基因工程菌培养及其不稳定性

5. 搅拌器转速和通气应适当
6. 空气过滤系统要采用活性碳和玻璃纤维棉材料
7. 培养液要经化学处理或热处理后才可排放
8. 发酵罐的排气口须有蒸汽灭菌或微孔滤器除菌后才将废气放出。
9. 轴封可采用磁力搅拌或双端面密封
42
中，大量乙酸在透析器中透过半透膜，降低培养基中的乙酸浓度，并
可通过在透析液中补充养分而维持较合适的基质浓度，从而获得高密
度菌体。
膜的种类、孔径、面积，发酵液和透析液的比例，透析液的组成
循环流速，开始透析的时间、透析培养的持续时间段都对产物的产率
有影响。
27
一、基因工程菌的培养方式
5. 固定化培养
基因工程菌培养的一大难题是如何维持质粒的稳定性。 有人将固定化技术应用到这一领域，发现基因工程菌经固定化 后，质粒的稳定性大大提高，便于进行连续培养，特别对分泌型菌 更为有利。 由于这一优点，基因工程菌固定化培养研究已得到迅速开展。
提高发酵罐的供氧能力。
有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因
而采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从
而改善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的
方法都可提高质粒的稳定性。
17
提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
pH pH 影响重组菌的稳定性。
5. 控制培养条件
限制性基质
一般培养基中各成分并不是完全平衡的，经过一段时间的培养， 微生物的生长通常会受到一种或几种物质的限制。
限制性基质的种类对重组菌有不同的影响
16
提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
溶解氧
在基因重组菌的高密度培养时，为了ห้องสมุดไป่ตู้持所需的溶氧水平，除
了提高搅拌转速和通气量，往往还要在通入的空气中补充氧气，以
37
二、基因工程菌的培养工艺
工程菌发酵工艺的优化对异源蛋白的表达关系重大，必须建立最佳化 工艺。
最佳化工艺是获得最快周期、最高产量、最好质量、最低消耗、最大 安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度与最低失败率等指标的保障。
工艺最佳化需对不同的菌种做大量的实验，取得重复性好的准确数据 后，模拟发酵代谢曲线，预测放大值，才能更合理的设计最佳工艺条件。
结构不稳定性 外源基因从质粒上丢失、碱基重排、缺失、修饰
分裂不稳定性（常见） 分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌
3
基因工程菌遗传不稳定性产生机制
结构不稳定性
1. 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 2. 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 3. 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排 4. 外源基因的表达会引起重组质粒的不稳定
连续培养时可以考虑采用多级培养，如在第一级进行生长，维持菌体
的稳定性，在第二级进行基因表达。
12
基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大影响。 提高比生长速率有助于提高质粒稳定性。
基因重组菌的比生长速率与培养环境有关，如温度， pH，溶氧，限制性营养物质浓度，有害代谢产物浓度等。
25
一、基因工程菌的培养方式
3. 连续培养
连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到 一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养
连续培养可以为微生物提供恒定的生活环境，控制其比生长速率 为研究基因工程菌的发酵动力学、生理生化特性、环境因素对基因表 达的影响等创造了良好的条件。
生物技术制药 第二章 基因工程制药
第六节 基因工程菌的稳定性
1
第六节 基因工程菌的稳定性
本节讲解的两个重点内容 1. 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 2. 提高基因工程菌稳定性的方法
2
基因工程菌遗传不稳定性的表现
基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳 定性， 这种不稳定性具有下列两种表现形式：
13
基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
有些含质粒的菌对发酵环境的改变比不含质粒的菌反应慢，因而 采用间隙改变培养条件的方法以改变这两种菌的比生长速率，从而改 善质粒的稳定性。通过间隙供氧的方法和通过改变稀释速率的方法都 可提高质粒的稳定性。
研究表达干扰素 a 的大肠杆菌 W3110(pEC901) 在不同比生长速 率下的质粒稳定性，随着稀释率的增加，质粒稳定性明显增加，干扰 素的比效价也明显增大。
3. 施加选择压力
按载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素
药物和食品生产时禁止使用抗生素 抗生素选择压力对质粒结构不稳定无能为力，对分裂不稳定有效 加入大量的抗生素会使生产成本增加 添加一些容易被水解失活的抗生素，只能维持一定时间
按载体上的营养缺陷型标记，向培养系统中添加相应的营养组份
培养基复杂，成本较高
38
三、基因工程菌的培养设备
发酵罐的组成部分有：
发酵罐体 保证高传质作用的搅拌器、 精细的温度控制和灭菌系统、 空气无菌过滤装置 残留气体处理装置 参数测量与控制系统 培养液配制及连续操作装置等39
40
三、基因工程菌的培养设备
基因工程菌在发酵培养过程中要求
环境条件恒定，不影响其遗传特性，更不能引起所带质粒丢失。
23
一、基因工程菌的培养方式
1. 分批培养
分批培养操作简单，但因不能控制生长，获得的菌体 密度也有限。
24
一、基因工程菌的培养方式
2. 补料分批培养
补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时 间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。
在分批培养中，为保持基因工程菌生长所需的良好微环境，延长 其生长对数期，获得高密度菌体，通常把溶氧控制和流加补料措施结 合起来，根据基因工程菌的生长规律来调节补料的流加速率。
不同的宿主菌及质粒在固定化系统中均表现出良好的稳定性
21
生物技术制药 Biotechnological Pharmaceutics 第二章 基因工程制药
第八节 基因工程菌的培养
22
第八节 基因工程菌的培养
本节讲解的三个重点内容 1. 基因工程菌的培养方式 2. 基因工程菌的培养工艺 3. 基因工程菌的培养设备
10
提高基因工程菌稳定性的方法
4. 分阶段控制培养
菌体生长阶段 诱导外源基因表达阶段
11
提高基因工程菌稳定性的方法
分阶段控制培养
因外源基因表达造成质粒不稳定时，可以考虑将发酵过程分阶段控制 在生长阶段使外源基因处于阻遏状态，避免因表达造成不稳定性问题 的发生；在获得需要的菌体密度后，再去阻遏或诱导外源基因表达。
32
二、基因工程菌的培养工艺
3. 温度的影响
温度对基因表达的调控作用可发生在复制、转录、翻译或小分子的合成 水平上。
33
二、基因工程菌的培养工艺
4. 溶解氧的影响
溶解氧是发酵培养中影响菌体代谢的一个重要参数，对菌体的生长和产 物的生成影响很大。 维持较高水平的DO2 值（>40%）有利于重组质粒细胞的生长及外源蛋 白产物的形成。
pH 和溶氧是影响微生物生长的重要参数，在发酵罐培养基因重 组菌时，通常都需要维持一定的 pH 和溶氧水平。
18
提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
培养温度
较低的培养温度有利于重组质粒的稳定
19
提高基因工程菌稳定性的方法
5. 控制培养条件
控制目的基因的过量表达
外源基因高效表达时，有可能因竞争利用物质、能量、核糖体等 干扰宿主细胞的正常代谢活动，并造成质粒不稳定。
含低拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较大，增加质 粒拷贝数能提高质粒的稳定性；
含高拷贝质粒的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但是大
量外源质粒的存在使含质粒菌的工程菌的比生长速率明显低于不含质
粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快地取代含质粒菌而成为优势菌
对质粒的稳定性不利。
9
提高基因工程菌稳定性的方法
氨水、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵等 。 其他：无机盐、微量元素维生素、生物素等。
30
二、基因工程菌的培养工艺
1. 培养基的影响
使用不同的碳源对菌体的生长和外源基因的表达有较大的影响。 如以甘油为碳源，菌体得率较大，而以葡萄糖为碳源菌体产生的副产物较多 葡萄糖对lac 启动子有阻遏作用，采用流加措施，控制培养液中葡萄糖的较 低浓度，可减弱或消除葡萄糖的阻遏作用。 还有无机磷对产物的影响也较大。
使用可控型启动子控制目的基因的定时表达及表达程度 使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数
20
提高基因工程菌稳定性的方法
6. 固定化
固定化可以提高基因重组菌的稳定性
基因重组大肠杆菌进行固定化后，质粒的稳定性及目的产物的表 达率都有了很大提高。
在游离重组菌系统中常用抗生素，氨基酸等选择性压力稳定质粒 的手段，往往在大规模生产中难以应用。而采用固定化方法后，这种 选择压力则可被省去。
28
二、基因工程菌的培养工艺
材料
基因工程菌的发酵工艺 带外源基因重组载体的微生物
传统微生物发酵工艺 不含外源基因的微生物
目的
使外源基因高效表达，尽量减 少宿主本身蛋白的污染
自身基因表达所产生的 初级或次极代谢产物
29
二、基因工程菌的培养工艺
1. 培养基的影响
碳源：葡萄糖、甘油、乳糖、甘露糖、果糖等。 氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、
26
一、基因工程菌的培养方式
4. 透析培养（Dialysis culture）
透析培养是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要
目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。