微生物实验常用抗生素浓度配制
常用微生物培养基
常用微生物培养基分离真菌：注：抗生素所有培养基灭菌放置不烫手背时（温度约为40°C左右），同时加入氯霉素和链霉至终浓度为0.5 mg/mL（提前配置好，用0.22 µm微孔滤膜过滤，-20℃存储），混匀后倒平板，用于抑制细菌生长。
1.GPY培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母提取物10 g，海盐15 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，pH 7.5，115℃，30 min灭菌2.PDA培养基：Potato Dextrose Agar干粉39 g/L，海盐15 g，蒸馏水1 L，pH 6.5-7.0，121℃，15 min灭菌3.马丁培养基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，磷酸二氢钾1 g，七水合硫酸镁0.5 g，孟加拉红0.03 g，海盐15 g，琼脂20 g，蒸馏水1 L，115℃、30 min灭菌4.MEA培养基：麦芽浸粉17g，蛋白胨3g，海盐15g，蒸馏水1L，121℃，20 min 灭菌5.YPD培养基：酵母提取物10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L，115℃，30 min灭菌6.沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，每升培养基）：蛋白胨（peptone）10.0 g，葡萄糖（glucose）40.0 g，琼脂（agar）15.0 g，pH 4.0 - 6.0；7.酵母汁麦芽提取物琼脂培养基（YM，每升培养基）：麦芽浸粉（malt extract）3.0 g，酪蛋白胨（casein peptone）5.0 g，酵母提取物（yeast extract）3.0 g，葡萄糖（glucose）10.0 g，琼脂（agar）15 g，pH 6.0 - 6.5；8.察氏培养基（CDA，每升培养基）：硝酸钠（NaNO3）3. 0 g，氯化钾（KCl）0.5 g，蔗糖（sucrose）30. 0 g，七水合硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5 g，七水合硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）0. 01 g，磷酸氢二钾（K2HPO4）1.0 g，琼脂（agar）15.0 g，pH 6.0 - 6.5；分离放线菌：注：抗生素所有培养基灭菌放置不烫手背时（温度约为40℃左右），同时加入制霉菌素（终浓度为100.0 μg/ml）和萘啶酮酸（终浓度为25.0 μg/ml）（提前配置好，用0.22µm 微孔滤膜过滤，于-20℃冻存），混匀后倒平板，分别用于抑制真菌和细菌生长。
管碟法
实验2 管碟法测定土霉素生物效价一、目的要求1、了解管碟法测定抗生素生物效价的基本原理。
2、学会管碟法测定抗生素效价方法，并学习抗生素发酵过程一些重要生理生化指标分析。
二、基本原理衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。
抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。
抗生素生物检定法是利用抗生素对细菌（或真菌）的杀死或抑制的程度，作为客观指标来衡量维生素中有效成分的效力的一种方法。
此法检测灵敏性高，由微量抗生素即可检出（0.5u/ml）。
因此，微生物检定法被作测定抗生素效价的一种经典方法。
生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。
管碟法是扩散法的一种。
本实验采用管碟法测定抗生素的效价。
管碟法就是利用有一定体积的不锈钢制的小管（牛津杯），将抗生素溶液装满小杯，在含有敏感试验菌的琼脂培养基上进行扩散渗透，经过一定时间后，抗生素扩散到适当的范围，产生透明的抑菌圈。
抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量(单位)、抗生素的扩散系数(cm2/h)、扩散时间(即抗生素溶液注入钢管至出现抑菌圈所需的时间)、培养基的厚度(mm)和最低抑菌浓度(u/ml)等因素有关。
抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。
因此，抗生素效价可以由抑菌圈的大小来衡量。
将已知效价的土霉素标准液先制成标准曲线，比较已知效价标准液与未知效价的被检品溶液的抑菌圈的大小，就可算出样品中抗生素的效价。
三、实验材料1、培养基（供摊布平板用）蛋白胨6g 酵母膏6g 牛肉膏1.5g 葡萄糖1g 琼脂15—18g蒸馏水1000ml pH:6.8 1.05kg/cm?/SPAN> 121.3?/SPAN>C灭菌20分钟2、菌种：黄色八叠球菌（Sarcina flava）3、土霉素碱标准品4、仪器：玻璃试管、试管架、吸管（1ml,2ml,10ml）、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶（5 00ml）、量筒（250ml,500ml,1000ml）、玻璃棒、温度计、牛津杯、镊子、培养盘、恒温箱、台秤等管碟法测定抗生素效价一、目的和要求1、了解管碟法的原理。
微生物实验培养基配方
微生物实验培养基配方基础培养基配方：1.水：用去离子水或蒸馏水配制培养基。
2.碳源：葡萄糖是最常用的碳源，可提供微生物的能量和碳原子。
浓度通常为0.2-1%。
3.氮源：氨基酸、氨基酸类衍生物、蛋白胨、氨基酸盐等都可以作为氮源。
蛋白胨的浓度通常为0.5-1%。
4.无机盐：常用的无机盐包括NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4等。
它们提供微量元素和维持渗透平衡。
浓度根据不同微生物的要求而变化。
5.辅助物质：维生素、生长因子、酶、抗生素等物质有时会被添加到培养基中以满足微生物特殊的生长需求。
基础培养基通常是通用的，适用于多种微生物的培养和繁殖。
然而，根据不同的微生物，配方中可能会有一些调整和特殊需求。
以下是一些常见微生物群体的基础培养基配方：1.嗜热菌培养基配方：-水：去离子水。
-碳源：葡萄糖（1-2%）。
-氮源：氨基酸、蛋白胨、氨基酸盐。
-无机盐：NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4等。
-辅助物质：维生素、酶等。
2.嗜酸菌培养基配方：-水：蒸馏水。
-碳源：果糖（2-4%）。
-氮源：天门冬氨酸盐、蛋白胨、氨基酸盐。
-无机盐：NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4等。
-辅助物质：维生素、酶等。
3.嗜碱菌培养基配方：-水：去离子水。
-碳源：葡萄糖（1-2%）。
-氮源：氨基酸、蛋白胨、氨基酸盐。
-无机盐：NaCl、KCl、Na2CO3、Na2HPO4、KH2PO4等。
-辅助物质：维生素、酶等。
4.厌氧菌培养基配方：-水：蒸馏水。
-碳源：葡萄糖（1-2%）。
-氮源：氨基酸、蛋白胨、氨基酸盐。
-无机盐：NaCl、KCl、Na2CO3、Na2HPO4、KH2PO4等。
-辅助物质：维生素、酶等。
除了上述配方外，还可以根据实验需求添加抗生素、指示剂等。
抗生素可以抑制细菌、真菌和其他微生物的生长；指示剂则可以用来检测微生物的生长或一些特殊代谢产物的形成。
总之，微生物实验培养基的配方需要根据微生物的类型和特殊需求进行调整，以提供适宜的营养和环境条件，促进微生物的生长和繁殖。
抗生素敏感试验操作规程
抗生素敏感试验操作规程一、抗生素敏感试验原理:抗生素敏感试验是测定抗生素或其它抗微生物制剂在体外抑制细菌生长的能力，通常用扩散法或稀释法。
1、扩散法敏感试验:有抗生素的纸片或药片贴在已接种试验菌的平板上，抗生素浓度梯度通过纸片上的抗生素的弥散作用而形成，距纸片一定范围内试验细菌的生长受到抑制，这种抑制生长与细菌敏感及其他诸因素相关。
2、稀释法敏感试验：为了定量测定抗生素的活性，抗生素与肉汤或琼脂培养基混合进行稀释，然后种入试验细菌，孵育过夜，以最低浓度抑制细菌生长的，称为最低抑菌浓度（MIC），然后将最低抑菌浓度与机体血清或体液中可获得浓度相比较，来确定恰当的临床治疗浓度。
（1）最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration。
MIC）:抗菌药物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度。
单位：μg/ml或U/ml,mg/L。
（2）最低杀菌浓度（minimal bacteriacidal concentration，MBC）:抗菌药物杀灭细菌所需要的最低浓度。
单位：μg/ml或U/ml，mg/L。
（3）MIC90：能抑制90%试验菌株的最低药物浓度，即为该药对被测菌的MIC90。
（4）MIC50：能抑制50%试验菌株的最低药物浓度，即为该药对被测菌的MIC50。
二、抗生素敏感试验的作用：1、指导临床医生对各患者选择最佳抗生素。
2、在一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐药的微生物流行病学资料。
三、抗生素敏感试验的临床意义：1、敏感：表示被测细菌引起的感染，除禁忌症外，可用该抗生素常用剂量而达到治疗的目的。
2、中介：表示被测菌株可通过提高剂量受到抑制，或在药物被生理性浓集的部位受到抑制，由于微小的技术因素失控可以对结果解释错误，所以这一范围只是抑菌环直径介于敏感和耐药之间的“缓冲域”抑菌环落入中介范围，其意义不明确，如果没有其他可以替代的药物，应重复或再以稀释法测定MIC。
3、耐药：被测菌不能被该抗生素的常用剂量在组织内或血液中的浓度达到抑制作用，而且不管其剂量大小或细菌所在部位。
临床微生物学与检验
4.用镊子将E-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表 4.用镊子将E TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表 面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置 面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置 6条，9mm平板只能放置1～2试条 。 条，9mm平板只能放置1 5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。 5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。
第四章 抗菌药物的敏感性试验
徐元宏
常用方法：
纸片扩散法 微量液体稀释法 E-TEST法 TEST法
原理：
纸片扩散法（Kirby纸片扩散法（KirbyBauer法 Bauer法）
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼 脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减 的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试 菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈 即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 浓度10 CFU/ml。 浓度105 CFU/ml。
6.用微量加样器接种100μl 6.用微量加样器接种100μl 到96孔中，盖上盖板。 96孔中，盖上盖板。 同时作阳性、阴性对照。
6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。 6.根据选择的菌株挑选相应的抗菌纸片。
肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/ 肠杆菌科：氨苄西林、阿米卡星、哌拉西林/ 他唑巴坦、头孢噻肟、环丙沙星、亚胺培 南、氨曲南、庆大霉素； 铜绿假单胞菌：头孢他啶、庆大霉素、哌拉西林、 阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南； 阿米卡星、环丙沙星、头孢吡肟、亚胺培南； 葡萄球菌属：头孢西丁、青霉素、红霉素、万古霉 素、环丙沙星、庆大霉素、利福平 ；
微生物实验常用抗生素浓度配制
微⽣物实验常⽤抗⽣素浓度配制微⽣物实验常⽤抗⽣素浓度配制----------四川⼤学⽣命学院-微⽣物代谢与⼯程重点实验室1、氨苄青霉素（[Amp]Ampicillin）（100mg/ml）溶解1g氨苄青霉素钠盐于⾜量的⽔中，最后定容⾄10ml。
分装成⼩份于-20℃贮存。
常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于⽣长培养基。
2、羧苄青霉素（[Car]Carbenicillin）（50mg/ml）溶解0.5g羧苄青霉素⼆钠盐于⾜量的⽔中，最后定容⾄10ml。
分装成⼩份于-20℃贮存。
常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于⽣长培养基。
3、甲氧西林（[Met]Methicillin）（100mg/ml）溶解1g甲氧西林钠于⾜量的⽔中，最后定容⾄10ml。
分装成⼩份于-20℃贮存。
常以37.5ug/ml 终浓度与100ug/ml氨苄青霉素⼀起添加于⽣长培养基。
4、卡那霉素（[Kan]Kanamycin）（10mg/ml）溶解100mg卡那霉素于⾜量的⽔中，最后定容⾄10ml。
分装成⼩份于-20℃贮存。
常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于⽣长培养基。
5、氯霉素（[Cm]Chloramphenicol）（25mg/ml）溶解250mg氯霉素⾜量的⽆⽔⼄醇中，最后定容⾄10ml。
分装成⼩份于-20℃贮存。
常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于⽣长培养基。
6、链霉素（[Str]Streptomycin）（50mg/ml）溶解500mg链霉素硫酸盐于⾜量的⽆⽔⼄醇中，最后定容⾄10ml。
分装成⼩份于-20℃贮存。
常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于⽣长培养基。
7、萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml）溶解50mg萘啶酮酸钠盐于⾜量的⽔中，最后定容⾄10ml。
分装成⼩份于-20℃贮存。
常以15ug/ml 的终浓度添加于⽣长培养基。
8、四环素（[Tet]Tetracyyline）（10mg/ml）溶解100mg四环素盐酸盐于⾜量的⽔中，或者将⽆碱的四环素溶于⽆⽔⼄醇，定容⾄10ml。
微生物学检验(第3版)药物敏感试验
抗生素的种类 一.目的：
四、氨基糖苷类抗生素 按其来源分为：①由链霉菌属发酵滤液提 取获得，有链霉素、卡那霉素、妥布霉素、 核糖霉素、巴龙霉素、新霉素；②由小单 胞菌属发酵滤液中提取，有庆大霉素、福 提霉素；③半合成氨基糖苷类，有阿米卡 星、奈替米星、地贝卡星等。
抗生素的种类 一.目的：
五、喹诺酮类抗生素 第一代为窄谱抗生素，有新恶酸、奈啶 酸和恶喹酸。 第二代为广谱类抗生素，抗菌强度依次 为环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙 星、氟咯沙星、培氟沙星、诺氟 沙星。 第三代为超广谱类抗生素，有司帕沙星、 妥舒沙星、左氟沙星等。
纸片的名称，然后用棉试子蘸取菌液，在试管内
壁轻挤去多余菌液后均匀涂布于整个平板表面3次， 每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂一周。放 置约5分钟后用镊子分别挟取所选择的药敏纸片贴 上。室温放置10分钟左右，恒温箱培养24h。
验操实作
• (4)、MH平板涂布均匀，放置5分钟再贴纸 片，纸片放置应该迅速准确，不得在平板 上拖动纸片，纸片间的距离和位置要均匀。 离平板边缘不小于15mm，两纸片间距离不 小于24mm。
实验原理 1.原理：
实验操作（接种与培养）
• (1)、取待测菌平板，观察菌落形态，涂片镜检， 革兰阴性杆菌做氧化酶试验，革兰阳性球菌做触 决定选择何组、何种药敏纸片。
酶实验。并根据实验结果对该菌株作出初步判断，
药敏试验选择纸片
• 触酶阳性的G＋球菌：青、苯唑、克林、庆大、环
丙沙星、万古、红霉素、头孢唑林 庆大、环丙沙星、万古
(一）苛养菌药敏试验抗生素的选用
A组一级试验并常规报告的抗微生物药 , 如肺炎链球菌用红霉素和青霉素。 B组一级试验有选择报告的抗微生物药 , 如肺炎链球菌用头孢噻肟或头孢曲松 。 C组补充试验有选择报告的抗微生物药， 如肺炎链球菌用头孢呋辛 。
普通使用的抗生素的贮液和工作液浓度
普通使用的抗生素的贮液和工作液浓度下面的内容摘自《分子克隆》第三版附录2①以水为溶剂的抗生素贮存液应用0.22 μm滤器过滤除菌；②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌；③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。
注意：镁离子是四环素的拮抗剂。
对于以四环素为筛选抗性的细菌，应使用不含镁离子的培养基，如LB培养基。
下面是常用抗生素的贮液浓度及工作浓度氨苄青霉素贮液浓度 50 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 20 μg/ml （严紧型质粒） 60 μg/ml （松弛型质粒）羧苄青霉素贮液浓度 50 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 20 μg/ml （严紧型质粒） 60 μg/ml （松弛型质粒）氯霉素贮液浓度 34 mg/ml 溶于乙醇 -20℃保存工作浓度 25 μg/ml （严紧型质粒） 170 μg/ml （松弛型质粒）卡那霉素贮液浓度 10 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 10 μg/ml （严紧型质粒） 50 μg/ml （松弛型质粒）链霉素贮液浓度 50 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 10 μg/ml （严紧型质粒） 50 μg/ml （松弛型质粒）四环素贮液浓度 5 mg/ml 溶于乙醇 -20℃保存工作浓度 10 μg/ml （严紧型质粒） 50 μg/ml （松弛型质粒）利福平，Rifampicin (INN) 简写为Rif。
分子式：C43H58N4O12，相对分子质量为822.94022 [g/mol]。
化学名 3-[[(4-甲基-1-哌嗪基)亚氨基]甲基]-利福霉素利福平是一种半人工合成的抗生素，最初从地中海氏拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis mediterranei）中获得。
利福平为利福霉素类半合成广谱抗菌药，对多种病原微生物均有抗菌活性。
该药对结核分枝杆菌和部分非结核分枝杆菌（包括麻风分枝杆菌等）在宿主细胞内外均有明显的杀菌作用。
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微生物实验常用抗生素浓度配制
----------四川大学生命学院-微生物代谢与工程重点实验室
1、氨苄青霉素（[Amp]Ampicillin）（100mg/ml）
溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
2、羧苄青霉素（[Car]Carbenicillin）（50mg/ml）
溶解0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
3、甲氧西林（[Met]Methicillin）（100mg/ml）
溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以37.5ug/ml 终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。
4、卡那霉素（[Kan]Kanamycin）（10mg/ml）
溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
5、氯霉素（[Cm]Chloramphenicol）（25mg/ml）
溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
6、链霉素（[Str]Streptomycin）（50mg/ml）
溶解500mg链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
7、萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml）
溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以15ug/ml 的终浓度添加于生长培养基。
8、四环素（[Tet]Tetracyyline）（10mg/ml）
溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。
分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。
常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
9、庆大霉素（[Gm]Gentamicin）（50mg/ml）
溶解500mg硫酸庆大霉素于足量的去离子水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。