Ch11-tan 肿瘤分子生物学
肿瘤基因诊断
明胶酶A/TIMP2
HPV,HCV,HBV，EBV PSA,PSMA muc-18,酪氨酸酸酶，Mage-3 AFP,白蛋白 甲状腺球蛋白 NPGP9.5，酪氨酸羟化酶表面活性物 质等 CEA β-HCG CK-19 端粒酶 微卫星体等
应用于癌症诊断
白血病、淋巴瘤等 胃癌、膀胱癌、乳腺癌、 前列腺癌、结肠癌、胰腺 癌、肺癌等 乳腺癌、结肠癌 结肠癌、肾癌、乳腺癌、 脑瘤等 乳腺癌、脑瘤、神经母细 胞瘤
表1细胞癌基因按其产物定位和功能分类
定位
功能
癌基因，产物
分泌蛋白
生长因子
跨膜蛋白
受体型酪氨酸激酶
膜结合蛋白
G-蛋白 非受体型酪氨酸激酶
胞浆可溶性蛋白
非受体型酪氨酸激酶 丝氨酸/苏氨酸激酶 信号转导连接蛋白
胞核蛋白
转录因子
sis PDGFβ链 erb B ,EGF受体 erb B2 ,EGF样受体 (neu) fms ,CSF-1受体
➢ 癌基因点突变的检测 单链构象多态性（SSCP）检测技术等 .
肿瘤相关的病毒基因
➢致瘤病毒引起的恶性转化作用引起了人们 极大的关注
✓ EB病毒（EBV） ✓ 人乳头瘤病毒（HPV） ✓ 乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）感
染
➢对于这些肿瘤组织细胞中相关病毒基因及其编 码产物的检测，可以作为这些类型的肿瘤诊断的 标志。
抑制肿瘤细胞生长
保持DNA完整性
肿瘤转移相关基因
➢ 包括肿瘤转移促进基因或肿瘤转移抑制 基因。
肿瘤耐药基因
➢ 其表达使肿瘤细胞对药物产生耐药的 基因。
肿瘤生长因子
血小板衍生生长因子（PDGF） 表皮生长因子（EGF） VGF基因等
肿瘤分子生物学
mutation which changes ras from a proto-oncogene to an oncogene eliminates its GTPase activity so that, even with a functional, GAP protein, ras will not hydrolyze GTP-GDP and remains active, coupling to the MAP kinase cascade and triggering the expression of early response genes Jun and Fos.
Vinculin(纽带蛋白), a protein that helps link the cytoskeleton to the cell
membrane shows elevated phosphorylation in transformed cells and may be involved in the morphological changes observed in transformed cells.
are normal cellular genes which promote normal growth and development
细胞癌基因的分类
生长因子类(growth factor )—sis 生长因子受体类(growth factor receptors)—PDGF、
EGF、 酪氨酸激酶类(tyrosine protein kinase—Src
肿瘤分子生物学
肿瘤（tumor）是一类疾病的总称，它们的基本特征是细胞增殖与凋亡失控，扩张性增生形成新生物。
肿瘤可分为良性肿瘤（benign tumor）和恶性肿瘤（malignant tumor）。
良性肿瘤生长缓慢，虽可增长至相当大的体积，但仍保留正常细胞的某些特性，通常在瘤体外有完整的包膜，手术切除后患者预后良好。
绝大多数良性肿瘤基本上是无害的，不引起或很少引起宿主损伤。
恶性肿瘤统称为癌症（cancer），它不同于良性肿瘤的最重要的特性是能侵袭周围组织，疾病晚期癌细胞发生远端转移，破坏受侵袭的脏器，最终使机体衰亡，但如能在侵袭转移前切除癌瘤，一般预后明显改善。
2、癌细胞的恶性生物学特征（1）失去了对中止细胞增殖信号和细胞分化信号的反应，并可传出自主的细胞生长、增殖信号。
（2）逃避了细胞凋亡和衰老，是细胞永生。
当正常细胞受到严重损伤和营养缺乏时，就发生凋亡并自动解体；而癌细胞并不一定会发生凋亡。
体外培养的正常细胞，即使没有受到损伤，约分裂50后也会自动停止分裂，最终细胞死亡（细胞衰老）；而癌细胞能无限制地增殖，获得了永生化。
这可能与调控细胞凋亡基因的缺陷和端粒酶恢复活性相关。
（3）失去细胞的区域性限制，具有了侵袭和转移能力。
例如在体外培养的正常细胞中增殖至彼此接触时，就停止生长和分裂（结出抑制），故细胞呈单层生长，而癌细胞失去了接触抑制，继续分裂而呈多层重叠生长；同时癌细胞表面的识别能力和黏着性发生了改变，使癌细胞不能像不同的正常组织细胞那样保持彼此分开，而能侵入临近组织。
（4）自主的血管生成能力，这保证了肿瘤体积增大后和新形成转移肿瘤的血液供应，以维持癌细胞生长和增殖之所需。
上述这些癌细胞的恶性特性，使它们能在没有增殖信号的情况下，自主地无限制增殖，当达到一定的体积时就可能侵袭邻近组织，癌细胞还可能脱落进入血液和淋巴液，发生远端转移并扩增，最终导致宿主死亡。
3、癌的单克隆起源和异质性除少数例外，癌是原始的、单个癌细胞增殖的后代，即癌为单克隆起源。
P_53_基因与肿瘤细胞凋亡关系的研究
P53基因与肿瘤细胞凋亡关系的研究 肖 强 H il m ar M1W aren ius(广西医科大学第一附属医院外科 南宁 530021) (英国利物浦大学医学院肿瘤研究室)摘要 目的:探讨P53基因的变化与肿瘤细胞凋亡的关系。
方法:对两个分别具有野生型和突变型P53基因的膀胱癌细胞株M GHU1和R T112进行8GyΧ射线照射,并采用定时显微录影设备观察240h,对每个被观察的细胞进行谱系分析。
结果:两个细胞株均出现了以凋亡为主的细胞死亡,累积细胞凋亡指数分别为98和10513,比较指数曲线后未发现显著性差异,P> 0105。
结论:虽然两个细胞株的P53基因状态和总P53蛋白含量有所不同,但并没有影响Χ射线照射后的细胞凋亡的形成,从而未能影响细胞的放射敏感性。
亦表明P53基因对细胞凋亡的影响可能取决于不同的细胞类型。
关键词 P53基因;细胞凋亡;Χ射线照射中国图书资料分类法分类号 R73014A STUDY OF THE RE LATI ONSH I P BET W EEN P53AND APOPT OSI SX iao Q iang(D epart m en t of Surgery,the F irst A ffiliated Ho s p ital,Guangx iM edicalU n iversity,N ann ing,530021 Ch ina)H il m ar M1W aren ius(O nco l ogy R esearch U n it,D epart m en t of M edicine,the U n iversity of L iverpoo l,L iverpoo l L693BX,U K)Abstract Objecti ve:T h is study w as designed to investigate the relati on sh i p bet w een changes of P53gene and apop to sis in tumo r cells expo sed to ga mm a irradiati on1M ethods:Tw o bladder cancer cell lines,M GHU1w ith w ild2type P53and R T112w ith m utan t P53,w ere expo sed to8Gy of ga mm a irradiati on and then observed fo r a peri od of240hours by ti m e2lap se m icro scopy1Pedigrees of observed cells w ere analysed1Results:M mo st died cells w ere found to be apop to sis1T he cum ulative cell apop to tic indices w ere98and10513res pectively1T here w as no sign ifican t difference bet w een the t w o curves of the indices,P>01051Conclusi on:T he result suggested the apop to sis,o r the radi o2sen sitivity,of the t w o cell lines w as no t influenced by P53gene statues and level of P53p ro tein1It w as po ssible that the influence of P53gene on apop to sis w as cell2type dependen t1Key words P53;A pop to sis;Ga mm a irradiati on 细胞凋亡和P53基因都是近20年来,特别是近10年来细胞生物学和分子生物学研究的热点对象。
分子生物学-肿瘤
v-onc基因的起源
研究发现，反转录病毒基因组中所带有的onc基因并非来自病毒本身，而是这些 病毒在感染动物或人体之后获得的细胞原癌基因。这些动物或人原癌基因经病毒修 饰和改造后，成为病毒基因组的一部分并具有了致癌性，其作用的靶分子也往往发 生改变。已经证实，各种脊椎动物染色体DNA上都有与Src相类似的DNA序列， 说明它是正常细胞所固有的。因为正常细胞中这些基因是不表达的，只有在细胞发 生癌变时才有活性，所以称为原癌基因。一般说来，细胞原癌基因大都是断裂基因， 带有插入序列，而病毒的致癌基因往往是一个完整的没有断裂的可读框。
02
03
举例
通过杂合缺失鉴定的一个抑癌基因，在星形细胞癌、乳
癌、肺癌、肠癌及骨肉癌中都有高频率缺失现象。
p53基因的保守序列区有单一位点的突变，推测：可能
p53
由于这一突变导致p53基因产物结构与功能的改变，失去抑
癌活性。另外，在一些人体某些肿瘤细胞中也可观察到p53 等位基因的缺失。（这种缺失同样影响肿瘤的发生） 抑癌作用：（可能）通过其蛋白与DNA的结合（这种
与bcr基因相融合， 图 abl原癌基因通过选择性染色体重排转变成细胞癌基因
表达量大为提高。
癌基因的缺失与扩增
很多原癌基因5' 上游区存在负调控序列， 一旦该序列发生缺失或突变、就丧失抑制
基因表达调控的能力。如Brukitt 淋巴瘤 中c-myc可因负调控序列的缺失或LTR 插 入破坏其结构而增强表达。
ras基因的点突变及转化活性分析
某某单位、公司是一家专注于某产品及服务的 综合性公司，在行业内拥有领先地位。在此录入上 述图表的综合描述说明，在此录入上述图表的综合 描述说明。在此录入上述图表的综合描述说明。 在此录入上述图表的综合描述说明，在此录入 上述图表的综合描述说明。在此录入上述图表的综 合描述说明。
肿瘤Notch信号通路的研究进展
肿瘤Notch信号通路的研究进展王晓清;袁国强;潘亚文【摘要】Notch gene encodes a class of highly conserved cell surface receptors that determine the fate of cells in embryonic development and mature tissue, which is an important pathway of communication between adjacent cells, and then regulates of cell development, proliferation and apoptosis. The occurrence and progression of multiple tumors are associated with abnormal Notch signaling pathways. For different tumors, it is important significance for anti-tumor therapy to effectively regulate the Notch participants and target molecules.%Notch基因编码一类高度保守的细胞表面受体,决定胚胎发育和成熟组织中的细胞命运,是相邻细胞之间通讯进而调控细胞发育、增殖和凋亡的重要通路.多种肿瘤的发生与进展和Notch信号通路异常有关.针对不同肿瘤,有效调控靶向Notch的参与者与靶分子,对抗肿瘤治疗具有重要研究意义.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2018(038)007【总页数】4页(P1025-1028)【关键词】Notch信号通路;肿瘤;异常【作者】王晓清;袁国强;潘亚文【作者单位】兰州大学第二医院神经病学研究所, 甘肃兰州730030;兰州大学第二医院神经病学研究所, 甘肃兰州730030;兰州大学第二医院神经病学研究所, 甘肃兰州730030;兰州大学第二医院神经外科临床医学中心, 甘肃兰州730030【正文语种】中文Notch基因最早在1917年黑腹果蝇中发现，因其功能部分缺失造成果蝇翅膀边缘缺刻(notch)而命名。
一氧化氮治疗肿瘤的研究进展
一氧化氮治疗肿瘤的研究进展作者：王丽凯，田娅，吴惠霞来源：《上海师范大学学报·自然科学版》2022年第04期摘要：一氧化氮（NO）是一种半衰期很短的气体分子，对细胞膜具有高穿透性，能在人体内传递重要信息，并具有调节细胞的功能.NO气体分子既能维持正常细胞的生理功能和活性，又能选择性地快速耗尽肿瘤细胞的能量，诱导肿瘤细胞凋亡.研究表明：NO可以通过多种机制實现肿瘤治疗.已有一些NO供体药物表现出良好的抗肿瘤活性，精确控制NO在肿瘤部位的释放，可杀死肿瘤细胞.因此，NO气体疗法作为一种肿瘤治疗策略具有一定的应用前景.文章简述了NO的生理学特性和几种典型的NO供体，以及释放NO的生物材料在生物医学领域的应用进展.关键词：一氧化氮（NO）; NO供体; 肿瘤; 气体治疗; 生物材料中图分类号： O 613.6 文献标志码： A 文章编号： 1000-5137（2022）04-0443-09Research progress of nitric oxide in the treatment of tumorWANG Likai， TIAN Ya， WU Huixia*（College of Chemistry and Materials Science， Shanghai Normal University， Shanghai 200234， China）Abstract： Nitric oxide （NO） is a ubiquitous gas molecule with a short half-life. It is highly permeable to cell membranes and can transmit important information and regulate cellular functions in the human body. NO molecules can not only maintain the physiological function and activity of normal cells， but also selectively and rapidly deplete the energy of tumor cells and induce their apoptosis. Studies have shown that NO may achieve tumor therapy through a variety of mechanisms. Some NO donor drugs have shown good anti-tumor activity and can be used to precisely control the release of NO at tumor sites and kill tumor cells. Therefore， NO gas therapy is a promising tumor treatment strategy. This review covers the physiological characteristics of NO， several typical NO donors， and the application progress of NO releasing biomaterials in biomedical field.Key words： nitric oxide（NO）; NO donors; tumor; gas therapy; biomaterials0 引言一氧化氮（NO）是一氧化氮合酶（NOS）作用产生的半衰期仅为3-5 s的分子.NO分子中有一个未成对电子，可形成自由基，对多种生物分子具有很高的反应性.NO具有脂溶性，可以快速透过生物膜扩散，在体内极不稳定，能迅速被血红蛋白、氧自由基或氢醌等灭活.NO可以对血管生成和舒张、细胞周期、细胞凋亡、侵袭和转移等过程进行调节，从而影响细胞功能.NO还能与二氧化氮（NO2）反应生成三氧化二氮（N2O3），并能与超氧化物反应生成过氧亚硝酸盐（ONOO-）.N2O3和ONOO-这2种分子均可通过亚硝化或氧化应激引起DNA损伤：N2O3可以通过胺的亚硝化作用导致N‒亚硝胺的形成，进而损伤DNA;过氧亚硝酸盐可以氧化和硝化DNA，并导致单链DNA断裂[1].NO的生物效应通常取决于分子的形成、代谢、NOS的类型和NO的浓度等.在过去的几十年中，人们一直在努力研究NO对癌生物学的影响.多年来，NO在致癌和抗肿瘤进展中有着较大的误解和争议，因为它同时具有促进肿瘤细胞生长和杀死肿瘤细胞的能力.然而，确定哪种作用占优势是很复杂的，包括但不限于NO存在的时间、位置、浓度和肿瘤微环境[2].NO生成过多或者生成不足都会引起基因突变、肿瘤等.近年来，许多气体纳米发生器已经能够通过被动或主动靶向聚集在肿瘤部位，在内源性或外源性刺激下有效控制气体分子的释放.因此，无论是单独使用NO还是与其他治疗方式联合使用，这些发现都使NO广泛应用于抗癌剂[3].目前，气体治疗已成为一种新兴的、安全有效的抗癌治疗策略.1 NO的生理学特性1.1 NO的生物合成细胞合成NO的主要途径是通过NOS的酶促作用将L‒精氨酸转化为L‒瓜氨酸，并释放出NO，如图1所示[4].NOS是一种同工酶，选择性分布在不同脑区的神经元中，其同工酶有3种亚型，即神经型一氧化氮合酶（nNOS）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和内皮型一氧化氮合酶（eNOS）.其中，eNOS和nNOS在细胞处于生理状态下即可组成性表达，并可因细胞内钙增加而被钙调蛋白激活;iNOS是非钙依赖型的，当细胞受到内源性或外源性刺激时，可在较短的时间内产生高浓度的NO[4].此外，还可以通过硝酸盐→亚硝酸盐→NO途径合成NO.体内的硝酸盐主要来自膳食和自身合成.在生物体内，循环的硝酸盐被唾液腺主动摄取，并被口腔中的细菌还原为亚硝酸盐，在血液和组织中进一步代谢为NO和其他生物活性氮氧化物[5].亚硝酸盐是氮氧化物的氧化还原过程中的中间产物，在血液和组织中比较稳定，且可被多种物质还原成NO，包括肌红蛋白、血红蛋白、抗坏血酸、黄嘌呤氧化还原酶、质子和多酚[5].这些途径产生的NO会因缺氧和酸中毒条件而增加，因而可以保证NO的产量.1.2 NO的生物学作用NO可以自由地通过生物膜并参与一系列生理和病理过程，如神经信号传递、血管扩张、血小板黏附和聚集等，在生物体内发挥着至关重要的作用.NO的生物学作用是通过直接或间接的化学反应产生的.例如，NO直接与不同蛋白质的金属配合物结合形成金属亚硝酰基配合物来调节靶蛋白的生物学活性.NO还可以与多种内源性自由基反应，产生活性氮氧化合物，这些强毒性的活性氮氧化合物将导致线粒体损伤，进而诱导细胞凋亡.NO在生物体内像一把双刃剑，因为它既具有杀死肿瘤细胞的作用，又具有促进肿瘤细胞生长的作用.在低生理水平下，NO可作为抗氧化剂，减少芬顿反应，终止自由基链式反应，并抑制过氧化物酶和氧化酶的活性.较高浓度的NO能够舒张血管，改善组织缺氧状态，有利于化疗药物的渗透，对肿瘤细胞具有杀伤作用[6].但是，持续过量的NO将产生神经毒性，影响体内平衡和改变蛋白质功能，从而导致基因突变，最终使正常黏膜癌变[7].不同组织中的生理过程对NO的需求量各不相同，浓度过高或者过低都会对组织造成一定的损伤，引起疾病的发生[8].只要将适当浓度的NO递送至肿瘤部位，NO的靶向释放也可能增强化学疗法和放射疗法的疗效.因此，如何将适当浓度的NO靶向释放至肿瘤，已成为近年来生物医学领域的研究重点.2 NO供体直接使用外源性或内源性NO的缺点是其半衰期极短，且易受各种谷胱甘肽（GSH）、超氧化物和血红蛋白等物质的影响.因此，将NO供体载入纳米平台中，直接和精确地控制NO的靶向释放，有很好的应用前景.NO供体是指在体内经酶促反应或非酶促反应释放NO的一类化合物，如有机硝酸盐、有机亚硝酸盐、S‒亚硝基硫醇（RSNO）、金属配合物等多种化学物质已被用作NO供体，用于各种生物或医学领域[9]，如图2所示.2.1 有机硝酸酯（RONO2）及有机亚硝酸酯类RONO2是醇的硝酸酯，是最早的、目前最常用的NO供体.它们可以通过相应醇的酯化反应或烷基卤化物与AgNO3的反应来合成，如图3所示[10].这类供体的优点是给药途径比较广，但容易产生耐药性.硝酸甘油（GTN）和单硝酸异山梨酯（ISMN）是临床研究中使用最广泛的NO供体类药物.它们有几个既定的临床应用：GTN是一種廉价又有效的、能快速逆转与急性心绞痛有关疼痛的药物;ISMN是RONO2中释放NO较慢的一种，已被用于治疗慢性心绞痛[11].与RONO2类似，有机亚硝酸酯是醇类和亚硝酸酯化形成的酯.它们主要通过醇与亚硝酰氯（NOCl）反应或醇与NO和氧气（O2）经过酯化反应来合成，如图3所示[12].有机亚硝酸酯的主要作用是舒张静脉和降低血压，例如，亚硝酸丁酯（BN）、亚硝酸异丁酯（ISBN）和亚硝酸叔丁酯（TBN）已在临床上用作血管扩张剂[13].与GTN等RONO2相比，它们对酶的依赖性更低、作用效力更高，且不易引起耐药性.但是，它们缺乏选择性和生物利用度，以及细胞毒性和致癌性较高，因此不如RONO2常用[14].2.2 RSNO类RSNO是贮存、运输和释放NO的重要载体，在生物体内具有重要的生理作用.RSNO普遍存在于生物体的血液和组织中，只需要一个电子就能引发NO的释放，因此，可通过光、热、碱性pH值、过渡金属离子、抗坏血酸和酶等促使RSNO自发均裂反应产生NO[15].人工合成的RSNO是新型的NO供体类药物，通过静脉等途径进入体内后，可以参与呼吸、心血管、消化等多个系统疾病的诊断和治疗[16].2.3 金属-一氧化氮配合物NO是金属配合物中的强配体，它的结合常数比一氧化碳（CO）和O2高得多，具有多种氧化态，氧化价态的高低决定了配合物中NO的反应性.NO调节信号通路的主要机制是与金属中心原子（如铁（Fe）、钌（Ru）等）结合，如图4所示[12]，如血红素基团或蛋白质的铁硫簇.硝普钠（SNP）已经广泛应用于急性降压药物和动静脉血管扩张剂，其血管舒张作用是由NO的产生而造成的[17].SNP晶体在避光且干燥的条件下可以长时间保存，光和O2会促使其水溶液分解，并释放出NO和氰化物，从而导致“氰化物毒性”，对机体造成伤害[18].除了Fe之外，Ru对NO也有很高的亲和力，且Ru对NO的亲和力可以随着其他配体的改变而变化，以便调节NO的释放.光活性Ru配合物热稳定性好，且能在紫外光照射下释放NO.然而，NO的有效释放需要使用对组织有害的高功率紫外线，这一缺陷阻碍了该类NO供体的临床应用[19].2.4 其他供体1956年MAGEE等[20]发现了二甲基亚硝胺和亚硝胺二甲胺均可致大鼠肝癌.其致癌作用是由于N-亚硝基化合物会导致蛋白质和核酸的烷基化.但是，N-亚硝胺却是一种能舒张血管的NO供体.链脲霉素（STZ）含有N-亚硝胺基团，具有抗肿瘤、致糖尿病和致癌作用[21].胰腺β细胞具有低水平的活性氧（ROS）清除酶，对NO和ROS比较敏感，STZ能在胰岛β细胞中释放NO，使细胞的DNA受到损害[22].因此，可将此类NO供体作为抗癌药物进行研究.偶氮二醇烯鎓盐（NONOates）释放NO的机制遵循动力学且不受细胞代谢产物或酶的催化.它们以固体形态稳定存在，但在生理条件下会自发分解生成NO，分解速率会因结构、温度和pH值而改变[23].因此，可以通过它们在体外的分解速率直接预测药物的持续作用时间.研究证明：NONOates能够降低多种肿瘤细胞的增长速率，抑制肿瘤细胞的生长[24].此外，还可以通过硝酸盐→亚硝酸盐→NO途径合成NO.体内的硝酸盐主要来自膳食和自身合成.在生物体内，循环的硝酸盐被唾液腺主动摄取，并被口腔中的细菌还原为亚硝酸盐，在血液和组织中进一步代谢为NO和其他生物活性氮氧化物[5].亚硝酸盐是氮氧化物的氧化还原过程中的中间产物，在血液和组织中比较稳定，且可被多种物质还原成NO，包括肌红蛋白、血红蛋白、抗坏血酸、黄嘌呤氧化还原酶、质子和多酚[5].这些途径产生的NO會因缺氧和酸中毒条件而增加，因而可以保证NO的产量.1.2 NO的生物学作用NO可以自由地通过生物膜并参与一系列生理和病理过程，如神经信号传递、血管扩张、血小板黏附和聚集等，在生物体内发挥着至关重要的作用.NO的生物学作用是通过直接或间接的化学反应产生的.例如，NO直接与不同蛋白质的金属配合物结合形成金属亚硝酰基配合物来调节靶蛋白的生物学活性.NO还可以与多种内源性自由基反应，产生活性氮氧化合物，这些强毒性的活性氮氧化合物将导致线粒体损伤，进而诱导细胞凋亡.NO在生物体内像一把双刃剑，因为它既具有杀死肿瘤细胞的作用，又具有促进肿瘤细胞生长的作用.在低生理水平下，NO可作为抗氧化剂，减少芬顿反应，终止自由基链式反应，并抑制过氧化物酶和氧化酶的活性.较高浓度的NO能够舒张血管，改善组织缺氧状态，有利于化疗药物的渗透，对肿瘤细胞具有杀伤作用[6].但是，持续过量的NO将产生神经毒性，影响体内平衡和改变蛋白质功能，从而导致基因突变，最终使正常黏膜癌变[7].不同组织中的生理过程对NO的需求量各不相同，浓度过高或者过低都会对组织造成一定的损伤，引起疾病的发生[8].只要将适当浓度的NO递送至肿瘤部位，NO的靶向释放也可能增强化学疗法和放射疗法的疗效.因此，如何将适当浓度的NO靶向释放至肿瘤，已成为近年来生物医学领域的研究重点.2 NO供体直接使用外源性或内源性NO的缺点是其半衰期极短，且易受各种谷胱甘肽（GSH）、超氧化物和血红蛋白等物质的影响.因此，将NO供体载入纳米平台中，直接和精确地控制NO的靶向释放，有很好的应用前景.NO供体是指在体内经酶促反应或非酶促反应释放NO的一类化合物，如有机硝酸盐、有机亚硝酸盐、S‒亚硝基硫醇（RSNO）、金属配合物等多种化学物质已被用作NO供体，用于各种生物或医学领域[9]，如图2所示.2.1 有机硝酸酯（RONO2）及有机亚硝酸酯类RONO2是醇的硝酸酯，是最早的、目前最常用的NO供体.它们可以通过相应醇的酯化反应或烷基卤化物与AgNO3的反应来合成，如图3所示[10].这类供体的优点是给药途径比较广，但容易产生耐药性.硝酸甘油（GTN）和单硝酸异山梨酯（ISMN）是临床研究中使用最广泛的NO供体类药物.它们有几个既定的临床应用：GTN是一种廉价又有效的、能快速逆转与急性心绞痛有关疼痛的药物;ISMN是RONO2中释放NO较慢的一种，已被用于治疗慢性心绞痛[11].与RONO2类似，有机亚硝酸酯是醇类和亚硝酸酯化形成的酯.它们主要通过醇与亚硝酰氯（NOCl）反应或醇与NO和氧气（O2）经过酯化反应来合成，如图3所示[12].有机亚硝酸酯的主要作用是舒张静脉和降低血压，例如，亚硝酸丁酯（BN）、亚硝酸异丁酯（ISBN）和亚硝酸叔丁酯（TBN）已在临床上用作血管扩张剂[13].与GTN等RONO2相比，它们对酶的依赖性更低、作用效力更高，且不易引起耐药性.但是，它们缺乏选择性和生物利用度，以及细胞毒性和致癌性较高，因此不如RONO2常用[14].2.2 RSNO类RSNO是贮存、运输和释放NO的重要载体，在生物体内具有重要的生理作用.RSNO普遍存在于生物体的血液和组织中，只需要一个电子就能引发NO的释放，因此，可通过光、热、碱性pH值、过渡金属离子、抗坏血酸和酶等促使RSNO自发均裂反应产生NO[15].人工合成的RSNO是新型的NO供体类药物，通过静脉等途径进入体内后，可以参与呼吸、心血管、消化等多个系统疾病的诊断和治疗[16].2.3 金属-一氧化氮配合物NO是金属配合物中的强配体，它的结合常数比一氧化碳（CO）和O2高得多，具有多种氧化态，氧化价态的高低决定了配合物中NO的反应性.NO调节信号通路的主要机制是与金属中心原子（如铁（Fe）、钌（Ru）等）结合，如图4所示[12]，如血红素基团或蛋白质的铁硫簇.硝普钠（SNP）已经广泛应用于急性降压药物和动静脉血管扩张剂，其血管舒张作用是由NO的产生而造成的[17].SNP晶体在避光且干燥的条件下可以长时间保存，光和O2会促使其水溶液分解，并释放出NO和氰化物，从而导致“氰化物毒性”，对机体造成伤害[18].除了Fe之外，Ru对NO也有很高的亲和力，且Ru对NO的亲和力可以随着其他配体的改变而变化，以便调节NO的释放.光活性Ru配合物热稳定性好，且能在紫外光照射下释放NO.然而，NO的有效释放需要使用对组织有害的高功率紫外线，这一缺陷阻碍了该类NO供体的临床应用[19].2.4 其他供体1956年MAGEE等[20]发现了二甲基亚硝胺和亚硝胺二甲胺均可致大鼠肝癌.其致癌作用是由于N-亚硝基化合物会导致蛋白质和核酸的烷基化.但是，N-亚硝胺却是一种能舒张血管的NO供体.链脲霉素（STZ）含有N-亚硝胺基团，具有抗肿瘤、致糖尿病和致癌作用[21].胰腺β细胞具有低水平的活性氧（ROS）清除酶，对NO和ROS比较敏感，STZ能在胰岛β细胞中释放NO，使细胞的DNA受到损害[22].因此，可将此类NO供体作为抗癌药物进行研究.偶氮二醇烯鎓盐（NONOates）释放NO的机制遵循动力学且不受细胞代谢产物或酶的催化.它们以固体形态稳定存在，但在生理条件下会自发分解生成NO，分解速率会因结构、温度和pH值而改变[23].因此，可以通过它们在体外的分解速率直接预测药物的持续作用时间.研究证明：NONOates能够降低多种肿瘤细胞的增长速率，抑制肿瘤细胞的生长[24].此外，还可以通过硝酸盐→亚硝酸盐→NO途径合成NO.体内的硝酸盐主要来自膳食和自身合成.在生物体内，循环的硝酸盐被唾液腺主动摄取，并被口腔中的细菌还原为亚硝酸盐，在血液和组织中进一步代谢为NO和其他生物活性氮氧化物[5].亚硝酸盐是氮氧化物的氧化还原过程中的中间产物，在血液和组织中比较稳定，且可被多种物质还原成NO，包括肌红蛋白、血红蛋白、抗坏血酸、黄嘌呤氧化还原酶、质子和多酚[5].这些途径产生的NO会因缺氧和酸中毒条件而增加，因而可以保证NO的产量.1.2 NO的生物学作用NO可以自由地通过生物膜并参与一系列生理和病理过程，如神经信号传递、血管扩张、血小板黏附和聚集等，在生物体内发挥着至关重要的作用.NO的生物学作用是通过直接或间接的化学反应产生的.例如，NO直接与不同蛋白质的金属配合物结合形成金属亚硝酰基配合物来调节靶蛋白的生物学活性.NO还可以与多种内源性自由基反应，产生活性氮氧化合物，这些强毒性的活性氮氧化合物將导致线粒体损伤，进而诱导细胞凋亡.NO在生物体内像一把双刃剑，因为它既具有杀死肿瘤细胞的作用，又具有促进肿瘤细胞生长的作用.在低生理水平下，NO可作为抗氧化剂，减少芬顿反应，终止自由基链式反应，并抑制过氧化物酶和氧化酶的活性.较高浓度的NO能够舒张血管，改善组织缺氧状态，有利于化疗药物的渗透，对肿瘤细胞具有杀伤作用[6].但是，持续过量的NO将产生神经毒性，影响体内平衡和改变蛋白质功能，从而导致基因突变，最终使正常黏膜癌变[7].不同组织中的生理过程对NO的需求量各不相同，浓度过高或者过低都会对组织造成一定的损伤，引起疾病的发生[8].只要将适当浓度的NO递送至肿瘤部位，NO的靶向释放也可能增强化学疗法和放射疗法的疗效.因此，如何将适当浓度的NO靶向释放至肿瘤，已成为近年来生物医学领域的研究重点.2 NO供体直接使用外源性或内源性NO的缺点是其半衰期极短，且易受各种谷胱甘肽（GSH）、超氧化物和血红蛋白等物质的影响.因此，将NO供体载入纳米平台中，直接和精确地控制NO的靶向释放，有很好的应用前景.NO供体是指在体内经酶促反应或非酶促反应释放NO的一类化合物，如有机硝酸盐、有机亚硝酸盐、S‒亚硝基硫醇（RSNO）、金属配合物等多种化学物质已被用作NO供体，用于各种生物或医学领域[9]，如图2所示.2.1 有机硝酸酯（RONO2）及有机亚硝酸酯类RONO2是醇的硝酸酯，是最早的、目前最常用的NO供体.它们可以通过相应醇的酯化反应或烷基卤化物与AgNO3的反应来合成，如图3所示[10].这类供体的优点是给药途径比较广，但容易产生耐药性.硝酸甘油（GTN）和单硝酸异山梨酯（ISMN）是临床研究中使用最广泛的NO供体类药物.它们有几个既定的临床应用：GTN是一种廉价又有效的、能快速逆转与急性心绞痛有关疼痛的药物;ISMN是RONO2中释放NO较慢的一种，已被用于治疗慢性心绞痛[11].与RONO2类似，有机亚硝酸酯是醇类和亚硝酸酯化形成的酯.它们主要通过醇与亚硝酰氯（NOCl）反应或醇与NO和氧气（O2）经过酯化反应来合成，如图3所示[12].有机亚硝酸酯的主要作用是舒张静脉和降低血压，例如，亚硝酸丁酯（BN）、亚硝酸异丁酯（ISBN）和亚硝酸叔丁酯（TBN）已在临床上用作血管扩张剂[13].与GTN等RONO2相比，它们对酶的依赖性更低、作用效力更高，且不易引起耐药性.但是，它们缺乏选择性和生物利用度，以及细胞毒性和致癌性较高，因此不如RONO2常用[14].2.2 RSNO类RSNO是贮存、运输和释放NO的重要载体，在生物体内具有重要的生理作用.RSNO普遍存在于生物体的血液和组织中，只需要一个电子就能引发NO的释放，因此，可通过光、热、碱性pH值、过渡金属离子、抗坏血酸和酶等促使RSNO自发均裂反应产生NO[15].人工合成的RSNO是新型的NO供体类药物，通过静脉等途径进入体内后，可以参与呼吸、心血管、消化等多个系统疾病的诊断和治疗[16].2.3 金属-一氧化氮配合物NO是金属配合物中的强配体，它的结合常数比一氧化碳（CO）和O2高得多，具有多种氧化态，氧化价态的高低决定了配合物中NO的反应性.NO调节信号通路的主要机制是与金属中心原子（如铁（Fe）、钌（Ru）等）结合，如图4所示[12]，如血红素基团或蛋白质的铁硫簇.硝普钠（SNP）已经广泛应用于急性降压药物和动静脉血管扩张剂，其血管舒张作用是由NO的产生而造成的[17].SNP晶体在避光且干燥的条件下可以长时间保存，光和O2会促使其水溶液分解，并释放出NO和氰化物，从而导致“氰化物毒性”，对机体造成伤害[18].除了Fe之外，Ru对NO也有很高的亲和力，且Ru对NO的亲和力可以随着其他配体的改变而变化，以便调节NO的释放.光活性Ru配合物热稳定性好，且能在紫外光照射下释放NO.然而，NO的有效释放需要使用对组织有害的高功率紫外线，这一缺陷阻碍了该类NO供体的临床应用[19].2.4 其他供体1956年MAGEE等[20]发现了二甲基亚硝胺和亚硝胺二甲胺均可致大鼠肝癌.其致癌作用是由于N-亚硝基化合物会导致蛋白质和核酸的烷基化.但是，N-亚硝胺却是一种能舒张血管的NO供体.链脲霉素（STZ）含有N-亚硝胺基团，具有抗肿瘤、致糖尿病和致癌作用[21].胰腺β细胞具有低水平的活性氧（ROS）清除酶，对NO和ROS比较敏感，STZ能在胰岛β细胞中释放NO，使细胞的DNA受到损害[22].因此，可将此类NO供体作为抗癌药物进行研究.偶氮二醇烯鎓盐（NONOates）释放NO的机制遵循动力学且不受细胞代谢产物或酶的催化.它们以固体形态稳定存在，但在生理条件下会自发分解生成NO，分解速率会因结构、温度和pH值而改变[23].因此，可以通过它们在体外的分解速率直接预测药物的持续作用时间.研究证明：NONOates能够降低多种肿瘤细胞的增长速率，抑制肿瘤细胞的生长[24].此外，还可以通过硝酸盐→亚硝酸盐→NO途径合成NO.体内的硝酸盐主要来自膳食和自身合成.在生物体内，循环的硝酸盐被唾液腺主动摄取，并被口腔中的细菌还原为亚硝酸盐，在血液和组织中进一步代谢为NO和其他生物活性氮氧化物[5].亚硝酸盐是氮氧化物的氧化还原过程中的中间产物，在血液和组织中比较稳定，且可被多种物质还原成NO，包括肌红蛋白、血红蛋白、抗坏血酸、黄嘌呤氧化还原酶、质子和多酚[5].这些途径产生的NO会因缺氧和酸中毒条件而增加，因而可以保证NO的产量.1.2 NO的生物学作用。
恶性肿瘤的生物治疗与靶向治疗
首要终点——OS
CheckMate 017 SQ
CheckMate 057 non-SQ
生存优势能 否持续？
K. Reckamp , et al. 20res, et al. 2015 ASCO, abstract LBA109
肿瘤学概论 恶性肿瘤的生物治疗与靶向治疗
第一部分
肿瘤的免疫治疗
现代免疫学奠基人
Edward Jenner 牛痘的发明者
(1796)
1926年-1930 年，印度天 花导致50万 人死亡。
肿瘤的免疫监视
DC向 APCs转化， 递呈抗原
肿瘤表达特 异性抗原
T效应细胞 活化与增殖
检查与平衡
T 和 NK 细 胞攻击杀伤 肿瘤细胞
1. Topfer, et al. 2011. 2. Nurieva, et al. 2013. 3. Mellman, et al. 2011.
T淋巴细胞表达的免疫抑制性受体
• 细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 (CTLA4) • 程序性死亡分子1（programmed death
1,PD-1） • 程序性死亡分子配体1（programmed
2.基因灭活（Gene inactivation）：利用反义核酸技术 或核酶特异地封闭基因表达或降解转录产物
3.前体药转换（Prodrug acitvation）：采用给予前体药 物的方法减少化疗药物对正常细胞的损伤。
基因治疗的途径
1.体外途径：安全，但操作烦琐，设备要求比 较高
免疫调节
细胞毒性
ADCC CDC 凋亡
肿瘤细胞 细胞毒性
过继细胞治疗
Cancer Control 2013;20:32.
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• 生理功能 调节细胞生长增殖,常为生长因子或其受体基因 调节细胞发育分化,调节胚胎器官发育,调节细胞凋亡
2020/6/25
• 慢性转化型 感染后长时间才致癌 病毒基因组不含癌基因 无体外转化细胞的能力
2020/6/25
(二)细胞癌基因(原癌基因)
• 发现 用 Ras基因突变体转染NIH3T3,使之成为转 化细胞
• 原癌基因 能激活为癌基因的正常细胞基因
2020/6/25
(三)病毒癌基因的Байду номын сангаас源与特点
• 来源: 细胞癌基因 例如RSV的Src癌基因,所有脊椎动物DNA都含有近似 病毒癌基因的基因
• 特点 1.缺失内含子 2.转录由病毒的长末端重复序列LTR控制, LTR是强的增 强子,可使转录高水平进行 3.多数已发生突变,例如病毒癌蛋白常缺失原癌蛋白的羧 基而有转化活性
2020/6/25
RNA肿瘤病毒诱导细胞转化的途径
Visrus RNA
RT
cDNA
整合
宿主
转录、翻译、DNA
包装、捕获
三、癌基因的命名 四、癌基因的分类
• 表达产物的定位 • 基因结构 • 表达产物生理功能 1.src家族 2.ras家族 3myc家族 4.erb家族 5.bcl-2家族
2020/6/25
癌蛋白的生理功能
癌蛋白:癌基因的表达产物,使细胞增殖分化失常而 癌变
1.与生长因子或生长因子受体有关——erbB 2.与信号转导途径相关: 与酪氨酸蛋白激酶信号转导途径相关——src 与鸟苷酸结合蛋白(G蛋白)相关—— ras\P21 3.转录因子:myc家族 4.细胞周期、细胞凋亡调控:bcl-2抑凋亡基因
突变/移码突变 (frame-shift mutation ) 3. 重排( rearrangement)
2020/6/25
(3)DNA的损伤和修复(DNA damage and repairing )
• 光复活 (photoreactivation): 光修复 酶(photolyase)
• 切除修复 (excission repairing): DNA-polⅠ, DNA ligase
Visrus RNA
逆转录
不含癌基因 整合、重排、插入
LTR 2020/6/25
癌基因
突变 病毒癌基因
整合、恶性转化
LTR 癌基因
逆转录病毒转导原癌基因的三种模型
• 直接包装 • 整合重排剪接 • 在反转录中突变
1、直接包装了癌基因成为急性转化型 2、整合时,插入突变激活了原癌基因,或使抑癌基因失活;或
2020/6/25
一、癌基因的发现
(一)病毒癌基因v-onc
• 1910年Rous发现鸡肉 瘤病毒RSV的致癌作用
• 1975年从RSV中分离 到src癌基因
• 致癌病毒分RNA病毒、 DNA病毒
• 致癌病毒以RNA病毒即 逆转录病毒为主
2020/6/25
DNA肿瘤病毒
主要DNA肿瘤病毒类型: • 多瘤病毒:使小鼠致瘤 • 人类乳头瘤病毒HPV:可引起子宫颈癌 • 腺病毒:致瘤性弱,改造后是基因治疗载体
肿瘤分子生物学
2020/6/25
3’-5’外切酶活性
2020/6/25
(三)突变与修复
(1)引起突变的因素 化学、物理、生物
2020/6/25
(2) 基因突变(gene mutation)
1.点突变(point mutation) 转换( transition) 颠换 (transversion) 2. 缺失(deletion)、插入 (insertion )与框移
因病毒有强大的启动子\增强子, 从而大大提高整合位置附 近的原癌基因表达水平;或包装了原癌基因,重排剪接激活 原癌基因 3、在逆转录中原癌基因突变为癌基因,因为逆转录酶合成 DNA的 差错率很高;或包装时使旁边的原癌基因或抑癌基 因缺失部分序列
2020/6/25
二、癌基因和原癌基因
原癌基因 • 特点:广泛存在于正常真核细胞基因组中的正常基因,
2020/6/25
2020/6/25
1、逆转录
逆转录病毒
Virus RNA 逆转录酶RT
RNA-DNA 杂交体
dsDNA
整合到宿主细胞DNA中随细胞 分裂复制,传到下一代
转录 宿主RNA、 Virus RNA
翻译
合成宿主自身蛋白质
病毒蛋白质
2020/6/25
2、逆转录病毒转化类型
• 急性转化型 感染短期内致癌 癌基因在病毒基因组内,但不插在结构基因中 有体外使细胞转化能力
2、永生化细胞系
没有临界点,永生化 帖壁依赖性 生长因子依赖性 接触抑制 无致癌性
2020/6/25
3、转化的细胞或 肿瘤细胞株
无临界点,永生化 无帖壁依赖性 无生长因子依赖性 无接触抑制 有致癌性
2020/6/25
人胃癌细胞MGC7901
2020/6/25
H22小鼠肝癌细胞
2020/6/25
• 重组修复 (recombination repairing) • SOS修复 (SOS repairing):
应急性修复,允许差错, 保留错误多,引起广泛、长期突变
2020/6/25
(4)整体修复
多基因突变
细胞转化
启动整体修复
• 细胞凋亡: 程序化死亡.生理性死亡 • 免疫系统
2020/6/25
2020/6/25
(一)肿瘤细胞的特征
1、肿瘤是一种基因异常的疾病,也是细胞疾病 肿瘤细胞表型能稳定遗传 病因:DNA异常、发生多基因突变。 DNA诱变剂都是致癌物 体外转染癌基因可引起正常细胞变异为癌细胞
2020/6/25
(二)肿瘤细胞体外培养中的特征
1、原代细胞 脊椎动物的正常细胞 临界现象,生长数代后死亡 帖壁依赖性 生长因子依赖性 接触抑制
插入绿色荧光蛋白的 小鼠黑色素瘤细胞
2020/6/25
接种H22肝癌细胞的小鼠
2020/6/25
第一节 原癌基因
• 癌基因oncogene :能使靶细胞发生恶性转化 的基因
• 病毒癌基因v- onc: 病毒基因组中能诱发肿瘤的核酸片段.如vSrc
• 原癌基因(细胞癌基因)c-onc: 与癌基因同源、正常细胞内调控生长和分化的 基因,变异后成为癌基因。