌ ｃ ｃ ｓＣ ｉ ａ ｅ ｍａ Ｕｎｖ ｒｉ ， ｎ ｈ ｎ ， ｉｈ ａ ３ ０ ２ ｅ Ｂ ｃ ｅ Ｗ ｓ Ｎｏ ｔ
高效聚磷菌的筛选与开发利用
科技 曩向导
２ ０ １ ４ 年２ ４ 期
高效聚磷菌的筛选与开发利用
陈作煌 李 燕 林 天 元
（ 福建农林大学
福建
福州
３ ５ ０ ０ ０ １ ）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
【 摘 要】 运 用生物法对 污水进行 处理 可以说 是最环保的一项 污水生物治理工程 ， 在对 污水的 除磷 中广泛的使 用了聚磷 茵 ， 聚磷 菌能吸收 污水 中的 乙酸、 甲酸、 丙酸及 乙醇等极 易生物 降解 的有机物质 ， 与体 内聚合 的磷发 生反应 ， 形成高磷 污泥后 可以清理 出来达到污水的除磷 效果 ， 但在 实际的应 用中由于聚磷 茵受环境和 工艺影响 ． 会 出现诸 多问题 需要 解决 ． 因此对如何 筛选 出高效 的聚磷 菌并很好 的开发 利用就尤为重要 了， 本 文通过 分析研 究力争为有 效的筛选分 离出高效 聚磷 菌提供 可靠的参考资料 。
［ ２ ］ 陈亚 松 ， 金文 标 ， 闫韫 ， 赵勇娇 ． 高效 聚磷菌 的筛选 及其应 用ｆ Ｊ １ ｌ 净水技 术 ，
２０ｌ １ ４．
［ ３ ］ 李博 ， 赵敏 ， 李宝赫 ， 刘哲君． 高效聚磷 菌的筛选 及除磷特性分析【 Ｄ ］ ． 东北林业
大学学报 ． ２ ０ ０ ９ １ ２ ． ［ ４ ］ 连丽丽． 聚磷菌 的筛选及其对污水 的除磷特性研究［ Ｄ 】 ． 辽 宁师范大学 ， ２ ０ ０ ９ ６ ．
４ ． 高效聚磷菌的开发与应 用
经过 五次 的富集培养和 ５次的分离纯化得到 了高浓度的聚磷菌 菌株 ． 由于聚磷菌是 具有超量吸收磷 的微生物 ． 因此 不同菌群的吸收 磷的效果也是不同的 ． 因此要通过科学 的培养筛选得到高效聚磷菌才 能对污水处理起 到显著效果 ． 因此 污水处理 中一定要科学 的选择 污水 淤泥 中的聚磷菌作 为培养基 ． 对污 水厂进行菌群投放 ． 包括缺氧水段 和富氧水段 ． 经过投菌 、 沉淀、 去除污泥达到净化水 中磷的作用。
高效聚磷菌Alcaligenes_省略__12菌株的分离鉴定及其除磷特性_庄志刚
第34卷第3期2014年3月环境科学学报Acta Scientiae CircumstantiaeVol．34，No．3Mar．，2014基金项目：福建省财政厅资助项目（No．20130421）；福建省大学生创新创业训练项目（No．sjcxcy2012-022）；福建师范大学拔尖人才训练项目（生物学拔尖201004）Supported by the Funded Project of Finance Department of Fujian Province （No．20130421），the Innovative Entrepreneurial Training Plan for College Students of Fujian Province （No．sjcxcy2012-022）and the Ｒesearch Training Item of Top-Notch Biological Students of Fujian Normal University （Biological top-Notch 201004）作者简介：庄志刚（1991—），男，E-mail ：zgzhuangfjnu@163．com ；*通讯作者（责任作者），E-mail ：mli@fjnu．edu．cn Biography ：ZHUANG Zhigang （1991—），male ，E-mail ：zgzhuangfjnu@163．com ；*Corresponding author ，E-mail ：mli@fjnu．edu．cnDOI ：10．13671/j．hjkxxb．2014．0119庄志刚，韩永和，章文贤，等．2014．高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性［J ］．环境科学学报，34（3）：678-687Zhuang Z G ，Han Y H ，Zhang W X ，et al ．2014．Isolation ，identification and phosphorus-removal characterization of bacteria Alcaligenes sp．strain ED-12for phosphorus-accumulation ［J ］．Acta Scientiae Circumstantiae ，34（3）：678-687高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性庄志刚1，韩永和1，2，章文贤1，周志华1，陈佳兴1，李敏1，*1．福建师范大学生命科学学院，福州3501082．南京大学环境学院生物地球化学与环境修复实验室，南京210046收稿日期：2013-07-05修回日期：2013-09-10录用日期：2013-09-20摘要：利用经典的微生物筛选方法，从福州市闽侯县上街镇高岐村某排污口淤泥中分离出1株高效聚磷菌，并结合16S rＲNA 基因序列分析进行了菌株鉴定．结果表明，该菌株为产碱杆菌，将其命名为Alcaligenes sp．ZGED-12．理化因素实验显示，在以乙酸钠为碳源、NH 4Cl 为氮源，当C /N 为3ʒ1，pH 为8．0，温度和摇床转速分别为35ħ和100r ·min －1时，该菌株的生长状态最好，对磷的去除能力也最强，最高除磷率可达80%．此外，该菌株能够耐受较高浓度的磷，当磷浓度超过45mg ·L －1时会产生抑制效应．同时，以聚乙烯醇（PVA ）和海藻酸盐（SA ）制备了聚磷微生物固定化小球，并考察了菌球对氮磷废水的净化效果．结果表明，氮磷的去除包括固定化材料的吸附作用及微生物的生长利用和/或贮存，显示出了良好的应用前景．关键词：聚磷微生物；产碱杆菌；筛选鉴定；特性；固定化文章编号：0253-2468（2014）03-678-10中图分类号：X172，X703．1文献标识码：AIsolation ，identification and phosphorus-removal characterization of bacteria Alcaligenes sp．strain ED-12for phosphorus-accumulationZHUANG Zhigang 1，HAN Yonghe 1，2，ZHANG Wenxian 1，ZHOU Zhihua 1，CHEN Jiaxing 1，LI Min 1，*1．College of Life Sciences ，Fujian Normal Univiersity ，Fuzhou 3501082．Biogeochemistry ＆Environmental Ｒemediation Laboratory （BEＲL ），School of the Environment ，Nanjing University ，Nanjing 210046Ｒeceived 5July 2013；received in revised form 10September 2013；accepted 20September 2013Abstract ：A phosphorus-accumulating bacteria was isolated from a drain outlet located in Gaoqi Village ，Shangjie Town ，Minhou County ，Fuzhou ，China．The strain ，named Alcaligenes sp．ZGED-12，was obtained by classic methods for screening microorganisms together with 16S rＲNA gene analysis．The culture conditions showed that the best carbon source and nitrogen source were sodium acetate and NH 4Cl ，respectively ，the optimal pH was 8．0，the optimal temperature was 35ħ，the best C /N was 3ʒ1，and the optimal shaking rate was 100r ·min －1．Under these optimized conditions ，the maximum removal efficiency for phosphorus was higher than 80%．The strain has a high tolerance for phosphorus ，but its growth was inhibited when the concentration of phosphorus was higher than 45mg ·L －1．Meanwhile ，the immobilized phosphorus-accumulating organisms beads （IMOBs ）were prepared ，and the purification efficiency of IMOBs for nitrogen /phosphorus contaminated wastewater was investigated．The results showed that removal for nitrogen and phosphorus was due to absorption on the immobilized materials and uptake /metabolism of microorganisms ，indicating a good prospective of IMOBs in the treatment of wastewater．Keywords ：phosphorus-accumulating organisms （PAOs ）；Alcaligenes sp．；screening and identification ；characteristics ；immobilization3期庄志刚等：高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性1引言（Introduction）磷超标是造成水体富营养化的主要原因之一．研究发现，当总磷浓度超过0．1mg·L－1（磷作为限制因素，m TNʒm TP＞15ʒ1），藻类会过度繁殖（Abell et al．，2010）；一般情况下，总磷浓度超过0．02 mg·L－1就有可能导致水体富营养化（韩永和等，2012）．由于水体富营养化现象日趋严重，严重破坏了人类赖以生存的自然环境，威胁着人类的健康（Ansari et al．，2011）．常规的生化处理工艺效率低，不能从根本上解决问题．近些年，微生物除磷工艺的研究得到了迅速发展，主要有A/O、A2/O、UCT、五段Bardenpho、Phostrip等（马放等，2011）．为实现微生物除磷工艺的有效实施，筛选出除磷能力较强的聚磷微生物是首要目标．此外，考虑到聚磷微生物对磷的吸收是一个厌氧释磷、好氧吸磷的过程（张培玉等，2011），有必要考察聚磷微生物对溶氧的响应．同时，微生物聚磷过程会受有机质分子大小、pH等的影响（王亚宜等，2005；2006）．因此，考察特定微生物在不同理化条件下的生长情况和除磷特性是实现微生物除磷机理研究及其在工程应用的前提条件．为获得除磷能力较强的微生物种质资源，自聚磷菌首次被Fuhs等（1975）分离以来，至今已有多种具备聚磷能力的微生物被筛选出来．多项研究表明，产碱杆菌属细菌（Alcaligenes sp．）具备这方面的能力（Flores III et al．，2007；Joo et al．，2006；Zhou et al．，2012）．此外，肠杆菌（Enterobacteriaceae）（张培玉等，2011；赵海泉等，2009）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus）（南亚萍等，2013）、Accumulibacter （Acevedo et al．，2012；Oehmen et al．，2005）、变形菌（Alphaprotenbacteria）（Nguyen et al．，2012；周明璟等，2012）等也是常见的聚磷微生物，甚至存在兼具反硝化功能的聚磷微生物（Qiu et al．，2012；Yang et al．，2011；杨小龙等，2011）．在此基础上，人们又开展了大量关于溶氧对聚磷菌除磷能力的影响研究（Acevedo et al．，2012；Merzouki et al．，1999；张培玉等，2011），但这些研究较少涉及不同聚磷菌在不同的厌氧时间条件下对好氧吸磷的相关作用．此外，诸如pH和有机质分子大小等理化因素对聚磷菌聚磷能力的影响也已得到较深入研究（Filipe et al．，2001；Oehmen et al．，2005；王亚宜等，2005）．然而，当前的多数研究只局限于对单一因素的考察，抑或集中于研究高浓度废水的生物处理系统，目前，聚磷微生物除磷工艺离工程应用仍有较大的距离（丁炜等，2011）．正如Covarrubias等（2012）研究表明，微生物的固定化能够为其活性持留提供保障．然而，考察固定化聚磷菌对含磷废水的修复实验尚未见相关报道．因此，继续筛选和开发具备高效除磷功能的微生物，开展聚磷微生物的固定化、活性持留及污水修复并开展综合理化因素对聚磷微生物除磷能力的影响等方面的研究对工程实践有重要指导意义．鉴于此，本研究从排污口淤泥中筛选出1株具备高效除磷能力的聚磷菌，全面考察各理化因素对菌株生长及除磷能力的影响．同时，对微生物进行固定化，并重点考察其对含磷废水的净化效果．2材料与方法（Materials and methods）2．1材料2．1．1样品来源淤泥样品采自福州市闽侯县上街镇高岐村某排污口，立即用于菌种的分离与筛选．2．1．2培养基富集培养基、筛选培养基、微量元素（张培玉等，2011），以及缺磷培养基（马放等，2011）和富磷培养基（李博等，2009）分别按文献进行配制．LB培养基（g·L－1）：蛋白胨10．00，酵母粉5.00，NaCl10．00，琼脂2．00（固基加入），pH=7．2．固定化微生物小球实验培养基（g·L－1）：丁二酸钠0.61，NaNO30．28，KH2PO40．1，KCl0．014，MgSO4·7H2O0.02，CaCl2·2H2O0．018，pH=7．2．以上所有培养基均经121ħ灭菌（碳源实验中，葡萄糖和蔗糖组115ħ灭菌）20min后使用，微量元素于灭菌前加入．2．1．3微生物固定化小球制备材料聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）、海藻酸盐（Sodiumalginate，SA）、硼酸（H3BO3）、无水氯化钙（CaCl2），除硼酸（分析纯）外其余均为化学纯．2．2方法2．2．1聚磷菌的分离鉴定称取0．5g新鲜淤泥，用无菌水水洗后8000r·min－1离心5min，弃上清，此过程重复3次．处理后将样品加入2．1．2节的富集培养基中，添加量及其他条件参考文献（韩永和等，2013）．培养12h后，取1．5mL菌悬液于下一磷梯度的培养基中，磷梯度依次为2、5、8、10、15和20mg·L－1（以P计）．聚磷菌含有典型的PHB颗粒和异染颗粒，经强976环境科学学报34卷化释磷、吸磷实验后，PHB颗粒可被脂溶性染料苏丹黑着色，异染颗粒可被甲苯胺蓝和次甲基蓝染成紫色，可与其他非颗粒性物质区分开来（李博等，2009；马放等，2011）．将富集驯化的菌悬液按10－110－7梯度进行稀释，涂布平板．挑取形态较特殊的单菌落进行PHB颗粒染色和异染颗粒染色，确定含有PHB颗粒和异染颗粒的菌落，进行复筛实验．挑取经纯化的单菌落于缺磷培养基中，150r·min－1、30ħ培养12h．将菌液在8000r·min－1条件下离心5min，再将菌液转接于富磷培养基中，150r·min－1、30ħ培养至菌液变浑浊．计算各株菌的除磷率．此后，将复筛得到的聚磷菌根据文献（韩永和等，2013）的方法进行16S rＲNA的测序及系统发育分析．2．2．2理化因素对聚磷菌生长及除磷特性的影响聚磷菌具备高效除磷能力主要基于异染颗粒对磷的贮存，菌体在生长过程中也能够利用部分磷合成细胞成分．文献报道显示，聚磷菌在厌氧、缺磷条件下能够把贮存于异染颗粒中的磷释放出来，经厌氧释磷后将其投入富磷培养基中进行除磷实验能够大大提高除磷能力（Merzouki et al．，1999；张培玉等，2011；周明璟等，2012）．此外，碳源、氮源、C/N、pH、温度等都会影响聚磷菌的生长．因此，考察不同理化因素对聚磷菌生长及除磷能力的影响是必要的，这对实现聚磷菌的工程应用有重要参考价值．将菌株ED-12于LB培养基中培养12h（30ħ、150r·min－1），按5%的接种量接种于装有30mL缺磷培养基（PO3－4-P质量浓度为12．3mg·L－1）的150mL三角瓶中，30ħ、150r·min－1摇瓶培养12h；再按5%的接种量将菌悬液接种于装有30mL富磷培养基（PO3－4-P质量浓度为32mg·L－1）的150mL三角瓶中，30ħ、150r·min－1摇瓶培养．每隔一定的时间取样测定菌株ED-12的OD600及剩余的PO3－4-P浓度，计算除磷率并绘制菌株的生长曲线图．以聚磷菌的生长特性为基础，以乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖和蔗糖为碳源，以NH4Cl、（NH4）2SO4和NH4NO3为唯一氮源，同时考察了不同C/N、起始pH和摇床转速对聚磷菌生长及除磷能力的影响．在优化过程中，已优化的参数作为后续实验的条件．此外，在最优条件下，探讨了菌株ED-12对不同起始浓度PO3－4-P的去除效果，以考察其工程应用价值．PO3－4-P的起始浓度梯度设置为：5、15、30、45、60和100mg·L－1．2．2．3微生物固定化小球的制备及除氮磷初步实验微生物固定化小球的制备按以下步骤进行：①称取4g PVA（聚合度1750ʃ50）溶于90mL无菌水中，待PVA充分溶解后加入2g SA，沸水浴加热至完全溶解，冷却至室温备用；②分别称取2g反硝化菌和聚磷菌湿菌体，充分稀释于10mL无菌水中，再将稀释后的菌液加入PVA-SA体系中，充分混匀；③根据需要的小球粒径，剪去5mL移液枪枪头尖端，吸取菌体混合物，匀速滴入5%CaCl2-饱和硼酸溶液中，交联15min后，将小球用无菌水洗净，备用．以不添加菌球的组别为空白对照（Blankcontrol），以不添加微生物的固定化小球组为阳性对照（PVA+SA），按5%（m/V，g·L－1）投加小球．24h后取样测定水样的TN和TP浓度，计算脱氮除磷能力．2．3测定方法硝态氮（NO－3）和总氮（TN）的测定采用麝香草酚分光光度法（韩永和等，2013），总磷（TP）的测定采用钼锑抗分光光度法（国家环境保护总局，2002）．2．4数据处理与统计分析运用Microsoft Excel2003和Origin8．5进行数据处理、统计分析及绘图．所有实验均进行3个重复，结果以MeanʃSD表示．3结果与讨论（Ｒesults and discussion）3．1聚磷菌的分离鉴定3．1．1聚磷菌的分离纯化及复筛经富集，聚磷微生物在平板上的菌落随着磷浓度的升高而减少，当磷浓度达到20mg·L－1时，平板上已无单菌落．将磷浓度为15mg·L－1的培养基按10－1 10－7稀释，涂布平板．根据形态特征，将能够在培养基上生长的49个单菌落分成4类，分别为EA（12株）、EB（15株）、EC（8株）和ED（14株）．分别对EA、EB、EC和ED进行PHB颗粒染色和异染颗粒染色，初筛得到9个染色效果较明显的聚磷菌单菌落（EA、EB和ED各3个，EC无受染现象）．随后，对EA、EB和ED共9株聚磷菌进行复筛实验．分别缺磷培养12h后，转接于富磷培养基中继续培养24h，测定除磷率，结果如表1所示．可知，ED-12对磷的去除能力最强，可达52．2%，因0863期庄志刚等：高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性此，选择菌株ED-12作进一步研究．表1聚磷菌的除磷能力（起始浓度：33．9mg·L－1）Table1The phosphorus removal ability of phosphorus－accumulatingorganisms（initial concentration：33．9mg·L－1）菌株总磷浓度/（mg·L－1）去除率A-0327．219．70% A-0626．920．60% A-1027．419．10% B-0429．812．10% B-1029．213．90% B-1129．114．50% D-0616．850．40% D-0817．348．90% D-1216．252．20%3．1．2聚磷菌菌株ED-12的16S rＲNA的PCＲ扩增及序列分析经测序，获得片段长度为1463bp 的部分16S rＲNA基因序列，GenBank登录号为JX966315．在NCBI数据库的比对结果表明，该菌株与Alicaligenes sp．的相似性达98%以上，推测其为Alicaligenes sp．选择序列相关性较高的76个16SrＲNA序列，用Cluxtal X序列分析软件分析其与ED-12的序列同源可靠性，选9个可信度较高的序列用MEGA4．0软件通过N-J法构建系统发育树，确定ED-12的进化地位，结果如图1所示．图1基于16S rＲNA序列同源性构建的菌株ED-12和亲缘性相近的其他细菌的系统发育树Fig．1Unrooted phylogenetic trees based on the16S rＲNA sequence of strain ED-12and the related strains图2菌株ED-12的生长曲线及除磷特性Fig．2Growth curve and phosphorous removal characteristic ofstrain ED-123．2ED-12的生长曲线及除磷特性聚磷菌在缺氧、缺磷条件下会利用异染颗粒中的磷并合成PHB，将其转入有氧、富磷的培养基后会将PHB中的能量释放出来，以便更高效地聚磷，用于菌体生长并将剩余的磷储存于异染颗粒中（马放等，2011）．图2展示了菌株ED-12经缺磷培养后在富磷培养基中的生长情况，以及其对PO3－4-P的去除率．结果表明，在前16h，菌体生长处于延滞期，16h后进入对数期，52h后开始进入衰亡期．在整个过程中，菌体生长特征与除磷率趋势基本吻合．64h内，磷浓度从30mg·L－1左右降低到（8．12ʃ0.32）mg·L－1，去除率达73．82%ʃ1．02%．此后，总磷浓度基本保持不变．3．3不同理化因素对菌株ED-12的生长及除磷能力的影响3．3．1不同碳源对菌株ED-12的生长及除磷能力的影响有机物特征是影响生物反应器反硝化和除磷效果的重要因素，与反硝化微生物类似（韩永和等，2013），大部分聚磷菌只能以低级脂肪酸类的小分子有机基质作为碳源，并将其合成的PHB以能量形式储存在细胞内（王亚宜等，2006）．以乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖和蔗糖为碳源，菌株ED-12的生长及除磷能力结果如图3所示，菌株ED-12在以葡萄糖和蔗糖为碳源时基本不生长，对PO3－4-P的去除率低于15%．而菌株在以乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠为碳源时长势较好，且对PO3－4-P的去除率都在50%以上．其中，以乙酸钠为碳源时，菌株ED-12生长最旺盛，对PO3－4-P的去除率达到了70%以上．对比5种碳源结构与分子量，相对而言，在分子结构简单、分子量低的情况186环境科学学报34卷下，聚磷菌的生长较好，且能达到一个较高的除磷率，这与前述观点相符．此外，聚磷菌对不同碳源的利用效果可能还与其本身对碳源的亲和性或其他特性有关．图3不同碳源对菌株ED-12生长及除磷能力的影响Fig．3Influence of different carbon sources on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-123．3．2不同氮源对菌株ED-12的生长及除磷能力的影响氮源是微生物细胞生长的第二大营养物质，对蛋白质、核酸和其他一些成分的合成非常重要（Madigan et al ．，2009）．多数细菌能以氨盐作为唯一氮源，由图4可知，在以NH 4Cl 、（NH 4）2SO 4和NH 4NO 3为唯一氮源的培养基中，聚磷菌能够良好生长．其中，在含有NH 4Cl 的培养基中OD 600可在24h 内达到1．4左右．同时，在以上3种氮源培养基中，菌株ED-12对PO 3－4-P 的去除率都在45%以上（NH 4Cl 培养基最高，可达80%）．观察发现，菌株ED-12在24h 时，在以NaNO 3和NaNO 2为唯一氮源的培养基中只能微弱的生长，但经48h 的培养后，开始进入对数期，并能达到较高的OD 600．此外，虽然以NaNO 3和NaNO 2为唯一氮源时微生物生长情况较差，但培养基中PO 3－4-P 浓度分别降低了63．72%ʃ5.57%和34．84%ʃ2．11%，说明微生物在24h 内主要通过分解PHB 并将磷储存于异染颗粒中在后期用于菌体的生长．但Saito 等（2004）研究认为，NO －2的存在在有氧和无氧两种情况下都会抑制聚磷菌对磷的吸收．图4得出了不同的结论，其机理有待进一步研究．在以蛋白胨为唯一氮源的培养基中，菌株ED-12长势较好，但蛋白胨含有含磷杂质，因而影响了PO 3－4-P 去除率的计算．由此可知，聚磷菌ED-12菌株能够在以NH 4Cl 、NaNO 3、NaNO 2、（NH 4）2SO 4、蛋白胨和NH 4NO 3为唯一氮源的培养基中生长．根据微生物生长量、生长周期及对PO 3－4-P 的去除率，NH 4Cl 是菌株ED-12生长及发挥除磷能力的最佳氮源．图4不同氮源对菌株ED-12生长及除磷能力的影响Fig．4Influence of different nitrogen sources on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-123．3．3不同C /N 对菌株ED-12的生长及除磷能力的影响碳源和氮源是微生物生长的重要物质，不同微生物对碳源和氮源的需求量不同．细菌对氮源的需求量大，真菌和放线菌等对碳源的需求量大（周德庆，2002）．在脱氮除磷工艺中，必须考虑C /N 以实现微生物对废水中氮、磷的有效利用．考察C /N 对聚磷菌ED-12菌株生长及除磷能力的影响，结果（图5）表明，随着C /N 的升高，菌体生物量增大，同时对PO 3－4-P 的去除率也随之提高，C /N 为3ʒ1时达到最大值．此后，微生物的生长及对PO 3－4-P 的去除率又随着C /N 的升高而缓慢降低，说明过高的C /N 导致氮源不足，微生物生长也因此受到了抑制．图5不同C /N 对菌株ED-12生长及除磷能力的影响Fig．5Influence of different C /N on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-123．3．4不同pH 对菌株ED-12的生长及除磷能力的影响在好氧条件下，聚磷菌能分别以醋酸和2863期庄志刚等：高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性PO 3－4为碳源和磷源，生成聚合态磷作为储能物质，储存于细胞内并伴随着产生OH －，导致发酵液的pH 值逐渐升高（周明璟等，2012）．其聚磷过程可用式（1）表示（连丽丽，2009；周明璟等，2012）．C 2H 4O 2+0．16NH +4+1．2O 2+0．2PO 3－4→0．16C 5H 7NO 2+1．2CO 2（HPO 3）（胞内聚磷）+0．44OH －+1．44H 2O（1）有研究表明，pH 对聚磷菌聚磷过程非常重要，pH ≈8最适宜聚磷菌生长及除磷作用的发生（Filipe et al．，2001；Oehmen et al．，2005）．本研究发现，当pH 值＜7．0时，聚磷菌ED-12菌株基本不生长，对PO 3－4-P 的去除率为0；当pH ＞8．0时，会抑制菌体的生长，但对PO 3－4-P 的去除率却在持续地升高．有文献报道，pH 升高（在碱性条件下）会导致PO 3－4-P 以磷酸盐沉淀的形式析出（王亚宜等，2005）．在本研究中，当pH ＞8．0时，培养基中有沉淀产生，推测沉淀物即为文献中所报道的磷酸盐沉淀，因此出现了以上现象（升高）．图6不同起始pH 对菌株ED-12生长及除磷能力的影响Fig．6Influence of different initial pHs on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-123．3．5不同温度对菌株ED-12的生长及除磷能力的影响温度是除有机物特征外影响微生物生长的另一重要因素，但王亚宜等（2006）和姜体胜等（2007）认为，温度不会影响聚磷菌发挥聚磷作用．由图7可知，随着温度的升高，聚磷菌ED-12菌株的生物量也增大，35ħ时最适宜ED-12菌株的生长．相应地，ED-12菌株对PO 3－4-P 的去除率也呈先增后减的趋势，在35ħ时达到最大值（73．14%ʃ1．65%）．由此可知，不同温度对聚磷菌ED-12菌株除磷效果的影响比对其生长的影响大得多．温度对聚磷效果存在影响，这与Panswad 等（2003）的研究结果相符，即35ħ最有利于聚磷菌发挥聚磷作用，过高或过低的温度都会抑制其效果，说明不同的微生物聚磷特性存在差异．图7不同温度对菌株ED-12生长及除磷能力的影响Fig．7Influence of different temperatures on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-123．3．6不同摇床转速对菌株ED-12的生长及除磷能力的影响研究表明，溶氧是影响生物除磷效果的一个重要因素（方茜等，2008；荣宏伟等，2008）．为了满足聚磷菌生物膜内对氧的需求量，加快氧的传递速率，增加活性生物膜的厚度，加快聚磷菌的好氧吸磷速率，必须提高液相主体中溶解氧的含量（荣宏伟等，2008）．此外，低溶氧有利于反硝化除磷，高溶氧有利于好氧吸磷（在含硝酸盐或亚硝酸盐培养中可以进行厌氧生长）（方茜等，2008）．如图8所示，摇床转速在0 200r·min －1之间，菌株ED-12都能生长．当摇床转速为50r ·min －1时，菌体OD 600最高，达2．60ʃ0．62；当摇床转速为100r ·min －1时，对PO 3－4-P 的去除率最高，达59.05%ʃ7.26%．在各培养条件下，菌体的生长与除磷率趋势不尽相同，说明二者是彼此独立的过程．静置培养时，储存于异染颗粒的磷被分解，用于菌体的生长，此时对PO 3－4-P 的去除率近50%，说明菌株ED-12在厌氧条件下还能将环境中的磷用于生长．好氧条件下，菌体将部分磷用于生长，并将剩余的磷储存于异染颗粒中，因此，在转速≥50r·min －1时也能维持一个较高的除磷率．观察发现，摇床转速过高未必能提高除磷率．微生物固定化小球脱氮除磷实验表明（详见3.5节），ED-12菌株在低溶氧与高溶氧时都存在除磷或聚磷作用，二者作用能力的强弱导致了图8所示的结果，即高溶氧时对PO 3－4-P 的去除率与低溶氧时相近．当摇床转速为100r ·min －1时，培养基中386环境科学学报34卷的溶氧最适合ED-12菌株对磷的反硝化去除或储存于异染颗粒中．低溶氧和高溶氧条件下，则分别表现为对磷的生长利用和积聚．因此，对废水中的磷的有效去除可以通过调节溶氧而实现，此过程包括生长利用和聚磷作用．图8不同摇床转速对菌株ED-12生长及除磷能力的影响Fig．8Influence of different shaking speeds on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-123．4菌株ED-12对不同起始浓度PO 3－4-P 的去除效果聚磷菌对磷的去除包括两条途径：生长利用和异染颗粒贮磷．根据聚磷菌分离筛选原理，过高浓度的PO 3－4-P 会抑制聚磷菌的生长与繁殖．因此，考察不同起始浓度的PO 3－4-P 对聚磷菌生长的影响及相应条件下聚磷菌对PO 3－4-P 的去除效果，对分析聚磷菌生长与聚磷过程的关系及指导聚磷菌在富营养化水体中的工程应用有实际意义．如图9所示，随着PO 3－4-P 浓度的升高，菌株ED-12的OD 600呈先增后减的趋势．当PO 3－4-P 浓度为45mg ·L －1时，菌株ED-12的长势最好，过高的PO 3－4-P 反而会抑制菌体的生长．这是由于微生物生长受到了基质自抑制作用（王茹等，2013），这与聚磷菌分离筛选的结论相符．观察发现，除5mg ·L －1组，随着PO 3－4-P 浓度的升高，菌株ED-12对PO 3－4-P 的去除率与聚磷菌生物量成正相关（图中未显示），但PO 3－4-P 的变化浓度始终呈一递增趋势．当PO 3－4-P 浓度＞45mg·L －1时，培养基中出现了部分沉淀物．正如3．3．4节的结论，聚磷过程会释放OH －，微生物生长越快，在相同的时间内产生的OH －也越多，因此，就有越多的PO 3－4-P 形成了沉淀（王亚宜等，2005），这合理地解释了以上的现象．以上结论说明，Alcaligenes sp．ED-12对磷的吸收是一个复杂的过程，在菌体生长及聚磷过程中，不仅会受理化因素尤其是pH 的影响，溶液中的磷浓度也是影响聚磷菌生长与聚磷效果的一个关键因素．由以上分析可知，菌株ED-12对PO 3－4-P 的去除能力很强，在不同PO 3－4-P 起始浓度梯度条件下，最高去除率可达81．02%ʃ2．27%，此时的PO 3－4-P 浓度变化量为（36.46ʃ1．02）mg ·L －1．图9菌株ED-12对不同起始浓度PO 3－4-P 的去除效果Fig．9Ｒemoval efficiency of strain ED-12on different initialconcentrations of PO 3－4-P 表2所示为典型的聚磷菌对不同起始浓度PO 3－4-P 的去除效果．由表可知，除耳葡萄球菌（Staphyloccocusauricularis ）、Accumulibacter和Competibacter 外，其他菌株对浓度＜50mg·L －1的PO 3－4-P 去除效果一般．在当前所报道的产碱杆菌除磷能力实验中，都未开展磷浓度梯度实验；除Bao 等（2007）的报道外，其余产碱杆菌菌株对浓度＜30mg ·L －1的PO 3－4-P 去除效果都低于90%．本研究所得菌株不仅在磷浓度为45mg·L －1时具有较高的去除率，当浓度高达60mg ·L －1甚至100mg ·L －1时还能维持较高的活性及去除率．因此，菌株ED-12是一株较理想的聚磷菌，具有广阔的应用前景．然而，微生物聚磷过程比较复杂，今后的研究工作可围绕精确定量菌株Alcaligenes sp．ED-12的磷吸收在生长利用及贮存方面的比例及吸收与释放的关系上．3．5固定化聚磷微生物小球除氮磷实验微生物的固定化是实现微生物活性持留的途径之一，同时，固定化也有助于目标微生物的投加与回收（Covarrubias et al．，2012）．当前应用最广泛的固定化材料是聚乙烯醇和海藻酸盐（Covarrubias et al．，2012；Munjal et al．，2002；Wu et al．，2004），固定化交联剂通常选择2% 5%的CaCl 2-饱和硼酸溶液（Long et al．，2004；Wu et al．，4863期庄志刚等：高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性2004）．表2不同微生物对磷的去除效率Table 2Ｒemoval efficiency of phosphorus for different microbes微生物PO 3－4-P 起始浓度/（mg ·L －1）PO 3－4-P 去除率参考文献金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus ）1065%南亚萍等，2013耳葡萄球菌（Staphyloccocus auricularis ）50＞90%Choi et al．，2000肠杆菌（Enterobacter sp．）10．2594．6%张培玉等，2011Accumulibacter ＆Competibacter 53．3＞80%Oehmen et al．，2005克雷伯氏菌（Klebsiella terrigena ）27＜80%赵海泉等，2009约氏不动杆菌（Acinetobacter johnsonii ）1065．24%连丽丽，2009产碱杆菌（Alcaligenes sp．）7．590%刘亚男等，2005产碱杆菌（Alcaligenes sp．）10＞90%Bao et al．，2007产碱杆菌（Alcaligenes sp．）20．2582．3%孙梦，2011产碱杆菌（Alcaligenes sp．）28．7377．1%焦中志等，2009产碱杆菌（Alcaligenes sp．）4581%本研究图10固定化聚磷微生物小球对氮磷的去除效果Fig．10Ｒemoval efficiency for TN and TP by the immobilized-PAOsbeads根据赖子尼等（2008）的实验配方制备的固定化聚磷微生物小球的弹性与机械强度较好，对含氮磷废水的净化效果表明，菌球对磷有较强的去除能力（从（19．91ʃ1．81）mg·L －1降至（6．19ʃ0．76）mg ·L －1），同时能够去除一定的氮（从（215．82ʃ35.29）mg·L －1降至（183．42ʃ15．35）mg ·L －1）（图10a ）．二者的去除率分别达56．21%和15.01%（图10b ）．其中，固定化材料对氮的吸附比例较小，而对磷的吸附较显著（p ＜0．01），这可能与固定化材料的表面官能团及CaCl 2等对PO 3－4的亲和力强于NO －3有关．同时，固定化微生物（IMOs ）对磷的去除效果也优于氮，说明菌株ED-12可能不具备反硝化能力，对氮的利用仅是生长所需．由PVA +SA +IMOs 组与PVA +SA 组比较可知（图10b ，#表示），无论是氮还是磷，都存在显著差异，说明固定化微生物是氮磷去除的主要贡献者．4结论（Conclusions ）1）本研究成功从高岐村某排污口筛选出1株典型的聚磷微生物，鉴定发现其属于产碱杆菌属（Alcaligenes sp．）细菌，将其命名为Alcaligenes sp．ZGED-12．2）研究发现，菌株ED-12能在高磷浓度下生长，16h 时进入生长对数期．理化因素实验确定了聚磷菌ED-12的最适生长及发挥除磷能力的条件，其中，碳源、氮源和pH 对其影响最大．磷浓度实验表明，低浓度磷不利于菌株ED-12的生长，但过高浓度反而会抑制菌体生长及发挥聚磷功能，最优磷浓度为45mg·L －1．3）本研究成功实现了聚磷微生物的固定化，该固定化小球对氮磷的去除显示出了良好的效果，作用机理包括固定化材料对氮磷的物理化学吸附及微生物的吸收利用（或贮存）．其中，微生物在这个过程中起着关键作用．586。
高效聚磷菌的分离鉴定及除磷性能分析
Ｖ０ １ ． ３ ２ Ｎｏ ． ５
水
资
源
保
护
２ ０ １ ６年 ９月
Ｓ ｅ ｐ．２０１ ６
ＷＡ ＴＥ Ｒ ＲＥ Ｓ ０ ＵＲＣ ＥＳ Ｐ ＲＯ Ｔ ＥＣ Ｔ Ｉ ＯＮ
ห้องสมุดไป่ตู้
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高效聚磷菌的筛选及其应用
关键词 生物除磷 聚磷菌 筛选 受污染河水 污水处理厂
中图分类号：TU992.3
文献标识码：B
文章编号：1009-0177（2011）02-0019-04
Screening and Application of High Efficient Phosphate-Accumulating Organisms (PAOs)
1 材料和方法
1.1 样品来源
- 19 -
陈亚松，金文标，闫 韫，等. 高效聚磷菌的筛选及其应用
Vol. 30, No. 2, 2011
现场采集深圳市布吉河底泥样品于无菌的三 角瓶，加适量无菌水后用玻璃珠振荡打碎。
1.2 培养基
富集培养基成分：无水乙酸钠 5.0 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g、CaCl2 0.2 g、（NH4）2SO4 2.0 g、KH2PO4 2~ 20 mg、蒸馏水至 1 000 mL、pH 7.2~7.4，依次增加培 养基中 KH2PO4 的含量：2、5、8、10、15、20 mg。
Chen Yasong1, Jin Wenbiao2, Yan Yun2, Zhao Yongjiao2 (1. BCEG Environment Development Co., Ltd., Beijing 100192, China; 2.Harbin Institute of Technology Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055, China)
经过 5 次富集培养、4 次分离纯化，得到一株高 效聚磷菌 HJP07（保藏号 CGMCC NO2164）[7]。该菌 株在含不同磷浓度（5、10、15、20 mg ／ L）的富集培养 液的聚磷效果见表 1。
高效反硝化聚磷菌株的筛选及其生物学特性
维普资讯
第 ２ 卷第 ６ ８ 期
２０ ０ ７年 ６月
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１５ ００ ０ １）
摘 要 ： 为研 究 反 硝 化 聚 磷 菌 的 生 物 学 特 性 ， 过 吸 磷 试 验 、 酸 盐还 原 产 气 试 验 及 异 染 颗 粒 和 Ｐ 通 硝 ＨＢ颗 粒 染 色 辅 助
检验 ， 稳定运行的厌氧／ 从 缺氧 Ｓ Ｒ反应器中分离筛选 出 ４株高效反硝化聚磷菌 Ｈ１ 、 ９ Ｈ２ Ｂ ６ Ｈ１ 、 ４和 Ｘ ． ｇ 经鉴定 ， ３ 前
Ｃ ｖｌＥｎ ｉ ｅ ｒｎ Ｈａ ｂｎ Ｅｎ ｉ ｅ ｒｎ ｉ ｅ ｓｔ Ｈａ ｂｎ １ ０ ０ ， ｉ ａ ｉｉ ｇ ｎ ｅ ｉ ｇ， ｒ ｉ ｇ ｎ ｅ ｉｇ Ｕｎ ｖ ｒ ｉ ｙ， ｒ ｉ ５ ０ １ Ｃｈ ｎ ）
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磷矿废水中高效聚磷菌的筛选
近年来我国水体富营养化越来越严重，水体受到污染不仅破坏了环境与动植物的生存也影响了人们的生活和人们的工农业发展。
而水体富营养化都与水中的磷含量剧增有关，所以除去水中的磷对治理水体富营养化特别重要，这也是个社会非常关注的问题。
我校的南湖水体污染特别严重是我校的美中不足。
关键词：生物去磷聚磷菌筛选环境污染污水处理
目前城市污水处理主要使用生物除磷，它是利用聚磷菌一类的微生物从水中摄取磷，并将磷存于体内，在水低形成高磷的污泥，达到了去磷防水体富营养化的效果。
聚磷菌是生物除磷的决定生物，而聚磷菌的工作受到环境的影响，如氧浓度，PH值，温度等，且不同的聚磷菌的聚磷能力不同，所以要想达到高去磷的效果就必须筛选出聚磷效率高的菌种
.实验材料与方法
1.1主要的的仪器设备
摇床，超净工作台，全自动高压灭菌锅，培养箱，电子天平，酸度计，离心机,可见分光光度计，培养皿20个，细菌过滤器，移液枪（100ul和1000ul），量筒（10ml和50ml各一个)，锥形瓶（150ml,250ml和500ml），草酸铵结晶紫，革兰氏碘液，95%的酒精，石碳酸复染红，显微镜，载玻片及盖玻片。
1.2主要的试剂
微生物分离纯化用的试剂均是国产分析纯，主要有牛肉膏，蛋白胨，琼脂，乙酸钠，磷酸氢二钾，硫酸镁，硫酸亚铁，氢氧化钠硫酸铵，钼酸钾，抗坏血酸，酒石酸锑钾，磷酸二氢钾，氢氧化钾过硫酸钾，MOPSHighPurityGrade,Tricine,X--Pi.
1.3样本采集
磷矿废水
1.4培养基及溶液
（1)YG培养液：酵母侵膏1g,葡萄糖1g，K2HPO4 0.3g KH2PO4 0.25g 七水硫酸镁0.2g, 蒸馏水1000ml.
（2)MOPS培养基:100ml的10*MOPS 8.370g, tricine 0.717g, 30ml的去离子水，10mol/L KOH调PH到7.4. 总体积44ml. 0.01mol/L, 硫酸亚铁1ml，按下列加：氯化铵（1.9mol/L)5ml, 硫酸钾（0.276mol/L)1ml,二水氯化钙0.02mol/L)0.025ml, 六水氯化镁（2.5mol/L)0.21ml, NaCl(5mol/L)10ml, 微量元素混合液0.02ml, 葡萄糖0.1g, )取25ml置于两个500ml的三角瓶中，向一个三角瓶加0.0087gK2HPO4，成为限磷培养基。
另一个加0.1732gK2HPO4成为过磷培养基。
两瓶分别加离子水后用细菌过滤器过滤分别装于灭菌的150ml三角瓶中。
（3)LB培养基：酵母清膏5g蛋白胨10g，氯化钠5g，水1000ml，pH7.0~~~7.2
实验方法
1.聚磷菌的筛选：
（1)聚磷菌的分离，纯化与保存。
将水样充分摇匀后，用移液枪取0.5ml水样于4.5ml的无
菌水中，震荡混匀，依次制成0.1 ，0.01 0.001 .0001 .00001 不同浓度的菌液，从各菌液中取0.1ml加入YG平板中，涂布均匀，每个浓度三个重复，于28摄氏度条件下培养2天，挑出形态不同的菌落，在YG 平板上多次划线纯化，挑取单菌落转接到YG斜面上，于28摄氏度培养两天，4摄氏度冰箱保存。
（2）蓝白斑筛选;采用蓝白斑选法进行聚磷菌的初筛。
方法为;将在YG平板上分离纯化的菌种到MOPS限磷，过磷平板中，28摄氏度培养2天，观察白斑生长情况。
菌体磷含量的测定：
将筛选好的菌种接在液体培养基的试管里30摄氏度过夜，取25ml加到250ml的锥形瓶中于30摄氏度在摇床中培养，不同时间段生长期测提菌体的含磷量及磷浓度。
方法：
1.取不同生长期的50ml的菌液到离心管中，以12000 r /min 离心5min ,用无菌水溶解，再离心，重复3次的湿菌体，于105℃烘干测菌体干重。
2.将称重后的菌体无菌水溶解后再用过硫酸钾进行消解，按总磷测定方法测菌体磷含量。
3.上清液磷含量测量：在称干重时同时取第一次离心的上清液，取上清液按总磷的测定方法测磷浓度。
记录培养液磷浓度随培养时间的变化。
2.革兰氏鉴定
1）涂片：在载玻片滴一滴水用接种环以无菌操作挑取上述筛选好的菌体于水滴中室温自然干燥
2）初染：草酸铵结晶紫染色液1到2分钟。
倾取染液，自来水慢洗到玻片无色。
3）媒染：加一到两滴革兰氏碘液染1~~3分钟水洗。
4）脱水：酒精一到两滴30秒到1分钟，水洗。
5）复染：石碳酸复染红10到20秒，水洗。
6）镜检：待玻片干后先用低倍镜观察，再用油镜观察。
紫色为阳性，红色为阴性
实验结果与分析。