基因工程复习要点
基因工程复习要点
基因工程复习要点一1.载体的功能1.运送外源基因高效转入受体细胞2.为外源基因提供复制能力或整合能力3.为外源基因的扩增或表达提供必要的条件2.基因工程学科建立的理论和技术发明1.三大理论：DNA是遗传物质、1953年提出DNA的双螺旋结构、提出中心法则和遗传密码2.三大技术：工具酶的发现、载体的发现、逆转录酶的发现3.质粒的特点质粒是一类存在于细菌和真菌细胞中能独立于染色体DNA而自主复制的共价、闭合、环状DNA分子，也称cccDNA.通常在1~100范围内。
自主复制性、可扩增性、可转移性、不相容性4.描述PBR322质粒筛选过程PBR322质粒有两个标记基因，氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。
若在康四环素抗性基因上插入外源DNA,则1.先将转化液涂布在含有氨苄青霉素的平板上，未长的菌落是未导入质粒的菌落2.再将上述平板上存活的菌落影印到含有四环素平板上，在四环素上不长但在氨苄青霉素上长的转化子即为重组子。
5.简述PUC系列质粒筛选重组子的过程PUC是在PBR322质粒上改造的若在lacZ’标记基因上插入外源DNA，则将转化液涂布在含有Amp的平板上，蓝色菌落为非重组子，白色菌落为重组子，没长的未导入质粒。
6.基因工程操作的基本流程1.离：从供体细胞中分离出基因组DNA2.切、连：用限制性核酸内切酶分别将外源DNA和载体分开,用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到载体分子上，构成重组DNA分子3.转、增：将重组DNA导入受体细胞，段时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子或使其整合到受体细胞的基因组中4.筛：筛选经转化处理的细胞，获得外源基因高效稳定的基因工程菌或细胞5.表达：筛选好的菌或细胞导入到受体中使其高效稳定表达7.为什么说逆转录酶的发现对基因工程学科的建立至关重要1.对分子生物学的中心法则进行修正和补充2.使真核基因的制备成为可能可将mRNA反转录形成DNA用于获得目的基因3.在致癌病毒的研究中发现癌基因，为肿瘤发病机理的研究提供有价值线索8.蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。
基因工程复习重点
Southern blotting：即DNA印迹杂交，以碱基互补配对为原则，将DNA影印转移与标记探针进行高特异性杂交的方法。
Cosmid：黏粒载体，含有λ噬菌体的cos位点和质粒的复制子，是专门为克隆大片段设计的载体。
cDNA library：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增称cDNA文库。
RACE：通过反转录和PCR技术进行cDNA末端快速扩增，得到基因转录本的未知序列，从而获得mRNA完整序列的方法。
RT-PCR：即逆转录PCR，先用逆转录酶作用于mRNA，以寡聚dT为引物合成cDNA 第一链，然后用已知一对引物，扩增嵌合分子的一种方法。
MCS：包含多个限制酶切位点的一段短的DNA序列。
插入失活：若把外源DNA片段插入到载体的选择标记基因中而使此基因失活，丧失其原有的表现特性，此方法叫插入失活。
PCR：是模拟体内DNA复制条件，应用DNA聚合酶反应，特异性扩增某一DNA片段的技术。
mRNA差异显示技术：根据真核生物mRNA带有3’poly(dA) 的结构，合成poly(dT)12MN引物与mRNA的3’端互补，在反转录酶的作用下合成cDNA－mRNA 杂交分子。
然后合成5’随机引物(10bp) 和poly(dT)12MN引物，PCR扩增获得所有mRNA的cDNA分子。
巢式PCR：巢式PCR使用两对PCR引物扩增完整的片段。
第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。
第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。
实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。
蛋白质印迹法：又称免疫印迹法，在蛋白质凝胶电泳和固相免疫测定基础上发展起来的蛋白质检测技术，检测蛋白样品中是否存在抗原，也可以评价新抗体的特异性。
大学基因工程复习归纳重点复习资料
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。
宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。
4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
基因工程复习知识点
基因工程复习资料一、知识点1.根据基因工程的定义，能替代基因工程的术语。
2. 含有II型限制性内切酶切位点的DNA 片段的特点。
3.已知一双链DNA分子，分别用限制酶Ⅰ、限制酶Ⅱ切割单独切割得到不同片段；同时用限制酶Ⅰ和限制酶Ⅱ切割时，得到另外的片段，据此分析该双链DNA分子结构及酶切位点情况。
4．质粒分子生物学的描述。
5．在植物基因工程中广泛使用的载体。
6．质粒带有α互补的 lacZ'标记基因，那筛选培养基中加入显色底物和诱导物分别为？7．载体常用的选择性标记：抗生素、生化标记、营养缺陷型标记的包括哪些（要能区分缩写符号）。
8．DNA双链是靠什么化学键维持？9．能有效区分重组子与非重组子的是方法有哪些？10．离体cDNA 合成中所涉及的工具酶是有哪些？11．强化基因转录的元件是哪些？12．基因调控元件中属于负调控顺式作用元件的是哪些？13．关于包涵体的叙述。
14. 在单子叶、双子叶植物及动物的遗传转化过程中，应用最成功的间接转化法分别是什么15. 在对转基因植物进行分子鉴定时，检测外源基因的整合、表达、转录，分别可以采用哪些方法？16．细菌存在限制-修饰的现象，其生理意义是什么？17．Taq DNA 聚合酶的发现使得 PCR 技术的广泛运用成为可能，是利用其哪个特点？18．关于柯斯质粒（cosmid）描述。
19．Cosmid、 -DNA 、 Plasmid几种常用载体的装载量大小比较20．载体质粒 pBR322上的两个选择性标记： Ap r、 Tc r。
它们分别含有一个单一酶切位点： Pst I 、 Sph I。
若将一外源基因插入Ap r中的Pst I位点，那么转化子和重组子如何筛选，若插入Sph I又如何筛选？21．DNA-DNA,DNA-RNA分子杂交的化学原理是什么（靠什么维持其双链稳定性）？22．cDNA 法获得目的基因的特点表现为？23．原核生物启动子的特征是有哪些？24．强化 mRNA 翻译的元件是哪些？25．高等哺乳类动物基因在大肠杆菌中高效表达时，包涵体形成的原因是？26.动物基因转移法中的胚胎干细胞法有何特点？（）27. 如何正确理解基因漂移？28.熟悉pBR322、pUC18/19载体的组成元件及作用、简写所代表的含义。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因堆叠技术和dna重组技术，就是以分子遗传学为理论基为础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内乌核酸酶就是一类能够辨识双链dna中特定核苷酸序列（辨识序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内乌核酸酶通常就是以第一次抽取至这类酶的生物的种名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字ⅰ、ⅱ、ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.dna连接酶：定义：dna连接酶也称dna黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接dna链3‘-oh末端和，另一dna链的5’-p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的dna链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌dna连接酶、t4dna连接酶、tscdna连接酶、真核生物细胞辨认出的连接酶，例如酶ⅰ、酶ⅱ、酶ⅲ等多种类型。
4.dna片段的相连接方法：①具互补黏性末端dna片段之间的连接：可用e?colidna连接酶，也可用t4dna连接酶。
②尼奥罗末端dna片段之间的相连接：就可以用t4dna连接酶，并且必须减少酶的用量。
③dna片段末端修饰后进行连接：dna片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；dna片段5′端脱磷酸化后进行连接；dna片段加连杆或衔接头后连接。
5.dna聚合酶：①定义：dna聚合酶就是指用dna单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化剂制备一条与模板链序列优势互补的dna新链的酶。
基因工程复习提纲
1.1 DNA重组技术的基本工具一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
概念分析①基因工程技术的原理：基因重组②目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
③操作水平：DNA分子水平④操作环境：体外⑤优点：克服远缘杂交不亲和障碍，定向改造生物性状从结构上分析，为什么不同生物的DNA能够重组?(1)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。
(2)双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构(1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循中心法则。
(3)生物界共用一套遗传密码。
二、基础理论和技术的发展催生了基因工程（一）基础理论的重大突破①DNA是遗传物质的证明 1944年，艾弗里等人通过不同类型肺炎双球菌的转化实验，不仅证明了生物的遗传物质是DNA，还证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体，艾弗里等人的工作可以说是基因工程的先导。
②DNA双螺旋结构和中心法则的确立1953年，沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型。
1958年，梅赛尔松和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
中心法则阐明了遗传信息流动的方向。
③遗传密码的破译人们认识到，自然界中从微生物到人类共用一套遗传密码，而且为基因的分离和合成等提供了理论依据。
（二）技术发明使基因工程的实施成为可能①基因转移载体的发现 1967年，罗思和赫林斯基发现细菌拟核DNA之外的质粒有自我复制能力，并可以在细菌细胞间转移，这一发现为基因转移找到了一种运载工具②工具酶的发现科学家发现了多种限制酶、连接酶、逆转录酶，这些发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
③DNA合成和测序技术的发明④DNA体外重组的实现⑤重组DNA表达实验的成功 1973年，博耶和科恩选用仅含单一EcoRI酶切位点的载体质粒pSC101，使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段重组。
基因工程重点考点归纳
基因工程重点考点归纳1. 简述基因工程中的四大要素。
答：基因工程的四大要素是基因、工具酶、载体、宿主细胞。
2. 简述基因工程诞生的基础。
答：基因工程诞生的基础是理论上的三大发现和技术上的三大发明。
1971年，史密斯（Smith H. O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶,酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。
1972年伯格（Berg P.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA 分子用连接酶连接起来,得到新的DNA分子。
1973年，科恩（Cohen S.）等进一步将酶切DNA分子与质DNA 连接起来，并将重组质粒转入E.coli细胞中。
理论上的三大发现：（1）DNA是遗传物质（2）DNA双螺旋模型（Watson/Crick 1953）（3）确定了遗传信息传递的方式（60年代）技术上的三大发明：（1）工具酶的使用【Smith 和Wilcox(1970) 流感嗜血杆菌分离纯化了Hind II其它工具酶（如连接酶）等的发现分子剪刀和DNA缝合工具】（2）基因运载工具—DNA载体的使用(对质粒的认识）【细菌的致育因子—F因子Lederberg 1946抗药性因子(R) 大肠杆菌素因（Col）】（3）逆转录酶的使用【Baltimomore 和Temin (1970) 各自发现了逆转录酶】意义：丰富了“中心法则”、真核基因的制备成为可能、构建cDNA 文库成为可能。
第二章1.简述细菌的限制与修饰系统答：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system)。
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。
根据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子，限制与修饰系统至少可分为四类。
2.II型限制性内切酶的特点答：II型限制性内切酶是同源二聚体，由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成。
识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割DNA，产生带3‘- 羟基和5’-磷酸基团的DNA 产物，需Mg2+，相应的修饰酶只需SAM 。
基因工程复习(含答案)
基因工程复习题一、名词解释: （10～20%）基因工程基因工程工具酶限制性内切酶限制性内切酶得Star活性PCR引物PCR扩增平台期DNA芯片基因组文库cDNA文库转化限制与修饰系统原位杂交: 将细胞或组织得核酸固定保持在原来得位置上, 然后用探针与之杂交得一种核酸分子杂交技术, 该方法可较好地反映目得基因在细胞或组织中得分布与表达变化。
粘性末端: 双链DNA被限制性内切酶切割后, 形成得两条链错开几个碱基, 而不就是平齐得末端。
Northern印迹杂交: 将RNA进行变性电泳后, 再转移到固相支持物上与探针杂交得一种核酸分子杂交技术, 可用于检测目得基因得转录水平。
转位: 一个或一组基因片段从基因组得一个位置转移到另一个位置得现象。
基因工程: 在体外, 用酶学方法将各种来源得DNA与载体DNA连接成为重组DNA, 继而通过转化与筛选得到含有目得基因得宿主细胞, 最后进行扩增得到大量相同重组DNA分子得过程称为基因工程, 又称基因克隆、DNA克隆与重组DNA等。
目得基因：基因工程中, 那些被感兴趣得、被选作研究对象得基因就叫作目得基因。
连接器: 人工合成得一段含有某些酶切位点寡核苷酸片段, 连接到目得基因得两端, 便于基因重组中得切割与连接。
转化: 受体细胞被导入外源DNA并使其生物性状发生改变得过程。
停滞效应: PCR中后期, 随着目得DNA扩展产物逐渐积累, 酶得催化反应趋于饱与, DNA扩增产物得增加减慢, 进入相对稳定状态, 即为停滞效应, 又称平台期。
逆转录PCR: 以mRNA为原始模板进行得PCR反应。
PCR: 即聚合酶链式反应。
在模板, 引物, 4种dNTP与耐热DNA聚合酶存在得条件下, 特异性地扩增位于两段已知序列之间得DNA区段地酶促合成反应。
α-互补（α-complementation）：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中, 插入了lac 启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸得核苷酸序列（又称α-肽）, 该序列不能产生有活性得β-半乳糖苷酶。
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一名词解释：1基因：是遗传信息的基本单位，携带着某种蛋白质或的遗传信息。
从化学本质上看，基因是一段携带特定遗传信息的脱氧核糖核苷酸()序列，是构成巨大遗传单位染色体的组成部分。
2基因工程：按照人们的愿望，进行严密的设计，利用体外重组和转基因等生物技术，有目的地改造生物性状使之具有满足人们特定需求的能力。
最突出的优点：打破了常规育种难以突破的物种之间的界限，使不同的物种之间可以进行遗传信息的重组和转移。
3 ：熔点温度或者解链温度，是变性进行到一半时的温度4同裂酶：有时，一些限制性内切酶虽然来源不同，但是识别序列相同，这样的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。
此种酶切割位点可同可不同。
5 技术：是一种在体外快速扩增特定基因或序列的方法，即聚合酶链式反应技术。
（已知的短片段1以内）6质粒不相容性：不同质粒有的可共存于同一细胞中，但有的不行。
不能同寓于一个细胞中的不同质粒称为不相容性质粒。
7转录单元：始于启动子，止于终止子，中间是一段转录区，转录为单链的一段序列8杂种位点：：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。
一般不能被原来的任何一种同尾酶识别。
9基因表达：基因通过的转录和的转译等过程，将其所携带的遗传信息转变成蛋白质(或转录本)的过程。
10基因组文库：某一特定生物的很多克隆的集合，其中克隆数足够大以覆盖每一个基因。
11 ：开放阅读框，以起始密码子开始终止密码子结束的一串三联体核苷酸序列。
起始密码子：终止密码子：12克隆：动词：是指从一个共同祖先经无性繁殖得到的一群遗传上同一的分子、细胞或个体所组成的特殊生命群体；名词：指从同一个祖先产生这类同一的分子群体、细胞群体或个体群体的过程。
13蛋白质印迹杂交技术：将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
14同尾酶：指来源不同、识别靶序列不同但产生相同的粘性末端的核酸内切酶。
利用同尾酶可使切割位点的选择余地更大。
二选择题：1焦磷酸测序中没用到以下什么酶；（聚合酶( )、硫酸化酶( ).荧光素酶(1)和三磷酸腺苷双磷酸酶()4种酶都有）2克隆基因常用强效载体，哪种不适用于大肠杆菌，选；3质粒克隆载体非必需元件，选融合标签；4外源基因在下列哪种中表达最完善（哺乳动物细胞）；5一个完整的转录单位不包括（复制起始位点）。
三简答题：1简要勾勒一副原核表达载体图。
（重点是要包括原核表达载体的６个要素：启动子、核糖体结合位点、多克隆位点、转录终止子、抗性筛选基因、复制起始点。
）2以I为例说明限制性核酸内切酶的命名原则：一般以提取这类酶的生物属名头一个字母和种名的头两个字母以及菌株（型）的代号来命名。
第一个字母：大写并斜写，表示所来自微生物的属名的第一个字母。
第二、三字母：小写并斜写，表示所来自微生物种名的第一、二个字母。
其它字母：大写或小写，表示所来自微生物的菌株号；罗马数字：表示在该菌株发现的限制酶的编号。
例： I: 来自于 13的第一种限制酶。
3.简述α-互补法筛选重组克隆子的原理：噬菌体载体的基因间隔区插入的一段调节基因及Z的N端146个氨基酸残基编码基因，其编码产物为β—半乳糖苷酶的α片段。
突变型- 可表达该酶的W片段（酶的C端）。
单独存在的α及W片段均无β半乳糖苷酶活性，只有宿主细胞与克隆载体同时共表达两片段时，宿主细胞内才有β半乳糖苷酶活性，使特异性作用物变为蓝色化合物。
4.简要比较大肠杆菌表达系统和几种常用的真核细胞表达系统的优缺点：1.大肠杆菌：最早用于表达外源基因的宿主细胞优点：具有遗传背景清楚、操作简单、表达效率高、易于纯化等优点；缺点：缺乏折叠复性系统、无翻译后加工和修饰系统、内源蛋白酶作用。
2.哺乳动物细胞和昆虫细胞：优点：能够正确折叠、翻译后加工和修饰系统完善，能够表达各种哺乳类细胞蛋白；缺点：这些表达系统往往操作比较复杂，表达水平低，不易推广使用。
3.酵母细胞优点：作为单细胞生物，能够像细菌一样在廉价的培养基上快速生长，能方便地操作外源基因。
能对翻译的蛋白进行加工和修饰，如二硫键的正确形成、前体蛋白的水解加工，表达产物与天然蛋白相同或相似。
可将外源基因与末端前导肽等信号肽融合，指导新生肽的分泌，并对分泌蛋白进行糖基化修饰。
可采用、、 4等高表达的强启动子，并可诱导表达。
可移去起始甲硫氨酸，避免了作为药物使用可能引起的免疫反应问题。
缺点及改进措施：表达外源基因时，遗传和翻译的稳定性常受影响，如点突变，可通过高拷贝基因来解决。
翻译产物不稳定，可利用液泡蛋白酶缺陷型来解决。
选择翻译后具有修饰能力的酵母以及合适的载体。
分泌表达时前导肽去除不够完全，可加入间隔序列肽。
糖基化以甘露糖型为主，而且易过度糖基化，可改变宿主糖基化背景。
5.简述用于基因工程中分子改造的四类工具酶及其作用，并举例说明：1.核酸酶：通过断裂相邻链核苷酸之间的磷酸二酯键而降解分子。
切割、缩短、或降解核酸分子，有核酸外切酶和核酸内切酶2.连接酶：催化相邻核苷酸的游离5'-磷酸基团和3'-羟基形成二酯键的酶。
连接核酸分子3.聚合酶：催化以核酸链为模板合成新核酸链的酶。
包括聚合酶和聚合酶。
复制核酸分子4.修饰酶：能催化稀有碱基参入或，或对原有碱基进行修饰的酶，以防止限制性内切酶的破坏。
去除或添加化学基团6.重组克隆载体构建策略：目的基因片段被插入到载体中，生成一个嵌合体或称作重组分子；载体作为一个运输工具将目的基因转运到一个宿主细胞中；在宿主细胞中载体复制产生大量同一拷贝，同时也使目的基因得到扩增；宿主细胞增殖时，重组分子的拷贝转移到子细胞中，随着载体进行进一步复制；细胞多次分裂后，一个由相同细胞组成的细胞群体，或称作一个克隆被生产出来，每一个细胞都包含一个或多个重组分子的拷贝，此时重组分子所携带的目的基因就被克隆了。
7.基因工程技术路线：通过基因文库筛选、扩增或人工化学合成等手段获得目的基因；构建所需基因载体；目的基因与载体在体外重组后导入受体细胞，进行增值或表达等。
基因工程一般包括四个步骤，也即技术路线：一、取得符合人们要求的片段，这种片段被称为“目的基因”；二、构建基因的表达载体；三、将目的基因导入受体细胞；四、目的基因的检测与鉴定。
8文库的建立：文库是指某生物某一特定的发育时期、特定的组织或器官所转录的形成的片段与载体连接而形成的克隆的集合。
文库是有时效性的，文库只反映的分子结构。
文库构建基本程序：①分离提取含有目的基因的组织细胞的总或者总；②的第一链的合成；③的第二链的合成；④将双链重组到载体上9简述链终止法测序原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳可以将长度上相差一个核苷酸碱基的单链分子相互分离开来。
10简述产物克隆过程：①特殊的克隆载体（T载体）；②设计含限制性酶切位点的引物。
四论述题：1.根据自己所掌握的基因工程方面的知识，谈谈诱导目的基因在载体表达系统中高效表达的原理：1)噬菌体3溶源化的菌株如21(3)是最常用的表达菌株，噬菌体3是λ噬菌体的衍生株，构建好的表达载体可以直接转入表达菌株中，诱导蛋白的表达方式与启动子一样都是诱导。
2)表达菌株21(3)上带有基因，T7 聚合酶编码基因以及5启动子，5启动子可以启动T7 聚合酶的表达;3)表达质粒如28质粒带有T7启动子和编码阻遏蛋白的基因，在插入目的基因后，是失活的;4)在非诱导条件下，表达菌株中表达出的阻遏蛋白可以作用于T7 聚合酶前的5启动子，从而抑制T7 聚合酶的表达。
是乳糖类似物，可以与阻遏蛋白结合，使其对5启动子失去阻遏作用，T7 聚合酶得以合成，继而与28质粒上的T7启动子结合，启动下游基因包括目的基因的表达，从而产生目的蛋白。
2产物的克隆方法：黏性末端连接，将产物回收后，利用引物中附加在5’端的限制酶切位点，可直接用相应的限制性内切核酸酶酶切后产生黏性末端，与载体连接，产生重组；产物尾部加或，聚合酶会在3'端加上多余的非模板依赖碱基,而且对A优先聚合,所以产物末端的多余碱基大部分都是 A.。
利用这一特点,可以经限制酶切割产生的平末端用酶加上或,使载体与产物末端互补并进行连接.载体末端加尾可直接用聚合酶和或因缺少3而不能再形成磷酸二酯键,保证在载体3'端只加上一个,而其5'端所含的磷酸基团可与产物的3'端连接,连接产物在载体和产物之间的双链上带两个切口,这种重组仍可转化合适的受体菌,并在细菌体内修复；平末端连接，由于聚合酶能在产物3’端加上非模板依赖的多余碱基，因此可用T4聚合酶处理补平末端，然后用平末端连接克隆产物。
3.题目很长。
主要就是设计实验方案，包括整套基因工程的具体流程到最后在、、蛋白质水平鉴定表达产物和产物活性的鉴定：基因工程基本操作：目的基因的获取（从基因文库，利用技术，人工合成），基因表达载体的构建（目的基因，启动子，终止子，标记基因），将目的基因导入受体细胞（显微注射法，基因枪法，农杆菌转化法），目的基因的检测与鉴定（分子水平的检测——目的基因是否插入，转录，翻译，个体水平的检测）1实验的基本步骤：模板变性：反应混合物加热到94 ℃，双链分子解链；引物退火：变性后，将温度降低到55℃左右，从而使引物模板特异性互补配对；延伸：升温到72 ℃，聚合酶结合到引物3’端，合成与模板互补的新链。
重复循环。
2为什么基因克隆和如此重要：这两种技术都能够将目的基因从细胞的所有其他基因中分离出来，获得纯的单一基因样品。
3与基因克隆技术的比较：一个可以在数小时内完成一个基因克隆可能要花几周甚至几个月因而，技术比基因克隆要方便快捷的多。
技术的局限性：仅用于已知序列的基因扩增，不适用于未知序列的基因扩增。
扩增产物长度有限。
因而，基因克隆是分离长片段基因或者以前从未研究过的基因的唯一方法。
4位点的作用：环化作用，提供特异性酶切位点；：十六烷基三甲基溴化铵，一种去垢剂，能与核酸一起形成不溶物。
异硫氰酸胍：一种强离序盐，能使除核酸外的所有生化成分变性和溶解，使牢固地吸附在二氧化硅颗粒上。