2 蛋白质的层析纯化与结构鉴定

主要方法介绍
6 生物特异亲和层析 亲和层析 亲和层析 (AC)是根据生物活性物质与特异性配体间的特异性亲和力来达到分 生物特异亲和层析以生物分子作为配体，可分为免疫亲和层析、凝集素亲和 离目的一种技术 ,根据目标蛋白的专一性而设计,如酶与底物、抗原与抗体等。 层析和核酸亲和层析等，另外还有以酶、粘附蛋白、受体蛋白或底物为配体 亲和层析是目前最为有效的蛋白质分离纯化方法，具有高纯度、高收率以及 的亲和层析。 能保持生物大分子的天然活性等优点,因此具有良好的选择性,被广泛的应用于 从复杂体系中高效提取特定的目标蛋白。
前言
• 不管是哪一种方法，其分离纯化 的原理都是利用其物理和化学性 质的差异，物理性质包括分子的 大小、形状、溶解度，化学性质 包括等电点、疏水性以及与其他 分子的亲和性等性质。根据目标 蛋白的物理或化学性质的不同， 可以有针对性地采取不同的分离 纯化方法。
主要方法介绍
1 离子交换层析 2 凝胶过滤层析 3 疏水层析 4 反相层析 5 分子筛凝胶层析 6 亲和层析
主要方法介绍
4 反相层析 反相层析与疏水层析一样，都是利用蛋白分子的疏水性差异来实现分离纯 化的技术。但是二者有区别，疏水层析的固定相是弱疏水配基，而反相层析 的固定相含有高度非极性基团，且配基的密度要高很多，在疏水层析中用盐 浓度调节蛋白与固定相之间的相互作用，而反相层析通过有机溶剂调节，通 过增加有机溶剂的浓度来实现蛋白的洗脱。
蛋白பைடு நூலகம்的结构鉴定
蛋白质结构鉴定主要包括两部分:物理分析和化学分析。
物理分析 1质谱法 化学分析 1 氨基酸分析
2核磁共振法
3紫外-可见差光谱法 4激光拉曼光谱
2 序列分析
5 荧光光谱法
6红外光谱法 7 圆二色谱法
THE END
蛋白质的层析纯化与结构鉴定
王园园
主 要 内 容
1 前言 2 层析方法介绍
3 展望
前言
层析分离技术是20世纪初由俄国化学家茨维特首先提出的,根据被 分离物与层析固定相之间的物理化学性质以及生物学性质的相互作用 来进行分离。层析技术是目前蛋白质等大分子分离的核心技术手段。 层析法的种类繁多,应用较为广泛的有凝胶过滤层析、离子交换层析、 疏水层析以及亲和层析。
主要方法介绍
3 疏水层析 疏水层析(HIC)的原理由Hofstee在1973年首先提出。疏水层析的固定相上偶 联具有适度疏水性的疏水基团,从而可根据疏水吸附剂与蛋白质分子之间的疏 水作用差异进行分离。生物分子表面一般都存在疏水区域,高盐浓度下分子内 部的疏水基团会外露,使得蛋白质的疏水区疏水作用加强,蛋白质与层析固定相 结合后,降低盐浓度,蛋白质就会因为疏水作用力的减弱而被洗脱下来。因此疏 水层析与离子交换层析的吸附条件相反,是高盐吸附低盐洗脱。
主要方法介绍
• 1离子交换层析 • 离子交换层析(IEC)是利用离子交换介质与不同蛋白质分子间的作用力不同 来进行分离的,其主要依赖的是蛋白质分子表面静电荷的差异。离子交换层 析中,固定相通常是带电荷的琼脂糖或者葡聚糖等。阴离子交换剂带有正的 电荷,附带负电荷的蛋白分子;阳离子交换剂带有负的电荷,吸附带正电荷的蛋 白分子当蛋白质分子处于不同的pH值条件下,其带电状况会不同,可通过调节 洗脱液的盐浓度或洗脱液的pH值将吸附在层析介质上的蛋白质洗脱下来。 离子交换层析是所有层析技术中应用最为广泛的一种。
主要方法介绍
金属螯合亲和层析 人工配体亲和层析
金属螯合亲和层析也称固相化金属离子亲和层析，是利用固定金属离子螯合 人工配体亲和层析也称为通用配体亲和层析，是指利用一类人工配体对不同 剂（如 IDA 和NTA）螯合二价金属离子 （如 Ni2+、Zn2+、Cu2+和 Co2+等），再与 的蛋白质有亲和性的特点，通过亲和层析来纯化这些蛋白质的方法。主要包 蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基（组氨酸、色氨酸、赖氨酸等）相互作用 括金属螯合亲和层析和染料配体亲和层析等。 而进行的亲和纯化。金属螯合亲和层析具有配体简单、通用性强、分离条件 温和、吸附量大等优点。
主要方法介绍
5 分子筛凝胶层析 分子筛凝胶层析利用蛋白分子大小和形状的不同进行分离。以惰性细颗粒 基质作为层析柱填料，由于液体的挤压，大分子物质因无法进入细颗粒的微 孔中而随着液体从细颗粒间的缝隙流出，而小分子因进入细颗粒基质内微孔 运动速度慢，保留时间长，比大分子物质流出缓慢而分离。 此种层析方法条件温和，填料分辨率高，操作简便，但是上样量较小，处 理周期长，应用范围受限。
主要方法介绍
2 凝胶过滤层析 凝胶过滤层析(GFC),也被称为分子筛层析、尺寸排阻层析,其原理是根据蛋 白质分子间的大小或者形状的差异来将目标蛋白质与其他杂质进行分离。这 种方法依据分子的大小进行分级分离,蛋白质不用和凝胶介质之间产生吸附,这 也减少了蛋白质分子由于不可逆的吸附作用而造成的结构变化。它用于分子 量差距比较悬殊的蛋白质之间的分离,也可用于分子量差距比较接近,但是与凝 胶介质之间相互作用有区别的蛋白质之间的分离纯化。