马氏珠母贝(Pinctada fucata)血细胞RNA-Seq转录组数据中补体样组分分析
珍珠与马氏珠母贝表型性状相关性以及矿化基因在珍珠囊和外套膜中的定量表达研究
学校代码： 10589 学号：10090801210013分类号：密级：海南大学硕士学位论文题目：珍珠与马氏珠母贝表型性状相关性以及矿化基因在珍珠囊和外套膜中的定量表达研究作者：王海指导教师：石耀华（教授）顾志峰（教授）专业：水产养殖时间：二○一三年五月摘要马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii Dunker，又称合浦珠母贝）是我国培育海水游离珍珠的主要贝类。
马氏珍珠贝人工游离海水珍珠的生产一方面需要细胞小片贝（或称供体贝）提供由外套膜内缘制备的细胞小片，另一方面需要育珠母贝（或称受体贝）接受细胞小片和珠核的植入，并且珍珠的形成完全是在育珠母贝体内。
为此，本研究以大小不同的三组马氏珠母贝为细胞小片贝插核育珠，分析马氏珠母贝珍珠质量与对应的细胞小片贝、育珠母贝之间的相互关系，并采用荧光定量PCR技术检测了15个矿化基因在外套膜中部(MC)、珍珠囊(PS)和外套膜外缘(ME)中的表达量，进而分析了矿化基因表达水平与珍珠的珍珠层厚度之间的联系。
研究结果如下：游离海水珍珠质量与细胞小片贝和育珠母贝之间关系研究结果显示：1、小片贝个体大小对所育珍珠的直径、重量、珠层厚度影响不显著；珍珠质的颜色上，小贝和中贝组的L*值均与大贝组之间存在显著差异；大贝组和小贝组之间的b*值存在显著差异；各组间的其余L*值、a*值和b*值之间均没有显著差异。
2、小片贝大小对珍珠颜色L*与b*有显著影响，尤其b*值；小片贝个体与珍珠颜色相关，个体越大，越容易产生金色珍珠（距离金珠色差越小）。
3、珍珠的直径、重量和珍珠质层厚度与育珠母贝的壳高、总体重、壳重显著正相关，相关系数基本上为0.22~0.34之间；珍珠的颜色参数L*值与细胞小片贝的壳高、总体重、壳重有显著的负相关，相关系数为-0.08~-0.10；培育珍珠的颜色参数b*值与细胞小片贝的壳高、总体重、壳重有显著正相关，相关系数分别为0.14、0.09和0.13。
马氏珠母贝的化学成分与药理作用研究进展
马氏珠母贝的化学成分与药理作用研究进展作者：黄庆杜正彩侯小涛范氏芳草罗花邓家刚来源：《安徽农业科学》2014年第35期摘要通过查阅国内近20年相关文献，对马氏珠母贝化学成分及药理作用的研究成果进行综述，旨在为其进一步开发利用提供科学依据。
关键词马氏珠母贝；化学成分；药理作用中图分类号 S944.3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）35-12526-03马氏珠母贝（Pinctada martensii（Dunker）），又称合浦珠母贝、珠牧、珠母、真珠母、明珠母，生活在波浪较为平静的内湾、泥沙、岩礁或石砾较多的海底，是重要的海水养殖贝类和生产珍珠的主要母贝。
马氏珠母贝分布于我国广西、广东、海南、台湾、福建、江苏、上海、浙江、安徽、山东沿海海域，另外在日本海域亦有分布[1]。
早在汉代就流传有“合浦还珠”的故事，至宋代广西合浦沿海一带开始大量采集马氏珠母贝天然珍珠，至今还保存着当时钦差大臣收珠的“珍珠城”遗址（现称白龙圩）。
20世纪初，日本首先用它作为母贝养殖生产珍珠。
20世纪60年代，我国成为马氏珠母贝养殖珍珠的出口国。
国际上公认我国出产的南海珍珠（即马氏珠母贝所产珍珠）的质量在世界上首屈一指。
在中医用药方面，较常用的部位是其贝壳与珍珠。
贝壳的功效作用是平肝潜阳、安神定惊、清肝明目、止血，适用于治疗头痛眩晕、心悸失眠、癫狂惊痫、目热、翳障、吐血衄血、崩漏等病症[1]。
珍珠自古以来就是中医的名贵药材，具有清热解毒、安神定惊、平肝潜阳、收敛生肌以及治疗妇女血崩等功效[2]。
现代研究发现，珍珠具有抑制褐质素的功能，可增强细胞活力，延缓细胞衰老，而人体的衰老与褐质素的增多有密切的联系。
珍珠可促进人体胶原细胞的生长，修复人体受伤组织，并可促进其再生[3]。
现代对马氏珠母贝研究较多的是其提取物药理活性、遗传育种、插核育珠以及珍珠层的结构、成分和成因等方面。
笔者综述了马氏珠母贝的化学成分及其提取物药理作用的研究进展。
马氏珠母贝蛋白盐提及其美拉德反应产物研究
马氏珠母贝蛋白盐提及其美拉德反应产物研究摘要：对马氏珠母贝（pinctada martensii）蛋白的美拉德反应产物成分及活性进行了研究，以期为马氏珠母贝在食品添加剂方面和抗氧化剂的应用提供理论依据，为马氏珠母贝的综合利用提供新的途径。
试验采用盐提法提取马氏珠母贝蛋白，探讨料液比、nacl 浓度、提取温度、提取时间对蛋白质提取率的影响，确定了盐提马氏珠母贝蛋白的最佳提取工艺条件为nacl浓度0.75 mol/l、提取温度35 ℃、提取时间80 min、料液比1∶20（m/v，g∶ml）；采用气相色谱-质谱（gc-ms）检测其产物的风味成分，测得其产物主要为醇类、酯类、酮类、醛类、杂环类化合物等；对美拉德反应产物抗氧化性的研究结果表明，马氏珠母贝盐提蛋白美拉德反应产物具有较强的抗氧化性，因此可作为一种安全的天然抗氧化剂。
关键词：马氏珠母贝（pinctada martensii）；盐提；美拉德反应；风味成分；抗氧化中图分类号：ts254 文献标识码：a 文章编号：0439-8114（2013）10-2397-05马氏珠母贝（pinctada martensii）又名合浦珠母贝，属软体动物门双壳纲珍珠贝目珍珠贝科，是我国人工培养海水珍珠养殖最广、数量最大的贝种[1]。
马氏珠母贝肉是一种高蛋白、低脂肪、营养价值很高的海产品，粗蛋白含量高达74.9%[2]，但由于贝肉是海水珍珠生产过程中产生的副产物[3]，目前珍珠贝肉除一部分以鲜销供食用之外，相当一部分资源因缺乏有效的加工手段而未能得到充分利用。
美拉德反应产物含有一定的抗氧化性物质，具有较大的开发应用潜力，越来越受到人们的重视[4]。
目前已有以马氏珠母贝蛋白酶解产物为原料，运用美拉德反应制备肉味香精的研究报道[5-7]。
而以盐提法提取的马氏珠母贝蛋白为原料的研究尚未见报道。
盐溶法提取蛋白质主要是由于稀盐溶液可促进蛋白质的溶解。
稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，使蛋白质分子彼此排斥并使蛋白质分子与水之间相互作用加强，溶解度增高。
马氏珠母贝肉酶解产物ACE抑制活性的研究
马氏珠母贝肉酶解产物ACE 抑制活性的研究3曹文红,吴红棉,章超桦,徐炳华,何荣方(广东海洋大学食品科技学院,广东湛江,524025)摘 要 利用胰酶、枯草杆菌中性蛋白酶,在50℃、p H 为710～810,m (贝肉)∶V 水=1∶3的条件下,对马氏珠母贝肉进行双酶水解4h 制备得到酶解产物及残渣。
利用Alcalase 214L 、胃蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶对残渣进行再次酶解。
结果表明:残渣蛋白质含量按干基计达5412%;Alcalase 214L 、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶对残渣的酶解效果较好;残渣的木瓜蛋白酶酶解产物ACE 抑制活性较强;马氏珠母贝肉酶解产物清除自由基活性较强的组分分子量为944u ,残渣木瓜蛋白酶酶解产物清除自由基活性较强的组分分子质量在1300～259u 。
关键词 马氏珠母贝,酶解,ACE 抑制活性,分子量分布 第一作者:博士。
3广东海洋大学自然科学团队项目(No.0612258) 收稿日期:2008-02-15 血管紧张素转换酶(Angiotensin I 2ConvertingEnzyme ,ACE )在血压的生理调节中具有重要的作用。
ACE 催化血管紧张素I 转化成具有强烈血管收缩作用的血管紧张素II ,同时使具有血管扩张作用的缓激肽失活,引起血压上升[1]。
通过抑制ACE 活性可以降低血压或阻止血压上升。
在成功开发人工合成的ACE 抑制剂Captopril 后,更多的合成ACE 抑制剂被研究开发出来并用于临床,取得了良好的治疗效果。
但化学合成的ACE 抑制剂一般都具有一定的毒副作用,因此寻找安全高效的ACE 抑制剂一直是降血压药物研究中的重点课题[2]。
近年来,随着高血压的发病率越来越高,具有降血压活性的ACE 抑制肽(降血压肽)已成为生物活性肽研究领域的热点之一,已经先后从众多的食品蛋白酶解产物中分离获得了ACE 抑制肽,如大豆蛋白[3]、酪蛋白[4]、玉米蛋白[5]、沙丁鱼[6]、金枪鱼[7]等。
马氏珠母贝的研究进展
马氏珠母贝的研究进展摘要综述了马氏珠母贝的遗传育种、插核育珠以及珍珠层的结构、成分和成因等方面的研究进展，以期为马氏珠母贝的进一步研究提供依据。
关键词马氏珠母贝；遗传育种；插核育珠；珍珠马氏珠母贝（Pinctada martensii（Dunker）），又称合浦珠母贝，是培育海水珍珠的主要珍珠母贝。
中国南珠，是指在中国南海海域用马氏珠母贝养殖的海水珍珠。
20世纪初，日本人利用改进我国养殖佛像珍珠的方法进行大规模海水有核珍珠的生产，并全面系统地研究了珍珠的养殖与加工技术，近100年来，日本珍珠产量和质量都居世界第一。
20世纪50年代末，我国水产科技工作者开始了马氏珠母贝资源的调查、人工育苗和养殖试验。
在老一辈珍珠贝类专家张玺、熊大仁等教授的指导下，我国于1958年取得海水有核珍珠养殖试验的成功，开辟了人工养殖珍珠的新纪元。
1965年又获得了马氏珠母贝人工育苗的成功，并通过对马氏珠母贝的生理、生态、插核、育珠和病虫害防治等方面的研究，解决了育珠母贝来源的难题，掌握了人工插核育珠技术，从而实现了海水珍珠的全人工培育，为珍珠养殖业的发展奠定了良好的基础。
广东、广西、海南属热带、亚热带海洋性气候，有几千千米长的海岸线及众多的岛屿和港湾，常年海水温度为15～30℃，海水盐度稳定，水质良好，饵料生物丰富，非常适合利用马氏珠母贝养殖海水珍珠。
目前，我国的海水珍珠产业在南海部分地区已成为经济发展的支柱性产业和沿海群众脱贫致富的重要门路[1]。
近100年来，马氏珠母贝的的研究主要集中在遗传育种、术前处理、插核育珠、珍珠层结构、成分和成因等方面。
1马氏珠母贝的遗传育种20世纪初，日本的御木本幸吉等取得海水珍珠养殖研究的成功，并促成了珍珠的商业化养殖生产。
20世纪上半叶，小林新二郎等日本学者对珍珠的养殖从生物学的角度进行了系统研究[2]。
我国对马氏珠母贝的研究开始于20世纪60年代，这期间我国的科技工作者对马氏珠母贝的生理生态等方面做了深入细致的研究。
马氏珠母贝GAPDH基因克隆及其在去甲基化受精卵中的表达分析
１ 材料与方法
１．１ 样品采集 试验用马氏珠母贝采集自中国科学院大亚湾海洋生物综
合实验站（深圳），于实验基地海水池中暂养 １周。取健康马 氏珠母贝外套膜组织，迅速转移至 －８０℃液氮罐中保存待 用。此外，设立 ３组马氏珠母贝雌、雄亲本单对配对的人工授 精试验。分别将每组单对配对亲本产生的精子和卵细胞混合 形成受精卵，并将每组分成两大部分，对照组采用灭菌海水处 理 １０ｍｉｎ，试 验 组 用 １０－５ ｍｏｌ／Ｌ５－氮 杂 胞 苷 溶 液 处 理 １０ｍｉｎ。处理后分别采集各组受精卵样品于液氮保存待用。 １．２ 核酸提取及 ｃＤＮＡ模板合成
马氏珠母贝（Ｐｉｎｃｔａｄａｆｕｃａｔａ）是中国南部沿海广泛分布 的一种珍珠贝。目前，尚未见马氏珠母贝 ＧＡＰＤＨ基因全长 ｃＤＮＡ序列的相关报道。本研究对马氏珠母贝 ＧＡＰＤＨ基因 的全长 ｃＤＮＡ进行了克隆及生物信息学分析，并探索了去甲 基化试剂对受精卵中 ＧＡＰＤＨ基因表达水平的影响，以期为后 续 ＧＡＰＤＨ的功能研究提供基础。
收稿日期：２０１６－１２－０４ 基金项目：海南省自然科 学 基 金 （编 号：２０１６４１６６）；海 南 热 带 海 洋 学
院学科带头人和博士科研启动基金（编号：ＲＨＤＸＢ２０１６２０）。 作者简介：李耀国（１９８６—），男，湖ห้องสมุดไป่ตู้湘乡人，博士，讲师，主要从事水
产动物分子育种与资源保护研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｏｇｕｏｌｉｊｋｌ＠１６３．ｃｏｍ。
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江苏农业科学 ２０１８年第 ４６卷第 １０期
李耀国，孙 彤，武文丽，等．马氏珠母贝 ＧＡＰＤＨ基因克隆及其在去甲基化受精卵中的表达分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１０）：３８－４２． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．１０．０１０
马氏珠母贝组蛋白乙酰化修饰相关基因的分子进化及功能分析
·575·马氏珠母贝组蛋白乙酰化修饰相关基因的分子进化及功能分析张明1，杨帅1，曹艳飞1，卢晓文1，焦钰1，2*（1广东海洋大学水产学院，广东湛江524088；2广东省珍珠养殖与加工工程技术研究中心，广东湛江524088）摘要：【目的】分析组蛋白乙酰化修饰相关基因的分子进化及其在马氏珠母贝（Pinctada fucata martensii ）植核后的表达变化，明确组蛋白乙酰化修饰在植核免疫中的作用，为合理控制植核免疫反应提供理论依据。
【方法】通过生物信息学分析方法对马氏珠母贝、长牡蛎、斑马鱼及人类等9个物种的组蛋白乙酰转移酶（HAT ）和组蛋白去乙酰化酶（HDAC ）进行全基因组鉴定，并分析其分子进化历程，同时通过已有的转录组数据分析马氏珠母贝HAT 和HDAC 基因在植核后的表达变化，采用组蛋白H3/H4总乙酰化定量分析试剂盒检测马氏珠母贝植核后血细胞组蛋白H3/H4乙酰化水平。
【结果】HAT 和HDAC 基因家族在9个物种基因组中的数目差异不明显，其原始共同祖先（MRCA ）共包含8个HAT 基因家族的9个基因及19个HDAC 基因家族的22个基因。
马氏珠母贝基因组含有2个HAT 家族（GNAT 和MYST ）的8个基因（2个GNAT 类基因，6个MYST 类基因）；HAT 基因家族成员中含有18个保守氨基酸序列，且所有MYST 类基因均含有MOZ_SAS 结构域，GNAT 类基因则含有Hat1_N 或Acetyltransf_1结构域，即具有较高的保守性。
马氏珠母贝基因组含有13个HDAC 家族的18个基因，包含3个I 类、3个II 类、10个Ⅲ类和2个IV 类。
其中，HDAC Ⅲ类基因家族包含3个保守氨基酸序列，HDAC I/II/IV 类基因家族包含21个保守氨基酸序列，但分布位置和序列组成差异明显，说明该家族成员结构具有多样性。
马氏珠母贝、长牡蛎和人类中HDAC Ⅲ类基因均包含1~2个SIR2结构域，HDAC I/II/IV 类基因包含1个或多个Hist-deacety1结构域。
马氏珠母贝(Pinctada fucata)血细胞转录组测序数据中SNP标记的开发及其功能注释分析
海 洋 与 湖 沼
０ＣＥＡＮ０Ｌ０ＧＩＡ ＥＴ ＬＩＭＮ０ＬＯＧＩＡ ＳＩＮＩＣＡ
Ｖｂ１．４９．Ｎｏ．２
马 氏珠 母 （Ｐｉｎｃｔａｄａ ｆｕｃａｔａ）ｇｌｌ 胞 转 录 组 测 序 数 据 中 ＳＮＰ标 记 的 开 发 及 其 功 能 注 释 分 析 木
摘 要 本 文基 于马 氏珠 母 贝（Ｐｉｎｃｔａｄａ ｆｕｃａｔａ）￣Ｌ细胞 比较 转录 组学 数据进 行 单核 苷酸 多 态性标 记
（ＳＮＰ）的开发和 关联 基 因的功 能注释分 析，以期为 ＳＮＰ 标 记 的利用提 供有效 信息 。在转 录组测序 获
得 的 ６７６３２条 ＳＮＰ－ｕｎｉｇｅｎｅｓ中共获 得 ９６２９９５个 ＳＮＰ位 点，位 点平 均发 生频率 约为 １个 ＳＮＰ／１００ｂｐ；
① 通讯 作者 ：张健 东 ，副 教 授 ，Ｅ．ｍａｉｌ：ｙｚｘｚｊｄ＠ １２６．ｃｏｒｎ 收稿 日期：２０１７－１０．１６，收修改稿 日期：２０１７—１１—２２
海 洋 与 湖 沼
４９卷
（王婷 等，２０１４）、斑 点叉尾 鲴（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｅｔａｔｕｓ）（Ｌｉ ｅｔ 除含有 接头 、重复及 测 序质量 较低 的原 始读数 后获得
（１６．２４％）富集到 ３２条 ＫＥＧＧ 子集，其 中以“信 号 转导”子 集 中富集 的 ＳＮＰ．ｕｎｉｇｅｎｅ最 多。进 一步 富集
分 析显 示 ６２９个 ＳＮＰ．ｕｎｉｇｅｎｅｓ注释到 “Ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”等 多条 免疫 防御相 关信号通 路 中；同时，根
据 ＳＮＰ位 点分 布情况 筛选 到 １２３个溶 藻 弧菌感染 前 、后 转录组 中特异 分布 的免疫 防御相 关候选 ＳＮＰ
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马氏珠母贝(Pinctada fucata)血细胞RNA-Seq转录组数据中补体样组分分析吴勇; 张野; 许尤厚; 梁雪茹; 王忠良【期刊名称】《《海洋与湖沼》》【年(卷),期】2019(050)006【总页数】11页(P1343-1353)【关键词】马氏珠母贝; RNA-Seq; 补体样组分; 保守结构域【作者】吴勇; 张野; 许尤厚; 梁雪茹; 王忠良【作者单位】广东海洋大学科技处湛江524088; 广东海洋大学水产学院湛江524088; 广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室(北部湾大学) 钦州 535000【正文语种】中文【中图分类】Q789与其他无脊椎动物一样, 贝类缺乏适应性免疫系统, 而主要依靠先天性免疫系统防御各种病原和外来物质的入侵, 以维持机体的正常生命活动; 非特异的先天性免疫防御被认为是宿主对抗细菌、真菌以及病毒等病原入侵的第一道防线。
补体系统作为先天性免疫系统的重要组成部分, 是迄今所知机体中最复杂的一个限制性蛋白水解系统(limited proteolysis system), 其不仅联系着先天免疫和获得性免疫, 而且广泛参与多种生理和病理过程(Beutler, 2004)。
由补体系统介导的生物学功能包括吞噬作用、细胞溶解、炎症、免疫复合物溶解、凋亡细胞清除及促进体液免疫应答等(Schmidt et al, 2000)。
自19世纪末被发现以来(Fujita et al, 2004a), 补体系统在哺乳动物中得到了广泛的研究。
补体系统必须被激活以启动一系列的生化反应, 才能表现出各种免疫效应, 并最终导致外来病原的裂解和破坏。
高等动物中补体的激活过程分为前端反应和末端通路两个阶段; 按激活物及激活顺序的不同, 前端反应又可分为三条途径, 即经典途径(classic pathway)、凝集素途径(lectin pathway)和替代途径(alternative pathway); 三条途径具有共同的末端通路(terminal pathway), 并形成膜攻击复合物(membrane attack complex, MAC)。
此外, Huber-Lang等(2006)发现小鼠血浆中的凝血酶(thrombin)分子可替代C3依赖型C5转化酶切割C5分子, 并由此提出了一条经凝血素(prothrombin)介导的补体激活途径。
补体系统是一种古老的免疫防御机制, 在无脊椎动物的免疫防御中发挥重要作用, 最近在无脊椎动物中陆续发现补体组分, 使得“补体系统在低等无脊椎动物中早已形成”的推论得到进一步确认(Nonaka et al, 2001; Smith et al, 2001; Dishaw et al, 2005)。
如在玻璃海鞘(Ciona intestinalis)和文昌鱼(Branchiostoma floridae)的基因组中发现了数百个含补体相关结构域分子(Azumi et al, 2003; Huang et al, 2008); 在昆虫等无脊椎动物中发现模式识别分子(Pattern recognition receptor, PRR)及丝氨酸蛋白酶(serine protease, SP)、纤胶凝蛋白(ficolin)、甘露糖结合凝集素相关丝氨酸蛋白酶(MBL-associated serine protease, MASP)、C3、C2和补体因子B等补体样分子(Matsushita et al, 2001; Nonaka et al, 2001; Blandin et al, 2004; Fujita et al, 2004b); 另外, 刺胞动物中也发现了C3样分子、B因子/C2以及参与形成MAC的蛋白分子(Nonaka et al, 2006; Miller et al, 2007)。
基于海胆(Strongylocentrotus purpuratus)原始补体系统的研究, Smith等(2001)提出由C3、B因子及MASP等组成的补体替代途径和凝集素途径在棘皮动物(海胆)和尾索动物(海鞘)中早就已出现。
最近, Wang等(2017)系统分析了太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)全基因组数据中补体样组分的结构域和系统进化关系, 提出贝类补体系统可能通过替代途径激活。
目前, 受限于少数无脊椎动物补体系统的研究结果以及全基因组信息, 无脊椎动物补体系统的组成及其激活途径的研究工作进展缓慢, 而对于贝类补体系统的研究工作更是匮乏。
近年来, 高通量测序技术的发展为研究无脊椎动物补体系统的结构特征、推断补体组分功能以及可能存在的激活途径提供了新的途径(Hibino et al, 2006; Huang et al, 2008; Zhang et al, 2012; Gerdol et al, 2015; Wang et al, 2017)。
本文基于前期转录组RNA-Seq数据检索马氏珠母贝(Pinctada fucata)补体样组分, 并对其结构域和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)刺激前后的基因表达水平进行了分析, 为深入了解马氏珠母贝免疫防御机制、探讨补体系统的进化起源提供新的依据。
马氏珠母贝(Pinctada fucata)(平均壳长70mm)购自广东省湛江市徐闻迈陈珍珠贝养殖场, 暂养于室内玻璃钢水槽中(80L/槽, 20只/槽); 水温25°C, 盐度28, 饲养期间连续充气, 投喂螺旋藻粉; 每天100%换水一次。
室内暂养一周后将珠母贝分为两组(每组40只); 第一组于闭壳肌处注射0.1mL浓度为5×107CFU/mL的溶藻弧菌(V. alginolyticus)悬液; 第二组于闭壳肌处注射同等体积的PBS (pH 7.4)作为对照。
注射4h后, 闭壳肌采集血淋巴, 每只约0.5mL; 采集的血淋巴分装至1.5mL离心管中, 每管1mL; 4°C, 800g离心10min收集血细胞, 并立即提取总RNA。
RNA-Seq文库构建及转录组测序的具体方法见Wang等(2016)。
转录组测序共获得70407878条Raw reads, 经去除含有接头、重复及测序质量较低的原始读数后, 获得56345139条Clean reads。
使用转录组de novo组装软件Trinity (Grabherr et al, 2011)对Clean reads进行组装, 并进行去冗余处理和进一步拼接, 共得到74007条unigenes(转录组Raw reads已提交至NCBI的SRA 数据库, 登录号为SRP041567)。
采用RSEM软件(Version1.1.21) (Li et al, 2011)将每个样品的Clean reads比对Trinity组装的参考序列, 得到每个样品比对的每个unigene上的read数目, 并进行RPKM标准化转换(Mortazavi et al, 2008), 进而分析unigene的表达水平; 采用DEGseq方法(version 1.12.0) (Anders et al, 2010)筛选差异表达unigene, 筛选阈值为q值<0.005且|log2 Fold Change| >1。
利用BLAST程序在Nt、Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG及Pfam数据库中比对unigene并获得期注释信息(E值<1.0E–5); 然后, 在此注释信息中检索含C1q结构域蛋白(C1q、C1qDC)、凝集素(凝集素、C型凝集素、胶原凝集素、甘露糖结合凝集素MBL)、C3、纤维蛋白原相关蛋白(fibrinogen-related protein, FREP)、丝氨酸蛋白酶、含硫酯蛋白(thioester-containing protein, TEP)、补体受体(complement receptor, CR)、补体因子及ficolin等补体样组分。
采用NCBI保守结构域数据库(https:///Structure/ cdd/cdd.shtml)及SMART server (http://smart.embl- heidelberg.de/)进行补体样组分的蛋白结构域检测。
通过对马氏珠母贝RNA-Seq转录组注释信息的检索, 共获得68条补体样成分unigene, 分别编码14个含C1q结构域蛋白、14个凝集素蛋白(含2个MBL、2个胶原凝集素及10个C型凝集素)、4个FREP、12个丝氨酸蛋白酶(含1个补体C2)、10个含硫酯键蛋白(含1个补体C4、1个补体C5、2个含硫酯蛋白及6个alpha巨球蛋白)、1个末端补体分子C6、5个补体受体、1个补体因子及7个ficolin(表1)。
脊椎动物中, C1q、MBL及ficolin等均作为PRR识别外来入侵病原微生物并激活补体系统的经典途径和凝集素途径。
在检索到的14个马氏珠母贝含C1q结构域蛋白(C1qDC)中, 共有11个C1qDC含有C末端球状结构域, 但均未能检测到N 末端的胶原结构域。
见表2。
甘露糖结合凝集素(Mannose-binding lectin, MBL)和能结合微生物表面的多糖,从而激活MBL相关丝氨酸蛋白酶和C3。
本文中, 2个MBL分子中均含有Lectin_leg样结构域, 但未检索到N末端胶原结构域和C型凝集素样结构域; 同时, 其他12个C型凝集素基因(C-type lectin, CTL)中均发现含有CTLD结构域。
见表3。
与MBL结构相似的ficolin也是由N端的胶原结构域和C端的糖识别结构域组成。
马氏珠母贝ficolin基因中均发现了识别糖结构的纤维蛋白原样(Fibrinogen-like, FBG)结构域, 但同时, RNA-Seq数据中还发现了4个含有FBG结构域的FREP, 推测其可能具有高等动物ficolin相似的配体结合功能。
见表4。
补体丝氨酸蛋白酶主要包括经典途径和凝集素途径中的MASP、C1r和C1s以及替代途径中的B因子和补体C2。
在马氏珠母贝RNA-Seq数据中, 共发现了12个丝氨酸蛋白酶基因(包括11个丝氨酸蛋白酶和1个补体C2分子); 其中, 9个丝氨酸蛋白酶基因中含有SPC结构域, 补体C2分子中含有一个串联CCP结构域, 但未发现同时含有CCP和SPC结构域的丝氨酸蛋白酶分子。
见表5。
马氏珠母贝RNA-Seq组装数据内共检索到10个含硫酯键蛋白家族分子, 包括含硫酯蛋白、补体C4/C5和alpha-巨球蛋白。
保守结构域分析发现, 以上含硫酯键蛋白均具有alpha 2-巨球蛋白超家族成员的特征保守结构域, 如硫酯键位点、受体结合区、A2M_comp结构域、A2M_N结构域及A2M_N_2结构域等。