骨骼肌卫星细胞的研究进展

C
D
C 利用兔ER-β特异性多克隆抗 体孵育细胞 D 苏木精染色细胞核
由图可以看出，对骨骼肌细胞核ERα和ERβ进行免疫组织化学染色显示在来源于 卫星细胞的成肌纤维上显阳性。
X. Li等（2009）以鸡卫星细胞为材料研究转化生长因子-β1（TGF-β1）对肌肉 细胞的凋亡作用。
由左图可以看出，实验组 细胞凋亡的数量显著高于 对照组，说明TGF-β1能诱 导卫星细胞凋亡。
以体外培养的骨骼肌卫星细胞为材料对 骨骼肌纤维类型进行研究，发现肌纤维的生 长规律，为体外调控肌纤维生长，改善肉品 质提供理论依据。
随着卫星细胞体外培养技术的成熟，以及研究趋 势的变化，细胞水平上的研究将会越来越广泛。未来 以骨骼肌卫星细胞为材料的研究可能会集中在以下几 个方面： 1 建立各物种、品种骨骼肌卫星细胞体外培养体系； 2 细胞水平的各功能基因的研究； 3 体外培养的卫星细胞用于疾病治疗的研究； 4 利用骨骼肌卫星细胞研究动物肌肉生长发育的规律。
织卫 中星 的细 分胞 布在 组
A
B
星刚 细分 胞离 图的 片卫
C
D
星贴 细壁 胞后 的 卫
的长 细满 胞瓶 形底 态时
A
B
A、卫星细胞融合成肌管 B、卫星细胞分化为成熟脂肪细胞
二、卫星细胞分离方法的比较
卫星细胞分离方法有两种：组织块法和酶消化法 组织块法：将肌肉组织在无菌条件下剔除血管、脂 肪、肌腱等组织，用眼科剪剪成1mm3的小块，然后 培养在培养瓶中，3天左右卫星细胞就从组织块周围 爬出，待细胞长满培养瓶的70%～80%后就消化传 代得到卫星细胞。
骨骼肌卫星细胞的研究进展
目录
一、基本概念的介绍 二、卫星细胞分离方法的比较 三、卫星细胞纯化方法的比较 四、卫星细胞的鉴定方法 五、卫星细胞在畜禽上的研究进展
一、卫星细胞基本概念的介绍
卫星细胞：骨骼肌卫星细胞位于肌膜和基底膜之间， 一般情况下这些细胞处于静止状态，当肌细胞受到损 伤刺激或诱导时，卫星细胞才被激活、增殖，并与原 有的骨骼肌细胞相互融合，形成新的肌纤维细胞。 总结卫星细胞的功能，可以得出以下几个要点： 1 位于肌膜和基底膜之间，起源于中胚层干细胞,是一 种肌源性干细胞； 2 一般情况下处于静止状态，当肌细胞受到损伤刺激 或诱导时才被激活； 3 卫星细胞具有分化功能，在一定条件下可以向成心 肌细胞、成脂细胞以及成骨细胞等方向分化。
参考文献：中文15篇，英文37篇 近5年文献：48篇
这些试验结果为我们研究肌肉生长的调节提供了基本依据。
由以上几篇文章可以看出，在骨骼肌卫 星细胞上进行的功能基因的研究主要是研究 基因的表达水平和功能，为后续的深入研究 （如基因功能调控）和生产实践（如调节生 长发育）提供理论依据。
4 利用骨骼肌卫星细胞进行肌纤维类型转换的研究进展
J.M. Gonzalez等（2007）为了研究雷托巴胺盐酸盐（RAC）和群勃龙醋酸 酯（TBA）对背最长肌纤维横截面积（CSA）、直径和卫星细胞数的影响。
两种纯化法的比较
表2 单位面积内两组细胞增殖情况 （n=10
x±s ）
单位面积内细胞个数（个/mm2） 组别 2d 3d 4d 5d 6d
贴壁组 27±10 39±13 51±13 71±12 93±19 梯度组 29±12 35±12 43±11 67±17 91±22
注：同一时刻每两组之间比较均为P>0.05。 由上表可以看出，两种纯化方法对卫星细胞 的增殖无显著性差异。
胰酶
胶原酶
aP＜
1.47±0.09
0.006±0.001
93.00±3.00
93.00±4.30
0.05
三、卫星细胞纯化方法的比较
卫星细胞纯化方法最常用的包括差速贴壁法、 Percoll液梯度离心法。 差速贴壁法：关键是利用成纤维细胞贴壁能力比卫星 细胞强而先贴壁的原理来分离细胞。成纤维细胞的贴 壁时间一般为30～60min，因此在此时间段内转出上 清液于一新培养瓶，重复3次即可完成细胞的纯化。 Percoll液梯度离心法：先将离心管壁用牛血清湿润， 除去多余血清，将600mL· L -1和200mL， 加入重悬后的细胞悬液3mL，1000r· min-1离 25min， 取交界面的细胞，即为卫星细胞。
猪
消化方法
胶原酶和胰 酶混合消化
纯化方法
差速贴壁法
培养基
含10%或15%FBS培 养基
参考文献
何波等（2006） 高琦等（2006） 李冲等（2007）
鸡
Ⅰ型胶原酶 和胰酶两步 消化
机械法和酶 消化法相结 合 链霉蛋白酶
差速贴壁法
含10%FBS培养基
陈岩等（2006） 李芳华等（2010） 郑素月等（2011）
卫星细胞分化为肌管
卫星细胞分化为脂肪 细胞
阮井玲等（2008）以体外培养的猪骨骼肌卫星细胞为实验材料，利 用RNAi技术，以Smad3为靶基因进行干扰研究，研究干扰前后猪骨 骼肌卫星细胞增殖情况的变化。下图可以看出干扰后猪骨骼肌卫星 细胞增殖速度与正常细胞相比较快（Ｐ＜0.05）。X. Li等（2008） 以鸡骨骼肌卫星细胞为对象也证明Smad3依赖的信号通路可能涉及 到卫星细胞增值和分化的管理。
表3 两组卫星细胞融合率比较（ 组别 贴壁组 梯度组 n 10 10
）
成肌细胞融合率（%） 20.6±5.3 33.2±8.9a
注：与贴壁组比较，aP﹤0.01. 从统计结果可以看出，梯度离心纯化法培 养的卫星细胞融合率明显比差速贴壁法的细胞 融合率要高，差异极显著（P＜0.01)，证明这 种方法获得的细胞纯度更高。
酶消化法：酶消化法就是向组织块中加入适量的酶 ，在37℃恒温水浴锅中消化一段时间，然后加入含 血清的培养基终止消化，最后进行分离培养。 酶消化法所使用的酶主要有胶原蛋白酶、胰蛋白酶 、链霉蛋白酶三种。
链霉蛋白酶、胰酶和胶原酶消化猪骨骼肌对比实 验结果如下表： 表1 各种消化酶消化细胞所得的细胞数和存活率比较 消化酶 链霉蛋白酶 细胞数（×106个） 2.83±0.24a 存活率（%） 95.00±3.50
S. E. Ouellette等（2009）为了鉴定LEK1的功能，通过细胞转染技术抑制 LEK1蛋白（ΔLEK1(991) 和ΔLEK1(911)）评估细胞增殖情况。
由图可以看出，经转染 以后，Ki67的表达量降 低，说明LEK1起到协调 肌原性细胞增殖的作用。
A. K. Tripathi等（2011）通过体外培养的成肌细胞，利用了实时荧光定量PCR 检测了肌肉抑制素，卵泡抑素，核心蛋白聚糖和三种特殊的肌肉转录因子在 成年山羊肌管中的mRNA表达水平。
由表中数据显示TBA和RAC对Ⅰ型纤维的作用效果要明显。
黄金秀等（2010）研究不同浓度共轭亚油酸（conjugated linoleic acid， CLA）对体外培养的猪骨骼肌肌纤维类型组成的影响规律。以体外培养的 原代猪骨骼肌卫星细胞为材料，在卫星细胞向肌纤维转化时添加不同水平 CLA 。分别采用相对定量RT-PCR测定肌纤维中MyHCⅠ、MyHC2a、 MyHC2b、MyHC2x4种MyHC基因表达。
Pax7是静息期的特异性标志， MyoD 和Desmin是增殖期的特异性标志。
五、卫星细胞在畜禽上的研究进展
1 畜禽卫星细胞体外培养体系建立的研究进展
从卫星细胞第一次被发现至今，关于体 外培养体系建立的研究已经取得了很大的进 展，技术也很成熟，下面就简要介绍一下各 物种在这方面的研究进展。
表4 畜禽卫星细胞体外培养体系建立的研究进展 动 物
庄新杰等（2009）
牛
差速贴壁法
含10%犊牛血清培养 基 10%FBS培养基
山羊
梯度离心法
Keitaro YAMANOUCHI等 （2007）
2 骨骼肌卫星细胞增殖分化的研究进展
E. K. Sissom等（2006）研究美仑孕酮醋酸盐(MGA)或黄体酮(P4)对牛骨骼肌 卫星细胞的影响。
Keitaro YAMANOUCHI等（2007）为了检验山羊骨骼肌细胞在体外 具有向成肌细胞和成脂细胞分化的能力。
影响细胞增殖和分化的因素很多，如上文 提到的外源添加的黄体酮可影响细胞增殖，同 时也受基因的调控如Smad3等。卫星细胞在体 外分化同样受到环境的控制，生长密度大或培 养在含胰岛素、转铁蛋白的培养基中，细胞就 会向成肌或成脂方向分化。
3 在骨骼肌卫星细胞中开展功能基因的研究进展
Claudia Kalbe等（2007）从蛋白质水平研究雌激素受体（ERα和ERβ） 是否在从半膜肌（SM）得到的卫星细胞中表达。 A B A 利用老鼠ER-α特异性单克隆 抗体孵育细胞 B 苏木精染色细胞核
四、卫星细胞的鉴定方法
A B C A：Pax7 在细胞核中呈阳性表达； B：应用DAPI 对细胞核进行染色； C：A 与B 叠加图。
D
E
F
D：MyoD 在细胞核中呈阳性表达； E：应用DAPI 对细胞核进行染色； F：D 与E 叠加图片。
G
H
I
G：Desmin 在细胞质中呈阳性表达； H：应用PI 对细胞核进行染色； I：G 与H 叠加图片。