两水相萃取法

例如：
3、处理量相同时，双水相萃取法比传Байду номын сангаас的分离方法， 设备需用量要少3—10倍。
应用概况：
1、已被广泛地应用在生物化学、细胞生物学和生物
化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病毒等产品的 分离纯化和分析等。 用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过程也达 到相当规模，如甲酸脱氢酶的分离已达到几十千克湿细胞
六、应用 （一）、工艺方面的问题
两水相萃取法主要应用于胞内酶提取。运用两水相萃 取的方法，应满足下列条件： (1)、欲提取的酶和细胞应分配在不同的相中： (2)、酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时， 经过一次萃取，就能得到高的收率； (3)、两相用离心机很容易分离。
典型的从细胞碎片中分离酶的数据示于表19—3。
在生化工程中得到应用的仅限于聚乙二醇—葡聚糖 和聚乙二醇—无机盐系统，这是由于这两种聚合物证明 都无毒性，而且它们的多元醇或多糖的结构，能使生物
高分子稳定。
二、相 图
对于由P, Q两种聚合物和水组成的系统，当P、Q达到 一定浓度时才会形成两相。图中曲线把均匀区域和两相区 域分隔开来, 称为双节线。
分配在上相中的蛋白质可通过加入适量的盐(有时也可同 时加入少量的PEG)，进行第二次两水相萃取。通常第二步萃
取的目的系除去核酸和多糖，它们的亲水性较强，因而易分
配在盐相中，则蛋白质就应留在PEG相中。 在第三步萃取中，应使蛋白质分配在盐相(例如，调节 pH)，以使和主体PEG分离。 色素由于其憎水性通常分配在上相。
分成两相。这种现象称为聚合物的不相容性。 如果两种聚合物间存在引力，而且引力很强，如在带 相反电荷的两种聚电解质之间，它们相互结合而存在于一 共同的相中。
如果两种聚合物间不存在较强的斥力或引力，则两者
能相互混和。 聚合物与盐类溶液也能形成两相，这是由于盐析作用， 如PEG与碱性磷酸盐或硫酸盐形成的两相。
几种带正电或负电的PEG衍生物：带正电；三甲胺基 PEG(TMA-PEG)：氨基PEG(PEG—NH2)。带负电：PEG-磺 酸盐；羧基一PEG(PEG一COOH). 利用荷电PEG能产生较大的相间电位，故能使分配系数 增加。
五、成相聚合物的回收
聚合物或盐回收利用十分重要。
例如：从1000kg面包酵母中萃取反丁烯二酸酶需要用
其中双水相萃取技术，又称水溶液两相分配技术是
近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。
双水相萃取法的优点： 1、能够保留产物的活性，整个操作可以连续化，在除 去细胞或其碎片时，还可以纯化蛋白质2－5倍，与传统的 过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是成 本上都要优越得多。
2、双水相萃取法和传统的酶组分离方法(盐析、有机 溶剂沉淀等)相比也有很大的优势。
通常将蛋白质分配在上相(PEG)，而细胞碎片分配在下 相(盐)。反过来的情况对相的分离不利，因为当上相含固量 高时，分离机的性能会受到影响。 从表19—3可见，在大多数场合下收率都能达到90％，
分配系数在1—20之间，多数场合大于3；很多杂蛋白也能
同时除去。 PEG／盐系统用得很广，主要由于PEG价廉和其选择 性高于PEG／粗葡聚糖系统的缘故。
例如：加入NaCl对卵蛋白和溶
菌酶分配系数的影响见图19－4。 由此可见，加入适当的盐类， 会大大促进带相反电荷的两种蛋白 质的分离。
当盐类浓度继续增加时， 影响逐渐减弱，分配系数基本
上无变化。
当盐类浓度很大时，则由 于盐析作用，蛋白质易分配于 上相，1ogK几乎随NaCl浓度 增大，而线性地增大(图19—5)。 各种蛋白质的增大程度有差异， 利用此性质，可使蛋白质相互
在萃取时，单位重量相系统中匀浆液的加入量是一个 重要的参数。 从经济上考虑，当然希望加入的量多一些，但这样会影 响原来成相聚合物的相系统，改变相比，或使分配系数降低， 结果使收率降低。 一般1千克萃取系统处理200到400克湿菌体为宜。
在PEG／盐系统中要使细胞
碎片分配到下相，还是比较容易
的。 Hustedt等经过系统研究， 对PEG1550／磷酸钾系统的相图 中(图19—7)，如起始混合物的浓 度处在虚线范围内时，细胞碎片 都会分配到下相。
680kg PEG－1550和533kg K3PO3，若不回收利用，化学品 的消耗会使生产成本大幅度上升。
如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在错流 过程操作方法下，用超滤或渗析的膜过滤回收。
膜分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物
的最佳方法。
如果蛋白质积聚在聚乙二醇中，可以通过加入盐来精
19 两水相萃取法
传统的溶剂萃取法并不适合大分子生物产品： 1、胞内产品需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞 颗粒尺寸的变化给固液分离带来了困难； 2、生物产品对pH值、温度和离子强度等因素敏感， 在有机溶剂中的溶解度低并且会变性。
因此，基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大
规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。
当达到平衡时，分子或颗粒如处在某一相中时，能量较 低，则它们比较集中地分配在该相中。 设分子自相2移至相1所需的功为△E，则根据相平衡时， 化学位应相等的原则，不难推得，分配系数K应为：
从上式可知，在某一相系统中，分配系数主要决定于分子 的表面积与表面性质。
（二）电荷的影响
（三）、综合因素
表面自由能可用来量度表面的相对憎水性， 改变成相聚合物的种类，其平均分子量和分子量 分布以及浓度都对相的憎水性有影响。因为表面 积一般来说都比较大，故△γ的微小改变会引起蛋 白质的分配系数有很大变化。 加入系统中的盐类，以及pH会影响相间电位 差和蛋白质所带电荷数，因而也对分配系数有影 响。
如上所述，影响分配系数的因素很多，而且这些 因素相互间又有影响，因此，目前尚不可能定量地关 联分配系数与能独立测定的蛋白质的一些分子性质之 间的关系。适宜的操作条件，只能通过实验得到。
双水相萃取中，原材料成本占了总成本的85％以上并 且总成本随生产规模的扩大而增加很多。 解决方案：合成价格低廉、具有良好的分配性能的聚 合物；加强萃取后的回收利用研究。
一、两水相的形成
当两种聚合物溶液互相混和时，究竞是否分层或混
和成一相，决定于两种因素：
1、熵的增加。 2、分子间作用力。
两种物质混和时，熵的增加与涉及的分子数目有关。
（五）、温度
温度影响相图，特别在临界点附近，尤为显著，因而 也影响分配系数。但是在离临界点较远时，这种影响较小。 大生产中，总采用常温，可节约冷冻费用，这是由于 聚合物对蛋白质有稳定作用，不会引起损失。同时，温度 高时，粘度较低，有利于相的分离操作。
（六）、荷电PEG作为成相聚合物
在聚合物上引入电荷可以增大两相间的电位差。可以在 PEG或聚葡糖上引入带电荷的基团。但从式(19—19)来看， 相间电位差与电荷数成反比，而每一葡聚糖分子上可以引入 很多带电荷的基团，故效果较差。相反每一分子PEG只含两 个羟基，只能引入两个荷电基团，故使电场增大的效果较好。
（二）、聚合物的浓度
当接近临界点时，蛋白质均匀地分配于两相，分配系 数接近于1。
如成相聚合物的总浓度或聚合物／盐混合物的总浓度
增加时，系统远离临界点，系线的长度也增加，此时两相
性质的差别也增大，蛋白质趋向于向一侧分配，即分配系
数或增大超过1，或减小低于1。
当远离临界点时，系统的表面张力也增加。如果进行 分配的是细胞等固体颗粒，则细胞易集中在界面上，因为
分离。
由于HPO42－离子在PEG一葡聚糖系统中的分配系数
很小，因而加入pH大于7的磷酸盐缓冲液能很方便地改变
相间电位差，而使带负电荷的蛋白质移向富聚乙二醇的相。
（四）、pH的影响
pH会影响蛋白质中可以离解基团的离解度，因 而改变蛋白质所带电荷和分配系数。
根据式(19—10)，当系统一定时，分配系数K与 荷电数Z的关系可表示为： (19—21)
式中γ与系统的组成、加入的盐类和温度等有关。 对一些已知PH与荷电数之间的关系的蛋白质，如溶菌 酶和卵蛋白的研究表明，确实符合于上式。
pH影响磷酸盐的离解程度，若改变H2PO4- 与
HPO42-的比例，会使相间电位发生变化而影响分配系数。
pH的微小变化有时会使蛋白质的分配系数改变2—3个 数量级。
减小，当达到K点时，系线的长度为0，两相间差别消失， 点K称为临界点或褶点。
双节线的位置形状与聚合物的分子量有关。分子量越高， 相分离所需的浓度越低；两种聚合物的分子量相差越大，双 节线的形状越不对称。
三、分配理论
（一）、表面能的影响
和溶剂萃取法一样，蛋白质在两水相间的分配，由 分配系数 K＝Cl／C 2 来描述、习惯上Cl代表上相中的浓度， C2代表下相中的 浓度。 当相系统固定时, K为一常数，与蛋白质的浓度无关.
例如, 点M代表整个系统的组成， 该系统实际上由两相组成，上相和下 相分别由点T和B表示。M、T、B三 点在一直线上，T和B代表成平衡的两 相，其相连的直线称为系线. 在同一条 系线上的各点分成的两相，具有相同 的组成，但体积比不同。
(19-1)
式（19－1）的证明：
当系线向下移动时，长度逐渐减小，这说明两相的差别
制，加入的盐导致蛋白质在盐相中重新分配。 PEG的分离同样可以用膜分离来实现，即用选择性孔
径较大的半透膜来截留蛋白质，同时排除PEG进行回收。
另一种力法是通过盐折或使用水溶性的溶剂来沉淀蛋 白质，但是固体(产物)的去除被存在的PEG阻碍。 也可使用离子交换和吸附，它们是通过蛋白质与基质 的选择性相互作用进行的。然而，当粘性聚合物溶液通过 柱被处理的时候，会出现高的压力降。 除此外，也可以通过电泳或亲和分配和双水相萃取结 合的方法来回收或减少PEG的用量。
规模，半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。
2、近年来又进行了双水相萃取小分子生物活性物质；