单基因疾病的分子诊断(教材)
关于单基因遗传性疾病的分子诊断 (2)课件
School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University
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分子诊断原理和技术·单基因遗传性疾病的分子诊断
• 单基因遗传病是指受一对等位基因控制的 遗传病，有6600多种，并且每年在以10-50 种的速度递增，单基因遗传病已经对人类 健康构成了较大的威胁。较常见的有红绿 色盲、血友病、白化病等。
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分子诊断原理和技术·单基因遗传性疾病的分子诊断
单基因遗传病
• 常染色体显性遗传病 • 常染色体隐性遗传病 • X连锁显性遗传病 • X连锁隐性遗传病 • Y连锁遗传病
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分子诊断原理和技术·单基因遗传性疾病的分子诊断
• 所有遗传性疾病都与某种或多种基因的突 变有关，对这类疾病进行分子诊断有两种 策略可供选择：
1. 直接诊断策略； 2. 间接诊断策略
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析，比如荧光原位杂交法。 3.蛋白质水平的诊断：采用生物化学方法分析异常表达的蛋
白质或代谢产物。 4.疾病动物模型的辅助诊断：建立相应的转基因疾病动物模
型，辅助诊断或判定人类疾病的致病基因。
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• 血友病A。病因：血浆中抗血友病球蛋白减少，AHG即第Ⅷ因子凝血 时间延长。临床表现：轻微创伤即出血不止，不出血时与常人无异。
《分子诊断学》教学大纲
《分子诊断学》课程教学大纲课程名称：分子诊断学（Molecular Diagnose）主讲教师：杨晶（教授），申鹤云（副教授）课程编号：学时：24学分：1.5预修课程：生物化学、细胞生物学、微生物学课程简介：分子诊断学是建立在分子生物学和免疫学基础上的医学诊断技术，在充分借鉴现代基因组学与蛋白质组学的研究成果基础上，通过建立各种适用的检测技术将疾病相关基因、蛋白与临床诊断紧密结合，为疾病预防，疾病预警和疗效评价服务，其核心是基因诊断和以单抗为基础的免疫学诊断。
分子诊断技术以其显著优势和巨大潜力，成为保障人类健康的最重要的生物技术之一。
本课程主要介绍分子诊断的常用技术及在科研和临床上的应用，包括ELISA 技术、免疫胶体金层析技术、化学发光技术、时间分辨技术、分子杂交技术、荧光定量PCR技术以及各种芯片技术等，掌握临床常见感染性疾病、单基因疾病和多基因疾病分子诊断策略和方法。
教材：临床分子诊断学郑芳陈昌杰华中科技大学出版社2014.7第一章绪论（2 学时）shen一、主要内容：(一) 分子诊断学的定义及其研究范畴(二) 分子诊断学的发展简史(三) 分子诊断学在医学中的应用二、学习重点和难点：重点：掌握分子诊断学的定义，了解分子诊断学经历了 3 个阶段的发展历史。
难点：一些新型分子诊断技术在医学中的应用。
第二章免疫学诊断技术（6 学时）shen一、主要内容：(一) 抗原抗体反应(二) 免疫浊度测定(三) 放射免疫分析技术(四) 酶免疫分析技术(五) 荧光抗体分析技术(六) 时间分辨免疫荧光技术(七) 荧光偏振免疫分析技术(八) 化学发光免疫分析技术(九) 金标免疫分析技术(十) 标记免疫分析的质量控制二、学习重点和难点：重点：放射免疫分析、酶免疫分析技术、荧光抗体分析技术和免疫浊度检测等技术原理，各种反应模式的原理及应用。
难点：一些新型示踪物的示踪原理（要求一定的物理学和化学知识）。
第三章分子生物学诊断技术（基因诊断技术）（6 学时）一、主要内容：(一)PCR 及衍生技术 1. PCR 技术的基本原理 2. PCR 衍生技术 3. 荧光定量PCR 技术 4. PCR 方法的标准化(二)核酸分子杂交技术 1. 核酸杂交的基本原理 2. 核酸探针 3. 核酸分子杂交技术二、学习重点和难点：重点：FQ-PCR、原位PCR、PCR-RFLP、PCR-ELISA、PCR-SSCP、Southern blot、 Northern blot、原位杂交等技术的原理及其在临床检测中的实际应用。
单基因疾病分子诊断(教材)
分子诊断学的发展
第二代遗传标志（） 短串联重复序列（ ）
人类基因组有3×109，其中10%是串联重 复序列，称为卫星（ ）。可分为大卫星、 中卫星、小卫星和微卫星。 重复单位由2-6组成的叫微卫星，也称它为 短串联重复序列。
• 人类基因组中平均每6-10就有一个位点， 其多态性成为法医物证检验、个人识别和 亲子鉴定的丰富信息资源。
三章单基因疾病的分子诊断
•分子诊断不仅能早期对疾病作出确切的 诊断，也能 • •确定个体对疾病的易感性，判别致病基 因携带者并 •
• 分子诊断不仅广泛应用于单基因疾病、多基因疾 病、感染性疾病和肿瘤疾病的诊断中，而且在症 状前诊断、产前诊断、植入前诊断等各时期的检 查中，以及在法医学、移植配型、耐药性研究、 个性化治疗和预防医学检验中发挥着重要作用。
1.直接诊断策略 基因诊断的直接策略就是通过各种分子 生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此 直接诊断的前提是被检测基因的正常序 列和结构必须被阐明。 直接诊断是直接揭示遗传缺陷，因而比 较可靠。
一、单基因遗传性疾病的基因诊断
2.间接诊断策略 • 间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通 • 过分析可确定个体是否存在双亲同源染色体中 • 的致病染色体 • 间接诊断不是寻找的遗传缺陷，而是通过 • 分析的遗传标志的多态性估计被检者患病的 • 可能性
分子诊断学的发展
第一代遗传标志（） 限制性片段长度多态性分析（ ）
在人类基因组中，不少多态性发生在限制 性内切酶识别位点上，酶切该片段就会产 生长度不同的片段，称为限制性片段长度 多态性。 由于分子产生突变，使某些限制性酶切位 点数增加、减少或移位，导致限制性酶切 片段长度发生改变。
的优点：
分子生物学检验技术-基因病的分子诊断
携带p53基因突变的人经常是李-佛美尼综合症的患者； APC基因是与大肠直肠癌发生有关的肿瘤抑制基因； BRCA1和BRCA2基因的突变则和乳癌相关；
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Rb
正常细胞中具有活性的RB蛋白（pRB）在细胞中保持着低磷酸化或无磷 酸化的状态，它与细胞周期调节因子E2F结合，抑制E2F的活性从而抑 制G1期到S期的进行，也就抑制了转录活性。 RB蛋白的失活途径有以下几种：
RAS家族是信号传递通路G-protein的成份，藉由跨膜蛋白与Gprotein的结合将信号传至核内;
蛋白质-酪胺酸激酶( protein tyrosine kinase) ABL是细胞内信号传 递蛋白与信号传递至核内有关;
核内转录因子;
MYC是DNA结合蛋白，而JUN是转录因子；
细胞周期有关的蛋白;
3. 血清胆红素轻～中度增高，溶血危象时显着增高。本病的溶血虽以血管外溶血为主， 但也存在着血管内溶血；
4. 血浆结合珠蛋白降低，血浆游离血红蛋白可能增高； 5. 红细胞半衰期测定显示红细胞生存时间明显缩短至5～15 天[正常为(28±5)天]； 6. 血红蛋白电泳显示HbS占80%以上，HbF增多至2%～15%，HbA2正常，而HbA缺如；
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癌症的特点
几乎癌组织都是克隆性增殖; 患者的所有癌细胞都起源于单一
的癌细胞; 大多数癌症不能用单基因遗传方
式解释; 某些类型的癌症，亲属发生同类
肿瘤的风险会增加，但不表现孟 德尔遗传; 许多癌症与环境的物理化学因子 或生物因子有关;
造成癌症的因素
遗传因素 一些特殊的基因突变会造成特定的癌症
斑点杂交结果
βΑ/βΑ
《医学分子诊断》课件
诊断原理
分子诊断基于检测和分析样本中的生物分子，如DNA、RNA和蛋白质，以确定疾病的存在、类型和进展程度。
常见的分子诊断方法
1 聚合酶链式反应（PCR）
通过扩增目标DNA段，从而检测和识别基因变异和感染病原体。
2 基因测序
通过读取DNA序列，揭示基因突变、致病基因和个体遗传信息。
3 蛋白质组学
《医学分子诊断》PPT课 件
欢迎来到《医学分子诊断》PPT课件! 在这个课件中，我们将深入探讨包括研 究目的、诊断原理、常见的分子诊断方法、分子诊断在临床中的应用、分子 诊断的优势和挑战、未来发展方向以及总结等内容。
研究目的
我们的研究目的是探索如何利用分子诊断技术提高疾病的早期检测和诊断准 确性，为患者提供更好的治疗方案。
分子诊断的优势和挑战
1
优势
早期检测和诊断、个体化治疗、快速结果、高敏感性和特异性、广泛应用于临床 实践。
2
挑战
技术复杂性、标准化和质量控制、高成本、信息处理和隐私问题、临床实践中的 应用限制。
未来发展方向
未来的分子诊断将更加便携、快速、准确和个体化，结合人工智能和大数据 分析，推动医学进步和健康管理的革新。
总结
分子诊断作为一项重要的医学技术，正在为疾病的早期检测和个体化治疗提 供无限可能。通过不断的研究和发展，我们可以期待更加精准、有效和可靠 的分子诊断技术的出现。
通过分析样本中的蛋白质组成和表达水平，为疾病的诊断和治疗提供重要信息。
分子诊断在临床中应用
癌症诊断
通过检测肿瘤标志物和肿瘤细 胞的分子变化，实现早期癌症 的检测和个体化治疗。
遗传病筛查
通过检测患者的基因序列，提 前发现遗传病风险，为家庭计 划和婴儿出生前干预提供依据。
遗传性疾病的分子诊断
遗传性疾病的分子诊断遗传性疾病是由基因突变引起的一类疾病，其发病机制与遗传相关。
遗传性疾病的分子诊断通过检测遗传物质中的突变和变异来确定患者是否携带相关病因基因。
本文将详细介绍遗传性疾病的分子诊断方法以及其在临床实践中的应用。
一、遗传性疾病的分子诊断方法1. 单基因疾病的分子诊断方法单基因疾病是由单个突变或变异基因引起的疾病，其分子诊断主要依赖于基因突变检测技术，主要包括：- Sanger测序法：通过测序目标基因的外显子序列，检测突变位点的碱基变异情况。
这种方法适用于预测性基因检测和无需快速确定诊断的疾病。
- Next Generation Sequencing（NGS）：NGS技术以其高通量，高灵敏度和高效率的特点成为了单基因疾病分子诊断的首选方法。
通过对目标基因组进行测序，可以检测出各种类型的突变和基因重排等变异。
- 多重荧光PCR：该方法可同时检测多个位点的基因突变，而无需进行目标基因测序。
它在预测性基因检测和快速确定诊断中具有较高的应用价值。
2. 多基因疾病的分子诊断方法多基因疾病是由多个基因突变或变异共同引起的疾病，与单基因疾病相比，其分子诊断方法更加复杂。
目前常用的多基因疾病分子诊断方法包括：- 基因芯片：通过在芯片上固定多个已知突变位点的探针，对目标基因组进行杂交检测。
基因芯片可以高通量地同时检测多个基因的突变和变异。
- 基因组重测序：通过对患者基因组进行大规模测序以获取全基因组信息，然后进行生物信息学分析，筛选出与疾病相关的突变和变异。
基因组重测序技术有助于发现新的疾病相关基因。
二、遗传性疾病分子诊断的临床应用1. 疾病的早期诊断遗传性疾病的分子诊断可帮助医生在患者出现症状之前，通过检测患者遗传物质的突变和变异，确定是否携带相关生成基因。
早期诊断有助于提供更早的治疗干预，降低疾病的发展风险。
2. 遗传咨询和家族规划分子诊断结果还可用于遗传咨询和家族规划。
对于已知患有遗传性疾病家族的人群，分子诊断可提供遗传风险评估，并为他们提供遗传咨询和家族规划建议，以减少遗传性疾病在后代中的传播。
分子诊断第一章至第13章
第一章绪论分子生物学的定义：分子生物学（molecular biology）是研究核酸、蛋白质等生物大分子的结构与功能，并从分子水平上阐述核酸与蛋白质、蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系及其基因表达调控机制的一门学科。
广义分子生物学：包括对核酸、蛋白质等生物大分子结构与功能的研究，以及从分子水平上阐明生命的现象和生物学规律。
狭义分子生物学：偏重于核酸的分子生物学。
主要研究基因或DNA结构与功能、遗传信息的表达及其调控机制等，也涉及到这些过程中相关蛋白质和酶的结构与功能的研究。
分子生物学研究的内容：按照狭义分子生物学的定义，可将现代分子生物学的研究内容概括为：1.基因与基因组的结构与功能。
2.遗传信息的传递。
3.基因表达调控机制。
4.基因工程。
5.结构分子生物。
现代分子生物学的发展：DNA重组技术：工具酶的发现、DNA的体外连接、载体的构建。
核酸分析技术：核酸杂交技术、DNA序列分析技术、PCR技术。
基因组研究：人类基因组计划、模式生物基因组。
基因表达调控：操纵子调控机制、真核基因调控方式、小分子RNA的研究。
细胞信号转导研究：G蛋白偶联信号转导、各种受体分子的研究。
技术应用成果：癌基因的发现、转基因技术、基因诊断和治疗、生物药物生产。
分子生物学发展趋势：功能基因组学←蛋白质组学→生物信息学。
医学分子生物学定义：定义：主要研究人体生物大分子的结构、功能、相互作用及其同疾病发生、发展的关系。
研究内容：主要研究人体发育、分化和衰老、细胞增殖调控、三大功能调控系统（神经、内分泌和免疫）的分子生物学基础；基因结构异常或调控异常与疾病发生、发展的关系；基因诊断、治疗和预防；生物制药。
在基础医学中的应用：在分子水平上对人的生理功能和病理机制进行研究；出现新的边缘学科——分子生理学、分子药理学、分子病理学、分子遗传学、分子免疫学、分子病原学、分子肿瘤学、分子遗传学、分子神经科学等；各学科在分子水平上进行整合的趋势；形成“反向遗传学”研究途径。
单基因遗传性疾病的分子诊断课件
杂交
不杂交
不杂交
杂交
正常 杂合子轻型 重型
,
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• 反向点杂交同时诊断β基因多个点突变
M1 M2 M3 M4 M5 M6
正常探针 突变探针
基因芯片技术
现在已经开发了多种诊断β地贫的芯片检测阅读
系统，系统多采用国际先进的体外扩增结合芯片
反向点杂交检测技术，可快速准确检测全血样本
中β珠蛋白基因上多个基因, 位点的突变
,
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直接诊断策略和方法：
1、点突变的诊断
• 直接检测基因点突变：等位基因特异性寡核苷酸杂交（）、 －、等位基因特异性扩增（）、－、基因芯片技术等；
• 基因背景未知的点突变：单链构象多态性（）、变性梯度 凝胶电泳（）、异源双链分析（）、序列测定、蛋白截短 测试等。
,
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2、片段性突变的检测
• 片段性突变是指分子中较大范围的碱基发生突变， 如碱基的缺失、插入、扩增和重组。对于少数核苷 酸缺失或插入，可以采用检测点突变的方法，而对 于大的片段突变，则使用印迹技术和多重技术。
654* 579
↓ IVS II
b-globin gene
B
IVS I
IVS II
mRNA(N)
C
mRNA(M)
73bp
b654 的剪接模式
,
42
• β654基因突变的分子诊断－法诊断剪切异
常
Normal
Patient
ββ
β β０ β０ β０
254bp 181bp
轻型 重型
,
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• β654基因突变的分子诊断－方法
1.分子水平的诊断：包括限制性片段长度多态性的酶切分析、 基因型和单体型的连锁和关联分析、基因的序列分析。
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• RFLP的缺点： 1）酶切只能产生2-3个片段，可提供的信息
量有限。 2）有时需要用放射性同位素标记的DNA片段
作为探针检测RFLP。 3） 无法克服RFLP多态信息含量低的缺陷。
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分子诊断学的发展
第二代遗传标志（STR） • 短串联重复序列（short tandem repeat）
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分子诊断学的发展
第一代遗传标志（RFLP）
• 限制性片段长度多态性分析（restriction fragment length polymorphism） 在人类基因组中，不少DNA多态性发生在限制性内 切酶识别位点上，酶切该DNA片段就会产生长度 不同的片段，称为限制性片段长度多态性。 由于DNA分子产生突变，使某些限制性酶切位点数 增加、减少或移位，导致限制性酶切片段长度发 生改变。
第十三章 单基因疾病的分子诊断
• 分子诊断不仅能早期对疾病作出确切的诊断，也能
确定个体对疾病的易感性，判别致病基因携带者并 对疾病的分期、分型、疗效监测和预后作出判断 • 分子诊断已成为实验诊断学的一个重要组成部分
单基因疾病的分子诊断(教材)
• 分子诊断不仅广泛应用于单基因疾病、多基因疾 病、感染性疾病和肿瘤疾病的诊断中，而且在症 状前诊断、产前诊断、植入前诊断等各时期的检 查中，以及在法医学、移植配型、耐药性研究、 个性化治疗和预防医学检验中发挥着重要作用。
研究时间。
单基因疾病的分子诊断(教材)
• 遗传性疾病：由于人体的遗传物质发生改 变所引起的疾病。
• 致病基因：能够导致遗传性疾病发生的基 因。
• 遗传性疾病分为两类：单基因病、多基因 病。
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单基因病：是指一种遗传病的发生只受一对 等位基因控制，他们的遗传方式遵循孟德 尔分离定律。
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分子诊断的策略
• 直接诊断 • 基因多态性连锁分析 • 基因突变的定量诊断
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• 直接诊断：直接检测导致遗传性疾病的各 种基因突变
• 类型：点突变 缺清楚
单基因疾病的分子诊断(教材)
一、单基因遗传性疾病的基因诊断
(一)点突变的诊断
1、 基因背景清楚的点突变 • 等位基因特异性寡核苷酸杂交(allele specific
oligonucleotide, ASO) • 限制性片段长度多态性分析PCR-RFLP • 测序 • 基因芯片技术
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人类基因组DNA有3×109bp，其中10%是串 联重复序列，称为卫星DNA（satellite DNA）。可分为大卫星、中卫星、小卫星和 微卫星。 重复单位由2-6bp组成的叫微卫星，也称它 为短串联重复序列。
单基因疾病的分子诊断(教材)
• 人类基因组DNA中平均每6-10kb就有一个 STR位点，其多态性成为法医物证检验、个 人识别和亲子鉴定的丰富信息资源。
• STR标记主要位于非编码区，变异一般不影 响人体的结构与功能。
• 灵敏度高，ng级DNA就可以有效扩增。 • 适用生物检材类型十分广泛，对古代DNA也
可检测。
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分子诊断学的发展
第三代遗传标志（SNP） • 单核苷酸多态性(single nucletide
polymorphism) 在基因组中，不同个体的DNA序列上的单个 碱基的差异被称为单核苷酸多态性。 基因型：一个人所拥有的一对等位位点的类 型被称为基因型。（genotype）
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单基因疾病的三种遗传方式
2. X连锁遗传（ X-linked inheritance） X连锁显性遗传有遗传性肾炎、抗维生素D性
佝偻病等。 X连锁隐性遗传：假肥大性肌营养不良、血友
病、红绿色盲等。
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3 常见的线粒体疾病 • 肌阵挛性癫痫伴碎红纤维病(MERRF)是一种线粒 体脑肌病 • Leber遗传性视神经病(LHON)是一种罕见的眼部 线粒体疾病 • 帕金森病（PD）
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• SNP的优点： • 1）SNP在基因组中的分布广泛。 • 2）SNP在人群中是二等位基因性的，在任
何人群中其等位基因频率都可估计出来。 • 3） SNP是高度稳定的。 • 4）部分位于基因内部的SNP可能会直接影
响产物蛋白质的结构或基因表达水平。 • 5）易于进行自动化、规模化分析，缩短了
3. 线粒体遗传（mitochondrial inheritance）
单基因疾病的分子诊断(教材)
单基因疾病的三种遗传方式
1. 常染色体遗传（autosomal inheritance） 常染色体显性遗传疾病有Huntington病、 脊髓小脑性共济失调Ⅰ型等。 常染色体隐性遗传疾病有镰状细胞贫血、 苯丙酮酸尿症和先天聋哑Ⅰ型等。
• 多基因病：两个以上基因的结构或表达调 控的改变，如糖尿病、高血压、冠心病、 骨质疏松症等。
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单基因疾病的三种遗传方式
1. 常染色体遗传（autosomal inheritance）包括： 常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传。
2. X连锁遗传（ X-linked inheritance）包括： X 连锁显性遗传和X连锁隐性遗传。
单基因疾病的分子诊断(教材)
RFLP的优点： 1）无表型效应，其检测不受环境和发育阶段
的影响。 2） RFLP标记在等位基因之间是共显性的，在
配制杂交组合时不受杂交方式的影响。 3）在非等位的RFLP标记之间不存在上位效应，
因而互不干扰。 4） RFLP标记源于基因组DNA的自身变异，在
数量上几乎不受限制。
点突变 • 点突变：DNA分子中单个碱基的替换 • 终止密码子突变：
点突变导致提前产生终止密码，或终止密 码突变而编码一个氨基酸使肽链延长
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一、单基因遗传性疾病的基因诊断
• 各种点突变所造成的后果： 蛋白质分子量改变 蛋白质合成量下降 无蛋白质合成
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