第四章 核酸序列分析-1.
核酸序列分析
第4章核酸序列分析了解：1.DNA携带的两类遗传信息。
2.DNA与RNA序列分析的常见内容及相关数据库和工具。
3.ORF与CDS的区别。
4.原核基因和真核基因启动子的结构。
5.原核和真核的基因结构。
6.lncRNA的研究现状。
熟悉：1.限制性核酸内切酶的命名规则，II型限制酶的特点。
2.重复序列依重复次数和组织形式的分类。
3.基因识别的三大类方法。
4.miRNA及其靶基因预测的方法和工具。
掌握：1.CpG岛的概念及其识别依据和判别标准。
2.mRNA选择性剪接的产生机制。
3.解决问题的思路。
4.查找数据库和分析工具的方法。
5.学习数据库与分析工具使用方法的策略。
4.1引言“龙生龙，凤生凤，老鼠的儿子会打洞！”1“种瓜得瓜，种豆得豆。
”“爹矬矬一个，娘矬矬一窝。
”“一母生九子，连母十个样。
”“龙生九子各不同。
”“天下乌鸦一般黑。
”这些都是大家耳熟能详的谚语。
不管是天上飞的、地上跑的、水里游的，还是能动的、不能动的，它们的后代都和它们非常相像，但却也会有少许的差异。
这些现象大家都已司空见惯，所以可能没有啥感觉。
但仔细想想，你就会发现大自然的奇妙所在。
当然，对于生物专业的人来说，这个就没什么奇怪的了，因为我们都知道分子生物学的中心法则（The central dogma of molecular biology）：DNA转录成RNA，RNA翻译成蛋白质。
蛋白质执行特定的生物功能从而决定最终的表型，而DNA则携带着最原始的决定个体性状的遗传信息，RNA主要参与遗传信息的表达和调控。
在各种生物中，A、C、G、T/U都是构成DNA和RNA核酸序列的基本组分。
仅仅这么四种碱基怎么可能构建出缤纷多彩的大千世界呢？其秘诀就在于四种核苷酸的排列顺序。
就像搭积木一样，通过不同的排列组合我们可以构建出不同的形状。
类似于二进制中运用一连串的0和1以及英文字母表中运用26个不同的字母来表达信息，基因所包含的信息来自于4中不同核苷酸沿DNA 分子的排列顺序。
核酸序列分析
思考题
1.第一代DNA测序技术的核心技术 A.Sanger的双脱氧链终止法 B.Maxam和Gilbert的化学降解法 C.荧光标记技术 D.PCR技术 E.DNA自动分析技术
2. Sanger双脱氧链终止法使用的链终止物
A. NTP
B. dNTP
C. ddNTP
D. a-32P-dNTP E. a-35S-dNTP
• 反应体系中包含：模板 DNA,
Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测 序引物；
• 反应过程：
变性－复性－延伸－终止
双脱氧链终止法基本原理：
➢利用DNA聚合酶不能
够区分dNTP和ddNTP的
特性，使ddNTP参入到
寡核苷酸链的3’-末端。
因为ddNTP 3’不是-OH，
不能与下一个核苷酸聚
合延伸，从而终止DNA 链的增长。
目前，应用最广泛的应用生物系统公司(applied biosystems ，ABI)3730系列自动测序仪即是基于毛细管 电泳和荧光标记技术的DNA测序仪。
如ABI3730XL测序仪拥有96道毛细管，4种双脱氧核 苷酸的碱基分别用不同的荧光标记，在通过毛细管时不同长 度的DNA片段上的4种荧光基团被激光激发，发出不同颜色 的荧光，被CCD检测系统识别，并直接翻译成DNA序列。
2011：5000美元测定一个人类基因组 2014：上万元测定一个人类基因组
未来目标：1000/100 美元测定一个人类基因组
1、第一代DNA测序技术
第一代DNA测序技术： 传统的双脱氧链终止法、化学降解法以及在它们的基
础上发展来的各种DNA测序技术。
第一代DNA测序技术包括：双脱氧链终止法、化学降 解法、荧光自动测序技术。
4章-核酸序列分析报告
检测序列、目标序列
• 检测序列（查询序列）：新测定的，希望 通过数据库搜索确定其性质或功能的序列
• 目标序列: 通过数据库搜索得到的和检测 序列具有一定相似性的序列
序列比对基本类型
• 两两比对：蛋白质序列之间 核酸序列之间
• 多序列比对：多个蛋白质或核酸同时比较
常用的序列比对工具BLAST、Clustal X
• 推测结构功能及进化上的联系，是基因识 别，分子进化，生命起源研究的基础。
• 序列
结构
功能
• 序列比对理论基础：进化学说 如果两个序列之间具有足够的相似性，
就推测二者可能有共同的进化祖先，经过序列 内残基的替换、残基或序列片段的缺失、以及 序列重组等遗传变异过程分别演化而来。
序列比较的基本操作是比对， 两条序列中 各个字符的一种对应关系，或字符对比排列。
任务
寻找VPI 10463 标准株毒素B的编码序列（X53138）。 利用DNASTAR 寻找毒素B基因的开放阅读框 寻找CDB3区（氨基酸 1751- 2366）的编码序列 采用实验室仅有的Pgex-4t-1质粒载体进行表达，请选择合适的限 制性内切酶设计引物
4.2 序列比对
为什么要序列比对
• 序列比对又叫序列联配 , 对排 核酸、氨基酸序Biblioteka 的相似性第四章 核酸序列分析
4.1 常规分析
核酸序列的常规分析包括核酸序列的检索,核酸 序列组分分析,序列变换,限制性酶切分析等等
4.1.1 核酸序列的检索
在相关序列数据库中,选择合适的查询方法检索某 个物种的核酸序列信息.如使用NCBI的Entrez查询系 统和EMBL的SRS查询系统
4.1.2 核酸序列组分分析
比对过程中需要在检测序列或目标序列中 引入空位，表示插入或删除
核酸序列分析泛讲
基因结构分析 （1）原核基因结构
• 原核生物基因组小，基因密度高，很少存在重复序列， 一个基因是由编码一个蛋白质或RNA的开封阅读框构成， 中间没有间断。 • 细菌的起始密码子为: ATG, GTG, TTG • 核糖体结合位点(Shine-Delgaron sequence) • 终止密码子较容易确定 • 转录终止子 • 密码子偏好性 翻译终止位点
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名称
TATA框 （TATA box）
CAAT框 （CAAT box）
GC框 （GC box）
转 录 起 始 点 上 游 位于转录起始点上 有 两 个 拷 贝 ， 所处位 约19～27bp处 游70～80bp 分别位于 CAAT 置 框的两侧 组成 TATA(A/T)A(A/T) GG(T/C)CAATCT GGCGGG
密码子使用频度
不同生物对密码子的使用有不同的偏好，在编码区和非编码 区，特定氨基酸密码子的出现频率是不同的，因而蛋白质编 码区密码存在一定的规则性。 CodonW /
2、 内含子/外显子分析
对基因组序列的读码框区域进行预测
内含子5’端供体位点(donor splice site): GT 内含子3’端受体位点(acceptor splice site): AG
mRNA
GC区
增强子
CAAT区
TATAAT
PyAPy
上游启动子元件，UPE
核心启动子元件
转录起始 位点
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转录终止信号
加polyA信号：AAUAAA
mRNA前体 5’ AAUAAA CA GU 3’
成熟mRNA
5’
AAUAAA
CAAAAAAAAAAAAA
3’
转录终止信号：GC rich二重对称区、UUUUUU
生物信息学第四章
第四章应用GCG进行序列分析Barbara A. ButlerGenetics Computer Group. IncOxford Molecular GroupMadison. Wisconsin一、引言快速、经济的核酸序列测序方式的出现使包括分子生物学、遗传学和生物化学在内的许多科学领域发生了革命。
（Gilbert, 1981; Sanger, 1981)。
这项技术的进展同时也令人们需要构建公用数据库来存储在全世界范围的实验室内取得的序列信息（Benson et al., 1997; Stoesser et al., 1997）。
由于提交到数据库中的序列需要进行分析和解释，同时已经存在的数据库中的条款需要进行辨识和修补以供研究人员进一步研究之用，因此随着公用数据库的成立，生物信息学和计算生物学逐渐走向成熟。
生物信息学可被视为为对生物信息，专门是对核酸和蛋白质序列信息的获取、分析和存储。
而计算生物学则是指为实现上述目的进行的相应算法和运算机应用程序的开发。
近十年来全基因组测序计划中积累的大量数据使这两个领域都有了飞速的进展，从商业的、学术的各类来源出现了许多可用于序列分析和数据库搜索的程序。
用于个人运算机和Macintoshe机的软件包，专门是可供多用户利用的软件包通常比较昂贵，而且可能缺少用于分析和编辑的综合性的程序组。
与商业程序相较，那些公用的能独立运行的程序（即此程序不是作为软件包的一部份而能够独立运行）很廉价，但需要下载有时乃至要在本机上进行编译，而且用户还必需熟悉输入序列的格式和学习如何使程序有效地运行。
虽然此刻通过网络利用选定的程序已经成为可能，但如果是分析需要综合多个程序则难以进行。
例如，研究者能够利用某种软件进行数据库搜索但却无法进一步将搜索到的序列进行对比。
一样，要创建一个序列对比然后再进行编辑也是很困难的。
这一章中介绍了一种集成环境，它将大量序列分析和数据库搜索程序集成在一路，而且能够访问各类来源的序列数据。
核酸序列分析
琼脂糖凝胶电泳
在PH3.5时，碱基上的氨基基团解离， PH3.5时 碱基上的氨基基团解离， 而三个磷酸基团只有一个解离， 而三个磷酸基团只有一个解离，整个核 酸分子带正电荷。 酸分子带正电荷。 PH值为8.0-8.3时 碱基几乎不解离， 值为8.0 在PH值为8.0-8.3时，碱基几乎不解离， 磷酸全部解离，核酸分子带负电荷。 磷酸全部解离，核酸分子带负电荷。若 将由PH8.0 PH8.0电泳缓冲液制成的凝胶置于电 将由PH8.0电泳缓冲液制成的凝胶置于电 场中， 场中，核酸分子由于带负电会向正极泳 动。
Maxam-Gibert
，
化学修饰法测定 DNA序列的原理
，
5 -GATCACTACTG-3
，
5 -GATCACTACTG-3
，
G
G+A
C+T
C
G
G+A
T+C
C
DNA测序自动化和大规模测序
双脱氧法和化学修饰法的缺点： 双脱氧法和化学修饰法的缺点： 放射性 操作步骤烦琐 效率低 读片过程慢
激光测序法 通过ddNTP 随机竞争终止新合成DNA DNA的互 通过ddNTP 随机竞争终止新合成DNA的互 补链。 补链。 引物标记系统： 引物标记系统： 四种不同的荧光染料标 记引物。 记引物。 终止标记系统： 终止标记系统：4种不同的荧光染料标记 四种双脱氧核糖核酸
：
大片段DNA 大片段DNA 序列测定的策略
鸟枪法 互套式缺失法 引物延伸法
第四章核酸序列分析
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精品PPT
影响(yǐngxiǎng)相似性分数的因素
WORD SIZE 的设定 是否(shìfǒu)允许空位且空位罚分策略
相似性分数矩阵（PAM和BLOSUM）
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精品PPT
点阵图
评估两条序列相似度最简单的方法之一是利用点阵图。 第一条被比较(bǐjiào)的序列排列在点阵图空间的横轴， 第二条序列则排列在纵轴。点阵空间中两条序列中的残基 相同时，在对应的位点上画上圆点，两条序列间连续相同 的区域在图中会形成由圆点组成的上斜线。
核酸序列组分分析（BioEdit、DNAMAN、 Dnastar） 分析核酸序列的分子质量、碱基组成、碱基分布等。
序列变换(BioEdit、DNAMAN 、 Dnastar）
根据分析需要，对核酸序列进行(jìnxíng)各种变换， 如寻找序列的互补序列、反向序列、反向互补序列等。
限制性内切酶分析(BioEdit、DNAMAN 、 Dnastar）
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精品PPT
具有(jùyǒu)连续相似区域的 两条DNA序列的简单点阵图
精品PPT
对人类与黑猩猩的β球蛋白基因序 列(xùliè)进行比较的完整点阵图
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滑动窗口技术
使用滑动窗口代替一次一个位点的比较是解决噪音 问题的有效方法。
假设窗口大小(dàxiǎo)为10，相似度阈值为8，则每 次比较取10个连续的字符，如相同的字符超过8个， 则标记
假设两条序列长度分别是12和9 假设这两条序列是真正的同源序列，那么它们之间长度的
差异可以解释为 (1)较长的序列有核苷酸的插入，或者 (2) 较短的序列发生了核苷酸的删除，或者(3) 两者都发 生了。 在不知道(zhī dào)原始父辈序列的情况下，无法判断导 致空位的原因是由于一条序列的插入事件还是另一条的删 除事件，通常把这类事件称为插入/删除事件。
核酸序列分析
核酸序列分析在生物学领域中，核酸序列分析是一项重要的研究工具，它可以帮助科学家们理解生物体内的基因组结构和功能。
通过分析核酸序列，我们可以揭示基因的组合方式、基因在不同物种之间的演化关系以及基因与疾病之间的关联。
本文将介绍核酸序列分析的基本步骤和常用方法，并探讨它在生物研究中的应用。
一、核酸序列分析的基本步骤1. 数据收集与清洗：首先，我们需要获取相关的核酸序列数据。
这些数据可以来自于公共数据库（如GenBank、ENSEMBL等）或实验室内部的测序项目。
收集到的数据可能存在噪声或错误，所以我们需要对数据进行清洗和筛选，以保证分析的准确性。
2. 序列比对：接下来，我们需要将不同样本的核酸序列进行比对。
序列比对是核酸序列分析的核心步骤之一，它可以帮助我们发现序列之间的相似性和差异性。
常用的序列比对算法包括Smith-Waterman算法和Needleman-Wunsch算法等。
3. 序列注释：在比对完成后，我们可以根据已知的功能注释信息来对序列进行注释。
注释可以告诉我们该序列可能的编码蛋白质的功能、寻找潜在的基因等。
4. 比对结果分析：通过分析比对结果，我们可以了解到序列的保守区域和变异区域。
保守区域可能是功能区域，例如编码蛋白质的区域，变异区域可能涉及到物种之间的进化差异或突变相关的功能。
5. 结果可视化：最后，我们需要将分析的结果进行可视化呈现。
通过可视化，我们可以更直观地理解数据，并对进一步实验设计或研究方向提出建议。
二、核酸序列分析的常用方法1. 比对工具：常用的核酸序列比对工具包括BLAST、ClustalW和MAFFT等。
BLAST（基本局部比对序列工具）是一种快速的局部比对算法，它能够快速地找到序列之间的相似性。
ClustalW和MAFFT则更适用于多序列比对，它们可以比较多个序列之间的相似性和差异性。
2. 注释工具：常用的核酸序列注释工具包括NCBI的Entrez、ENSEMBL和UniProt等。
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1）对于已知蛋白，可进行数据库搜索判断序列的可靠性。 2）对于未知新基因，则需要参考序列的其他特定信息。
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许多程序对DNA序列一次进行全部6个阅读框的翻译。
程序之一：EBI著名软件包EMBOSS中的Transeq
/emboss/transeq/
特点： 1）输入序列可以是原始序列，也可以是GCG，Fasta， EMBL，GenBank，PIR等格式。 2）可一次翻译成1条，同向3条，双向6条蛋白质序列。 3）翻译时可选择标准密码子或其他类型的密码子
4 具有复杂的基因转录调控方式
5 具有丰富的可变剪接 6 有明显的CpG岛、密码子使用具有偏好性
四、DNA序列分析基本内容
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序列一般性分析 基因识别与鉴定
非编码区分析及调控元件识别
§4.2 DNA序列的一般分析
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重要分析工具网站
华北制药集团的谈杰创建的一个非常有用的生 物信息学资源网站。 /index.html
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Transeq主页
翻译结果（6框架）
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程序之二： ExPASy的Translate Tool /tools/dna.html 特点： 1）程序简单，没有太多的可选项，运行速度快。
2）一次翻译双向6条蛋白质序列。
3）输出结果较Transeq清楚，不仅将终止密码子用 Stop英文单词表示，还将起始密码子以MET标记出来
国外主要网站 http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py/ /Tools/index.html /
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各种生 物信息 学软件
法国巴斯德研究所：http://mobyle.pasteur.fr/cgibin/portal.py#forms::revseq
Oligo Calculator , /JaMBW/
17 JaMBW是一个分子生物学软件包，功能包括：序列格式 转换、求序列的补体序列与逆序列、将DNA序列翻译成 蛋白序列、序列分析、 多序列比较、特征位点查找、3维 分子结构查看、PCR引物设计、缓冲液设计等功能，包 含了分子生物学研究常用的一些操作。JaMBW是一个非 常出色的工具软件。
以JaMBW 的Oligo Calculator为例演示
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计算结果：
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二、序列转换 序列转换是分子生物学和生物信息学研究中最常遇到的工 作之一，因此，掌握序列转换的常用方法是分子生物学家
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和生物信息学家的基本要求。
序列转换主要包括两方面的工作： 1）序列格式转换
2）互补与反向序列格式转换
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1 序列格式转换
ReadSeq是目前最流行的格式处理软件之一。是美国印 第安那大学的Don Gilbert开发编制的。 支持23种序列格式的转换，几乎囊括了目前所有的一 级序列格式。
/molbio/readseq/
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选择输出 格式
24 EMBL格式
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序列分析其实就是从已知蛋白质、RNA、
DNA序列作出生物学推论的过程。
4
主要内容 §4.1 引言 §4.2 序列的一般分析 §4.3 基因预测与鉴定 §4.4 非编码区分析与调控元件识别
§4.1 引 言
一、DNA序列分析的意义
6
ห้องสมุดไป่ตู้
DNA序列分析是生物信息学中的重要内容之一
1. DNA是生物遗传信息的最终决定者
序列格式说明： １）序列标准格式 >XX(不能少）
2）序列长度少于18bp时一 定要用标准格式
3）序列长度大于18bp时， “>XX”可省去。
YYYYYYYYYYYYYYY
2 互补与反向序列格式转换 RevSeq程序是一款专门将序列进行反向和互 补转换的小工具。 个头虽小，但很实用。它是著名的生物信息 学软件包EMBOSS的一个成员。
第四章 DNA序列分析
回顾
1 如何查询下列文献：Wan, Y. and Lemaux, P.G.. Generation of large numbers of independently transformed fertile barley plants. Plant Physiol. 1994 ,104: 37–48. 2上次上机操作内容简要说明。
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http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?form=revseq
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粘贴序列
上传序列文件
1）反向链 2）互补链 3）反向互补链
改变文件名
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要求填写E-mail地址
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填写验证码
输出转换结果
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互补反向链
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同时转换多条序列
三、序列翻译 所谓序列翻译，是指用计算机程序把核酸序列按三 联体密码规则翻译成蛋白质序列。 6框架翻译，即从正向1，2，3位碱基开始按三联体密 码规则翻译成3条蛋白质序列以及从反向1，2，3位碱 基开始翻译得到3条蛋白质序列，共6条蛋白质序列。 问题： 究竞蛋白质序列是不是真正表达的蛋白产物？ 方法：
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NCBI网站：/guide/all/#tools 14
EBI网站：/
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一、序列统计
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序列统计包括核酸序列基本指标的计算：分子质量、GC百 分含量、融合温度（Tm值，又称退火温度）、摩尔消光系 数等。可通过一些常用软件如JaMBW软件包中的一个小工 具Oligo Calculator、BioEdit、DNAMAN等进行综合计算。
2. DNA序列携带的遗传信息具有极高的复杂性
3. DNA序列分析是揭示遗传语言复杂性的基本过程
二、基因结构与功能简介 原核生物基因结构
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特点：
1 长开放阅读框 2 高基因密度 3 简单的基因结构 4 基因组中GC含量变化非常大
真核生物基因结构
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1 基因组规模大
特点： 2 非编码区序列占绝大部分（人类，97％） 3 基因结构复杂