抗生素筛选浓度
G418详细信息
•保存于运输说明：•2-8℃•详细信息：•G418 sulfate (Geneticin) 现货供应说明：真核表达筛选用抗生素，可以用于筛选表达特定抗性基因的稳定细胞株。
筛选哺乳动物细胞，推荐起始筛选浓度为400微克/毫升；筛选植物细胞，推荐起始筛选浓度为10微克/毫升；筛选酵母，推荐起始浓度为500微克/毫升。
根据起始浓度的效果可以再适当升高或降低G-418的使用浓度。
分子式：C20H40N4O10·2H2SO4分子量：692.71CAS＃：108321-42-2外观：白色粉末特性：溶解性：可溶于水、甲醇、缓冲液和培养基。
溶解后，0.22μm过滤除菌，分成小包装，4℃可保存12个月，-20℃保存时间更长。
最常用的储存液使用100mM HEPES(pH7.3)配制，浓度为50mg/ml。
使用HEPES配制的好处是：加入储存液不会改变培养体系的pH值。
储存条件：2-8℃Ordering InformationDescription Quantity Price(RMB)Cat. no.产地G418 sulfate 1g45011811-023 Invitrogen 5g200011811-023 Invitrogen其他公司产品：G418溶液的配制配的时候就是用配好的HEPES溶G418，然后过滤，不用高压灭菌了，配好后分装，-20度保存，用的时候取一管放4度。
100mM HEPES（pH7.3）缓冲液（500ml）ddH2O 490mlNacl 4gNa2HPO4-12H2O 0.1357gKcl 0.185gGlu 0.5gHEPES 2.5g用氢氧化钠调PH至7.3 ，定容至500mlG418贮存液（50mg/ml）的配制以下为细胞筛选的常用步骤：仅仅作为参考1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。
2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。
稳转株：G418浓度确定到单克隆化鉴定
稳定转染攻略：从G418浓度确定到单克隆化鉴定摘要: 一、筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和一、筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3′磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%。
4、G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
二、加药时间和维持浓度：1、由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
抗生素的配制
抗生素的配制储存液工作浓度(mg/ml)保存条件严紧型质粒(ug/ml)松驰型质粒(ug/ml)氨苄青霉素50(溶于水) -20℃20 60羧苄青霉素50(溶于水) -20℃20 60氯霉素34(溶于乙醇) -20℃25 170卡那霉素10(溶于水) -20℃10 50链霉素10(溶于水) -20℃10 50四环素5(溶于甲醇) -20℃10 50常用抗生素溶液抗生素贮存液a工作浓度浓度保存条件严紧型质粒松弛型质粒氨苄青霉素50mg/ml(溶于水)-20℃20μg/ml60μg/ml羧苄青霉素50mg/ml(溶于水)-20℃20μg/ml60μg/ml氯霉素34mg/ml(溶于乙醇)-20℃25μg/ml170μg/ml卡那霉素10mg/ml(溶于水)-20℃10μg/ml50μg/ml链霉素10mg/ml(溶于水)-20℃10μg/ml50μg/ml四环素b5mg/ml(溶于乙醇)-20℃10μg/ml50μg/mlDocument number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UTa：以水为溶剂的抗生素贮存液通过μm滤器过滤除菌。
以乙醇为溶剂的抗生素溶液无须除菌处理。
所有抗生素溶液均应放于不透光的容器保存。
b：镁离子是四环素的拮抗剂，四环素抗性菌的筛选应使用不含镁盐的培养基（如LB培养基）。
常用抗生素氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml）溶解羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。
分装成小份于-20℃贮存。
常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
甲氧西林（methicillin）（100mg/ml）溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。
慢病毒介导SiRNA沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳MOI值及筛选抗生素浓度
慢病毒介导SiRNA沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳MOI值及筛选抗生素浓度金小花;秦高【摘要】目的：探究慢病毒介导RNAi沉默SGMS2基因的单克隆细胞系构建中最佳感染复数（ multiplicity of infection，MOI）及BSD基因筛选抗生素（ blasticidin）浓度。
方法荧光标记小鼠SGMS2干扰阴性对照慢病毒并按照MOI值0、10、30、60、120（ TU number／cell）分别侵染INS-1空白细胞，培养72 h后使用荧光显微镜拍照并计算细胞的荧光比率（％）及死亡率（％），以确定最佳MOI值。
小鼠胰岛素瘤INS-1空白细胞中加入0、1、2、3μg／mL blasticidin，第7天时采用MTT法检测细胞的死亡率，以确定细胞抗生素敏感浓度。
使用SGMS2干扰阴性对照慢病毒及SGMS2干扰慢病毒（病毒滴度：1×108 TU／mL）按照最佳MOI值侵染细胞，并用blasticidin敏感浓度进行阳性细胞筛选，获得混合系细胞。
当细胞的荧光率达90％时，进行单克隆稳转细胞系的构建。
结果最佳MOI值为60，此时细胞的荧光率达100％，但细胞的死亡率＜0.5％，细胞保持原有的形态。
当blasticidin敏感浓度为2μg／mL，此时空白细胞失去原有的贴壁性，全部死亡。
INS-1-SEMS2细胞第2次检测的Ct值28.21大于第1次检测的Ct值27.58，且siRNA的干扰效率为77.78％，siRNA 成功表达，混合稳转细胞系构建成功。
成功构建小鼠胰岛素瘤INS-1-SEMS2单克隆细胞系。
结论慢病毒介导RNAi沉默基因SGMS2的单克隆细胞系构建成功。
%Objective To optimize multiplicity of infection ( MOI) and antibiotics ( blasticidin) concentration selecting BSD gene in construction of monoclonal stable cell line by lentivirus vector-mediated RNA interence silenced gene SGMS2.Methods The INS-1 cells were transfected byfluorescence labeled negative control SGMS2-siRNA lentivirus at MOI of 0, 10, 30, 60 and 120 TU number/cell.The cells were photographed under fluorescent microscopy after 72 h cultivation, then fluorescence ratio and apoptosis rate were calculated to determine optimal MOI.The INS-1 cells were treated by blasticidin with different concentrations of 0, 1, 2, and 3 μg/mL, and the apoptosis rate was observed to acquire optimal concentration of antibiotics.The INS-1 cells were transfected by negative control SGMS2-siRNA lentivirus and SGMS2-siRNA lentivirus (virus titer:1 ×108TU/mL) at optimal MOI and positive-transfected cells were selected by blasticidin at optimal concentration, then mixed cell lines were acquired.The monoclonal cell line was constructed at fluorescence ratio of 90%.Results The optimal MOI was 60 with 100% fluorescence ratio, less than 0.5% apoptosis rate and keep original cellular morphology.The optimal concentration of blasticidin was 2 μg/mL with cell adherence disappear and all cells apoptosis.The Ct value of INS-1-SEMS2 cells detected at the second time was 28.21, which was greater than 27.58 at the first time.The interfering efficiency of siRNA was 77.78% which indicated a successful expression of siRNA and construction of monoclonal stable cell line ( INS-1-SEMS2 ).Conclusion The monoclonal stable cell line was successfully constructed by lentivirus vector-mediated RNA interence silenced gene SGMS2.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2015(000)009【总页数】4页(P51-53,56)【关键词】小鼠胰岛素瘤INS-1细胞;感染复数;BSD基因筛选抗生素;细胞稳转株【作者】金小花;秦高【作者单位】苏州农业职业技术学院食品科学系化学与生物技术教研室，苏州215008;上海诺百生物科技有限公司，上海 200233【正文语种】中文【中图分类】Q78在动物细胞学和分子学试验中，将外源目的基因通过病毒介质转入动物细胞中，是一个非常重要的试验步骤[1]。
g418筛选细胞原理
g418筛选细胞原理一、引言在生物学研究中，细胞是一个非常重要的研究对象。
为了更好地理解细胞的功能和特性，科学家们经常需要筛选出特定类型的细胞。
本文将重点介绍一种常用的细胞筛选方法，即使用g418进行筛选的原理。
二、g418的作用机制g418是一种广谱抗生素，属于氨基糖苷类抗生素，常用于细胞筛选和基因转染实验。
它能够抑制细菌和真菌的生长，同时对哺乳动物细胞具有选择性毒性。
g418的作用机制主要是通过抑制细胞内的蛋白质合成而起作用。
三、g418筛选细胞的原理g418筛选细胞的原理是利用细胞对g418的敏感性来筛选出特定类型的细胞。
在细胞培养基中加入一定浓度的g418，只有对g418敏感的细胞才能够存活下来，而对g418不敏感的细胞则会死亡。
因此，通过调整g418的浓度，可以选择性地杀死或保留特定类型的细胞。
四、g418筛选细胞的步骤1. 准备细胞培养基：在培养基中添加适量的g418，使其浓度达到所需浓度；2. 培养细胞：将待筛选的细胞加入带有g418的培养基中，进行培养；3. 观察细胞生长：观察细胞在带有g418的培养基中的生长情况。
对于对g418敏感的细胞，它们将在培养基中存活和繁殖；而对g418不敏感的细胞，则会死亡或生长缓慢；4. 筛选细胞：根据细胞的生长情况，筛选出对g418敏感的细胞。
五、g418筛选细胞的注意事项1. g418的浓度要根据具体实验目的进行调整，过低的浓度可能无法有效筛选出特定细胞，而过高的浓度可能对所有细胞都具有毒性；2. g418的作用时间也需要根据实验目的进行调整，通常需要持续培养一段时间才能筛选出对g418敏感的细胞；3. 在筛选细胞的过程中，需要定期观察细胞的生长情况，及时调整培养基中的g418浓度，以保证细胞的生长和筛选效果。
六、g418筛选细胞的应用g418筛选细胞的方法在生物学研究中得到了广泛应用。
例如，在基因转染实验中，可以利用g418筛选出成功转染的细胞，以便进行后续的功能研究；在细胞分离和纯化实验中，也可以利用g418筛选出特定类型的细胞，以便进一步研究其特性和功能。
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
稳定细胞株筛选药物浓度确定方法
在使用G418、潮霉素B或嘌呤霉素筛选稳定细胞系细胞之前，需要先通过梯度实验确定适合该类细胞的最佳药物浓度。
对于一些常见的细胞系，通常可以在资料中找到推荐的药物浓度。
例如Hela细胞用400 μg/ml的G41或1 μg/ml的嘌呤霉素进行稳定细胞株筛选。
用G418或潮霉素B，选用在5天左右出现细胞大批死亡，2周全部死亡的浓度作为筛选浓度。
对于嘌呤霉素,通常采用在3-4天杀死全部细胞的浓度。
不同批次的药物活性有一定差异。
因此在使用新批次药物时，需要重新测定最佳浓度。
筛选抗生素的推荐使用浓度（μg/ml）
抗生素工作范围筛选浓度维持用量
G418 50-800 400-500 100
Hygromycin 50-800 200 100
Puromycin 0.25-2 0.5-10 0.25
1、在加入筛选药物前一天将细胞以50%密度接种到6孔板。
第二天在培养基中按G418(0,50,1000,200,400,800μg/ml)或者嘌呤霉素（0,1,2.5,5,7.5,10μg/ml）加入。
2、用G418筛选处理5-10天。
每2天观察细胞一次。
每4天跟换新的有抗生素的培养基（如果有必要可以更换得更勤）。
直到得到最佳浓度。
3、用嘌呤霉素处理4-7天。
每2天跟换新的有抗生素的培养基。
普通使用的抗生素的贮液和工作液浓度
普通使用的抗生素的贮液和工作液浓度下面的内容摘自《分子克隆》第三版附录2①以水为溶剂的抗生素贮存液应用0.22 μm滤器过滤除菌；②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌；③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。
注意：镁离子是四环素的拮抗剂。
对于以四环素为筛选抗性的细菌，应使用不含镁离子的培养基，如LB培养基。
下面是常用抗生素的贮液浓度及工作浓度氨苄青霉素贮液浓度 50 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 20 μg/ml （严紧型质粒） 60 μg/ml （松弛型质粒）羧苄青霉素贮液浓度 50 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 20 μg/ml （严紧型质粒） 60 μg/ml （松弛型质粒）氯霉素贮液浓度 34 mg/ml 溶于乙醇 -20℃保存工作浓度 25 μg/ml （严紧型质粒） 170 μg/ml （松弛型质粒）卡那霉素贮液浓度 10 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 10 μg/ml （严紧型质粒） 50 μg/ml （松弛型质粒）链霉素贮液浓度 50 mg/ml 溶于水 -20℃保存工作浓度 10 μg/ml （严紧型质粒） 50 μg/ml （松弛型质粒）四环素贮液浓度 5 mg/ml 溶于乙醇 -20℃保存工作浓度 10 μg/ml （严紧型质粒） 50 μg/ml （松弛型质粒）利福平，Rifampicin (INN) 简写为Rif。
分子式：C43H58N4O12，相对分子质量为822.94022 [g/mol]。
化学名 3-[[(4-甲基-1-哌嗪基)亚氨基]甲基]-利福霉素利福平是一种半人工合成的抗生素，最初从地中海氏拟无枝菌酸菌（Amycolatopsis mediterranei）中获得。
利福平为利福霉素类半合成广谱抗菌药，对多种病原微生物均有抗菌活性。
该药对结核分枝杆菌和部分非结核分枝杆菌（包括麻风分枝杆菌等）在宿主细胞内外均有明显的杀菌作用。
嘌呤霉素筛选浓度 (2)
未知驱动探索，专注成就专业
嘌呤霉素筛选浓度
嘌呤霉素（Puromycin）是一种常用的抗生素，可用于筛选经过质粒转染的细胞中是否有成功表达了融合蛋白或其他感兴趣的基因。
嘌呤霉素的浓度应根据具体实验的需求和细胞的特性来进行确定。
一般来说，嘌呤霉素的浓度可以在0.5-10 μg/ml范围内进行筛选。
初始筛选通常使用较高浓度（如2-10 μg/ml），以确保只有成功表达了目标基因的细胞能够存活下来。
随后，可以逐渐降低嘌呤霉素的浓度，以获得高达100%的筛选效率。
在实验过程中，可以通过处理并荧光显微镜观察细胞的存活情况，或者进行细胞增殖和生存率的测定，从而确定最佳的嘌呤霉素筛选浓度。
实验者也可以参考文献或嘌呤霉素的使用说明来选择适当的浓度。
1。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
①以水为溶剂的抗生素贮存液应用0.22卩山滤器过滤除菌；
②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌；
③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。
注意：镁离子是四环素的拮抗剂。
对于以四环素为筛选抗性的细菌，应使用不含镁离子的培养基，如LB 培养基。
下面是常用抗生素的贮液浓度及工作浓度
氨苄青霉素：贮液浓度50 mg/ml溶于水-20 C保存工作浓度20卩g/ml （严紧型质粒）60卩g/ml （松弛型质粒）
羧苄青霉素：贮液浓度50 mg/ml溶于水-20 C保存工作浓度20卩g/ml （严紧型质粒）60卩g/ml （松弛型质粒）
氯霉素：贮液浓度34 mg/ml溶于乙醇-20 C保存工作浓度25
卩g/ml （严紧型质粒）170卩g/ml （松弛型质粒）
卡那霉素：贮液浓度10 mg/ml溶于水-20 C保存工作浓度10
卩g/ml （严紧型质粒）50卩g/ml （松弛型质粒）
链霉素：贮液浓度50 mg/ml溶于水-20 C保存工作浓度10
卩g/ml （严紧型质粒）50卩g/ml （松弛型质粒）
四环素：贮液浓度5 mg/ml溶于乙醇-20 C保存工作浓度10
卩g/ml （严紧型质粒）50卩g/ml （松弛型质粒）质粒类型：。