(整理)2006年生物化学.

2006年生物化学1.举5例说明绿色荧光蛋白在生物化学研究中的应用1活细胞内基因表达与蛋白质-蛋白质相互作用的光学成像与可视化（基于GFP的荧光共振能量转移，信号传导过程）2小动物体内恶性肿瘤生长过程及药物作用效果的实时光学成像检查，（荧光探针，找出与已知蛋白的配体分子及药物。

3制备融合抗体，具有免疫原性和发射荧光两种特性。

4构建分子感受器的有力工具，这种GFP感受器能被用来检测多种分子5研究活体细胞的蛋白变他过程，细胞器动力学和内膜运输（动态跟踪，微管的变化，定位在细胞器）6.GFP基因在生物防治中的应用，评价杀虫剂的毒力。

7GFP 的示踪特性，研究肿瘤细胞内某些基因异常表达与肿瘤细胞浸润的关系，即可揭示肿瘤细胞浸润的某些机制。

8.在微生物学中的应用（与宿主的相互作用，生物膜。

基因表达，生物降解，定位等）2.请说明真核生物中逆转座子的结构特征和生物学意义通过DNA转录为RNA后，再经逆转录称为cDNA并插入到基因组的新位点上的移动因子。

3.某一蛋白样品在SDS-PAGE上经靠马斯亮蓝染色呈现单一的条带。

是否可以认为此蛋白样品只包含一种蛋白？如何进一步鉴定这个蛋白的纯度不能认为是单一蛋白，SDS-PAGE上仅仅代表的是分子大小一直的条带，可以进行双向电泳（two-dimensional electrophoresis）。

它是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。

比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。

常用的有下列几种方法：等电点沉淀法，盐析法，有机溶剂沉淀法，样品的进一步分离纯化用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。

常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。

有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。

4.简述免疫共沉淀的原理及应用定义：用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该分子特异性结合的其他分子也会被带着一起沉淀出来的技术。

这种技术常用于验证蛋白质之间相互特异性结合。

原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

应用：1.信号转导，确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法2.肿瘤异质性(肿瘤细胞在生长过程中，经过许多代分裂繁殖产生的子细胞，呈现不同的基因改变或其他大分子的改变)的蛋白质分子机制5.转基因食品渐渐地被摆上餐桌，请根据你的生化知识谈一谈你对转基因食品安全性的认识实质等同原则。

6.请详细说明真核生物基因表达在不同水平上的调节机制7.中国科学家2005年在生命科学研究领域获得了大丰收，在CELL、Science、Nature上发表了多篇原创性文章。

请说出其中两篇的主要内容和主要作者或主要作者单位。

2007年生物化学一、名词解释1.Alternative Splicing2.Nonsense mediated decay3.RNA editing4.mircoRNA5.small interfering RNA（siRNA）二、简述真核生物中分泌型蛋白的转运途径级主要的生理功能三、请说明真核生物中转座子的两大类型、各自的转座方式及生物学意义转座元件是基因组中可移动的DNA分子，分为反转录转座子和DNA转座子两类，Dna转座子是一段能直接在基因组上移动的DNA序列,它的转座利用切除/修复机制，不会引起宿主基因组的增大。

反转录转座子不同于dna转座子,是以DNA-RNA-DNA的途径来实现转座,在整合酶的作用下新生成的DNA状态的反转录转座子整合到宿主基因组中.这样,反转录转座子在宿主基因组中的拷贝数得到不断积累,从而使基因组增大.根据是否具有编码反转录酶的能力,反转录转座子又分为长末端重复序列(LTR)反转录转座子和非LTR反转录转座子两个亚类,而DNA转座子分为自主元件、非自主元件和微型反向重复转座元件(MITE)三种类型，都具有两个末端反向重复序列。

生物学意义：目前转座子元件是植物分子生物学操作和植物基因工程中分离克隆基因和研究基因功能最有力的工具之一，其中的一大类—反转录转座子具有分布广、异源转座高和受组织培养诱导激活等优势，因此它的发现和利用又为转座子标签的应用提供了更广阔的前景。

（不了解基因产物的生化性质和表达模式的情况下，分离克隆植物基因，即转座子标签(transposon tagging)），此外通过对现有转座元件的改造以及转座元件作为载体改造的工具，也将大大加速植物基因和功能序列的分离与研究，如利用转座子元件构建启动子捕捉载体，效率比T-DNA标签高四、简述免疫共沉淀及酵母双杂交实验的原理及个自己的优缺点免疫共沉淀优点（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

免疫共沉淀缺点（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

酵母双杂优点：⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。

⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。

⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。

⑷酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。

酵母缺点：。

⑴双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。

另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。

⑵酵母双杂交系统的一个重要的问题是"假阳性"。

由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录。

另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。

五、用大肠杆菌表达带有GST标签的X蛋白，通过免疫家兔获得针对该融合蛋白的多克隆抗体血清，请你设计实验纯化X蛋白特异性抗体（与GST无免疫交叉反映）过去有用盐析法纯化的，有用辛酸-硫酸铵沉淀的方式纯化的，也有用冷酒精沉淀的方式纯化的，也有后来的离子交换层析，抗原亲和层析得到的抗体效率高、产量高、产品纯、操作简单。

步骤如下：1、介质的制备2、抗原与填料的连接 (X蛋白+gst BEADS)3、连接效果的评估4、多余位点的封闭5、抗血清与beads的结合6、非特异性结合的抗体的洗涤纯度鉴定：SDS-PAGE六、你的课题设计到研究某个蛋白的生物学功能，在你开始具体试验之前，利用网络资源，你需要获得该蛋白的哪些相关信息？通过这些信息，可预测该蛋白的结构与功能。

蛋白质的氨基酸序列、结构、和其他蛋白的同源序列和同源区域、表达情况DNA序列数据库有GenBank(美国)，一.蛋白功能预测：根据序列预测功能，序列相似性，保守域，和亚结构，blastp序列特征：疏水性----跨膜螺旋，前导序列二.结构预测：二级结构：PHD程序三级结果：蛋白质自动建模服务器，用于同源性建模，2008年生物化学一、名词解释表观遗传学：：：是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科。

表观遗传学涉及到 DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色体重塑和非编码 RNA 调控等内容，，，，，表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation），基因组印记（genomic impriting），母体效应（maternal effects），基因沉默（gene silencing），核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑（RNA editing）等。

组蛋白密码组蛋白密码信息存在于转录后组蛋白修饰等过程中。

组蛋白氨基末端的多样化修饰扩充了遗传密码的信息库。

组蛋白密码可被一系列特定的蛋白质所识别,将其翻译成一种特定的染色质状态以实现对特定基因的调节1.chromatin remodeling DNA复制、转录、修复、重组引起耗能的在染色质水平发生位置和结构的变化染色质重塑属于表观遗传学的范畴.细胞分化中的染色质结构，细胞有丝分裂中的染色质结构DNA复制程序性与染色质结构关系DNA甲基化、miRNA/siRNA 引起的染色质重塑主要参与基因转录的调控.并与细胞凋亡、DNA损伤修复、细胞增殖分化、维持基因组稳定性等方面相关.调控染色质重塑的途径或者机制主要有组蛋白修饰、组蛋白突变体的替代。

ATP酶依赖的染色质重塑复合体、DNA甲基化、非编码RNA调控等.2.glyconeogenesis 由简单的非糖前体（乳酸、甘油、生糖氨基酸等）转变为糖(葡萄糖或糖原)的过程。

3.affinity chromatography利用共价连接有特异配体的层析介质，分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白质或其他分子的层析技术如酶与底物的识别结合、受体与配体的识别结合、抗体与抗原的识别结合，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使这种结合解除。

4.ortholog直系同源不同物种中由同一个祖先基因特化而来的对应基因.具有相近甚至相同的功能,由相似的途径调控,在不同的物种中扮演相似甚至相同的角色,因此在基因组序列的注释中,是最可靠的选择.orthologs的生物信息预测方法主要有两类:系统发生方法和序列比对方法.5.retrotransposon 通过RNA中间物进行转座的可移动基因元件。

petitive inhibition 一种最常见的酶活性的抑制作用，抑制剂与底物竞争，从而阻止底物与酶的结合。

其动力学特点是：酶促反应的表观米氏常数增大、最大速度不变。

可以通过增加底物浓度来解除这种抑制。

7.非竞争性抑制：抑制剂与酶分子在底物结合位点以外的部位结合，不影响酶与底物的结合。

因此，只影响酶催化反应的最大反应速度（变小），不影响米氏常数8.反竞争性抑制剂：对酶活性的一种抑制作用，由于所加入的抑制剂能与酶-底物复合物结合，而不与游离酶结合，所以其特征是最大反应速度比未加抑制剂时反应的最大速度低二、请列出6中常见的非编码RNA的名称，简述其功能三、简述蛋白质免疫共沉淀和染色质免疫共沉淀的实验原理，比较他们在网络调控研究中的应用染色质免疫沉淀技术（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。