TG1大肠杆菌克隆菌株使用说明
大肠杆菌表达操作规程
大肠杆菌表达操作规程大肠杆菌表达操作规程一、实验材料和仪器准备1. 大肠杆菌菌株：选择适合表达目标蛋白的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)、Rosetta(DE3)等。
2. 表达载体：选择适合目标蛋白表达的载体，如pET 系列、pBAD系列等。
3. 目标蛋白基因：基因可以通过PCR扩增获得，或者从其他载体中克隆。
4. 培养基：溶液制备LB培养基，配制好含有适当抗生素的LB琼脂板，另外还需要制备适用于大肠杆菌表达的诱导培养基，如TB、SB等。
5. 抗生素：根据载体的需要，选用适当浓度的抗生素。
二、诱导表达实验操作流程1. 预先培养：取一株原始菌落接种到含有适当抗生素的LB液体培养基中，为了避免突变株的污染，建议每次都从冷冻保存的单一菌落开始。
培养条件为37℃，180rpm，过夜培养。
2. 选取合适菌液接种量：从过夜的预培养液中取2ml，用于接种适当量的诱导培养基。
3. 诱导表达：根据所用的表达载体，将接种量转移到含有适当抗生素的诱导培养基中，继续培养。
4. 培养条件：培养条件根据所选表达载体的要求进行设置，一般为37℃，180rpm。
5. 收集细胞：在适当的时间点，如在菌液浓度达到指定值或培养时间达到一定程度后，通过离心收集细胞。
6. 细胞破碎：采用适当的方法破碎细胞膜，如超声波破碎、冻融法等。
7. 蛋白质提取：以适当的缓冲液提取目标蛋白质。
8. 蛋白质纯化：采用各种纯化方法（如亲和层析法、凝胶过滤法等）对蛋白质进行纯化。
9. 检测和分析：对蛋白质进行SDS-PAGE、Western blot等分析方法进行检测。
三、注意事项1. 培养条件的控制：控制好培养温度、转速和时间等条件，以保证表达的效果。
2. 抗生素浓度的选择：根据所用载体对抗生素的要求，选择适当的浓度以抑制非目标菌株的生长。
3. 提取和纯化条件的选择：选择适当的缓冲液、酶和抑制剂，以保持目标蛋白的活性和稳定性。
4. 实验材料的无菌处理：所有实验材料（包括培养基、平板、显微镜片等）都要经过严格的无菌处理，以防止外源性污染。
高效TG1电转感受态 化转感受态的制备与主要影响因素
大肠杆菌感受态细胞的制备 与质粒DNA的转化
2020-04-12
• 相关概念 • 菌生长特点 • 实验原理 • 方法特点 • 实验步骤 • 影响因素 • 电转杯重复利用方法
一、相关概念
感受态细胞
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法) 的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进 入的一种细胞状态。
电脉冲强度对电转化效率的影响
• 电场强度的影响机制 较为复杂 ，目前还 不是 十分清楚。 Kimoto的研究表明：电脉冲前 ，DNA和细胞是随机分布 的 ；电脉冲早 期，DNA 和细胞向阳极运动 ；电脉冲的 后期 ，DNA插入细胞的外膜或者进一步进 入细胞质问 隙 ；随后在 37℃孵 育期 问 DNA渗透通过 内膜进入细胞浆 。高场强下 ，可瞬间击穿细胞壁和质膜 ，形成能通过外 源物质 的跨膜 孔道；而低场强的作用下 ，需累计电荷达 到一定的强度，才可作用于质膜 ，形成孔道 ，这样易使 已形成孔道的细胞因内含物外流而引起死亡 。所以选择 合适的脉冲强度对外源 DNA的导人非常关键 。
质粒DNA不同量时对E.coli转化效率影响
质粒 DNA的结构 、大小 、含量对电转化效率的 影响也很大。选用 pUC19作为质 粒材料，就其含量对电转化效率的影响进行了探讨 ：在 40ul菌液加 入 了 4种不 同含量 的质 粒 DNA，分 别 为 0.25 ng、0.5 ng、1.0 ng、1.5 ng，结 果 表 明 用 量 为1.0 ng质粒 DNA时，电转化效率最高 ，而且电转化 效 率与 外 源 DNA 的含 量 在 一 定 范 围 内成 正 比 ；但当加入 的外源DNA的量过多或体积过大时，则 会 使转化效率下降。即 DNA溶液 的体 积不应超过感受态细胞体积 的5 %，1 ng 的质粒 DNA 即可使 50ul的感受态细胞达到饱和 。
大肠杆菌克隆表达人类基因的注意事项
大肠杆菌克隆表达人类基因的注意事项大肠杆菌是常用的真核表达系统之一，具有优点如易于培养、遗传稳定和高表达水平等。
在进行大肠杆菌克隆表达人类基因的过程中，需要注意以下几个方面：1.选择合适的质粒载体：质粒载体是将目标基因插入宿主细胞中的工具。
选择具有致密复制位点和特定启动子的质粒，可以提高基因的稳定性和表达水平。
一般建议选择常用的表达载体，如pET系列、pGEX系列等。
2.制备合适的基因片段：将人类基因转入大肠杆菌前，需要利用PCR或其他方法从人类细胞中扩增得到基因片段。
合理设计引物，包含适当的启动子和终止子序列，避免产生GC丰富的片段，以免影响大肠杆菌的转化和表达效率。
3.优化启动子和终止子：为了提高目标基因的表达水平，可以选择合适的启动子和终止子来调控基因的转录和翻译。
常用的启动子包括T7、lac、trp等，终止子一般选择T7终止子。
4.确定正确的大肠杆菌菌株：大肠杆菌有多个常用的表达菌株，如BL21(DE3)、XL1-Blue、TOP10等。
根据实验要求选择合适的菌株，包括产蛋白质的溶解度、转化和表达效率、内毒素含量等因素。
5.优化诱导条件：为了获得最佳的基因表达效果，需要优化诱导条件。
常用的诱导剂有IPTG、Lactose等。
优化诱导时间、温度和诱导剂浓度等条件，可根据目标蛋白的特性进行调整。
6.加入相关辅助单元：在大肠杆菌中表达人类基因时，可能需要加入辅助单元，如信号肽序列、标签序列、分泌酶等。
信号肽序列可以帮助蛋白质定位和转运，标签序列如His-tag、GST-tag可以辅助蛋白质纯化和检测。
7.注意避免内毒素产生：大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，其细胞壁含有内毒素。
内毒素可引起细胞毒性和炎症反应，影响目标蛋白的纯化和性质。
因此，在表达人类基因时，需要注意控制内毒素的产生，如选择低内毒素菌株、减少诱导剂的使用量等。
8.合理的蛋白质纯化策略：在成功表达目标蛋白后，需要进行蛋白质的纯化。
根据蛋白质的性质，选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
大肠杆菌基因克隆的基本步骤
大肠杆菌基因克隆的基本步骤嘿，咱今儿个就来聊聊大肠杆菌基因克隆那些事儿！你可别小瞧这大肠杆菌，它在生物领域那可是有着相当重要的地位呢！要进行大肠杆菌基因克隆，第一步，得先找到咱要克隆的那个基因吧。
这就好比你要去一个陌生的地方，得先知道目的地在哪儿呀！得通过各种技术手段，像侦探破案似的，把那个特定的基因给揪出来。
然后呢，就该准备载体啦。
载体就像是一辆小货车，要把基因这个“宝贝”给装进去，拉到它该去的地方。
这小货车可得选好喽，得合适才行，不然基因在里面不舒服可不行。
接下来，把基因和载体连接到一块儿。
这就好像给基因找了个“家”，让它安稳地待在里面。
这连接的过程可得仔细着点儿，不能有一丁点儿差错。
之后，把连接好的载体导入大肠杆菌里。
这就好比把货物运进了仓库。
这导入的方法也有好几种呢，就看哪种适合咱啦。
导入之后，就得让大肠杆菌好好生长啦。
给它提供适宜的环境，就像咱人得住在舒服的房子里一样。
让大肠杆菌在里面开开心心地生活，把咱的基因好好复制。
这时候你可能会问啦，那怎么知道基因克隆成功没呀？嘿嘿，这就得检测啦。
就像考试要看看成绩一样，得知道自己做得对不对。
咱再想想，这基因克隆就像是搭积木，一块一块地搭起来，最后搭成一个漂亮的城堡。
每一步都得小心翼翼，不能马虎。
你说要是中间出了差错会咋样？那可就麻烦啦，就像搭积木搭错了一块，整个城堡可能就歪了或者倒了。
所以每一个步骤都得认真对待呀！你想想，通过这些步骤，咱就能把一个小小的基因复制好多好多份，这多神奇呀！这就是科学的魅力，能让不可能变成可能。
总之呢，大肠杆菌基因克隆虽然听起来挺复杂，但只要咱一步一步慢慢来，肯定能成功。
咱可不能怕困难，要像勇士一样勇往直前！咱要相信，通过咱的努力，一定能在这个领域做出一番大成就！。
大肠杆菌的克隆载体 PPT课件
3.1.2
pBR322的一些有用特性
从pBR322的遗传图谱和物理图谱(图6-1)可以看 出为什么它能是一个如此受欢迎的克隆载体？ 第一个优点在于它的大小 第2章里提到，作为一个克隆载体它的大小应 该小于10kb，否则在提纯它的时候很容易导 致DNA断裂。 pBR322只有4 363bp，意味着可以很容易纯化 质粒本身及其所携带的重组DNA分子。即使添 加上6kb的DNA链，重组的pBR322的大小仍在 可操作的范围内。
第一个优点 人们在构建这个质粒时，在它的复制起点上产 生了一个偶然的突变，使得它在大肠杆菌内 的拷贝数达到了500-700（扩增以前的数目）。 这样可以在转化后的大肠杆菌细胞中获得大量 的目的DNA。 第二个优点在于重组体的识别只需一步，仅仅 只要把待筛选的大肠杆菌铺板到含有氨苄青 霉素和X-gal的琼脂培养基上。 而pBR322和pBR327，重组体的筛选都需要把菌 落从一种抗生素培养基原样转移到另一种抗 生素培养基平板。 一个用pUC8做载体的克隆实验比选择pBR322和 pBR327要节约一半的时间。
pGEM3Z—克隆DNA的体外转录
pGEM3Z与pUC载体很相似：都含有ampR和lacZ‘基 因，在后者上有一个限制性酶切位点，而且 两个质粒有着差不多完全相同的大小。 区别：pGEM3Z多两个短片段，每一个片段都可 以充当启动子，黏附RNA聚合酶。 外源DNA在限制性酶切位点被导入pGEM3Z载体， 在限制性酶切位点的两边分别存在着这两个 启动子序列。这就意味着，在试管里同时放 入重组后的pGEM3Z质粒和提纯的RNA聚合酶， 被克隆的DNA分子会指导合成相应的RNA，发 生转录。产生的RNA可用作杂交探针，也可用 于研究RNA加工 (如内含子如何切除)，或是 用于合成蛋白质。
大肠杆菌培养操作规程
大肠杆菌培养操作规程一、目的及适用范围制订本规程的目的为规范大肠杆菌总RNA的制备，保证为诊断试剂产品提供质量可控的质控品及标准品基质。
本规程适用于南京实验室提取大肠杆菌总RNA 的操作。
依照本操作规程，每次可提前大约提取基质液原液2.7ml。
二、常规时间安排RNA完全提取根据需求，自行安排。
三、培养用耗材准备1、锥形瓶、双层铝箔、棉绳2、包扎一盒1ml的枪头，50ml康宁冻存管四、培养基配制(早上)培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。
1、按下表称取物资配置LB培养基到500ml锥形瓶中：2、用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、溶解。
待灭菌。
五、PBS溶液配制1、10XPBS不需要每次生产都配置，生产前跟检查PBS量是否充足，如充足则可跳过该步骤。
2、配制10XPBS缓冲液备用；例如配制1000L10XPBS储存液，取1000ml配液瓶，根据下表称取各物质。
用去离子水定容至1000ml。
3、将PBS溶液混合均匀，包扎好，待灭菌。
六、灭菌1、将配置好的PBS溶液，培养基，1ml枪头准备好。
2、确认灭菌锅内水位是否达到标准水位，若未达到，则加入纯化水至标准水位。
3、将包扎好的培养基、PBS溶液和枪头盒一同放入灭菌锅。
注意PBS盖不可太紧，盖紧灭菌锅盖，须旋紧；设置各参数：121℃，20min。
4、灭菌结束后，待灭菌锅压力降至“0”，打开灭菌锅盖；取出灭好菌的培养基和枪头盒。
5、PBS、培养基放置于室温静置2h，待完全冷却。
枪头盒放入80°C鼓风干燥箱三小时烘干。
备用。
6、冷却至室温后，进行活化。
七、菌种复苏（下班前）1、打开超净工作台紫外灯，紫外照射半小时，关闭紫外灯。
2、在超净工作台内进行菌种复苏接种操作，打开50ml冻存管管盖后，用酒精灯外焰灼烧灭菌处理冻存管管口，打开处理好的培养基瓶，用酒精灯外焰灼烧灭菌处理培养基瓶瓶口，倒10ml培养基至50ml冻存管中，用酒精灯外焰灼烧灭菌处理培养基瓶瓶口后将培养基瓶密封待用。
常用大肠杆菌基础信息及使用说明
常用大肠杆菌基础信息及使用说明菌株目录BL21 (2)BL21(DE3) (4)BL21(DE3)pLysS (6)BL21 Star(DE3) (8)BL21(AI) (10)OverExpress C43(DE3) (13)M15(pREP4) (15)CopyCutter EPI400 (16)Rosetta(DE3) (18)XL10 (20)Mach1-T1 (22)DH5a (23)TOP10 (24)BL21基因型F- dcm omp T hsd S(r B- m B-) gal产品说明作为E.coli B宿主菌，主要用来进行蛋白表达，细胞内缺少lon蛋白酶和ompT外膜蛋白酶，能够有效避免目的蛋白的降解；当使用CE6噬菌体启动子时，BL21感受态细胞对目的蛋白在未诱导情况下的蛋白表达严密控制；用于非T7启动子驱动的基因表达，表达水平极高。
操作方法1.BL21感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。
4.5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。
5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
Sample Induction Protocol (for reference only)1. Inoculate a single colony from a freshly streaked plate into 5 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic for the plasmid and host strain.2. Incubate with shaking at 200 rpm at 37℃overnight.3. Inoculate 50 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic with 0.5 ml of the overnight culture prepared in step 2(use the 500 ml triangular flask as the container would be better).4. Incubate with shaking at 150 rpm at 37℃until the OD 600 reaches 0.5-0.8.5. (Optional)Pipet 1ml of the cultures into clean microcentrifuge tubes and place the tubes on ice until needed for gel analysis or storage at -20℃. These will serve as the non-inducedcontrol samples.6. Add IPTG to a final concentration of 1 mM. Optimal time for induction of the target protein may vary from 2-16 hours, depending on the protein.7. Incubate with shaking at 120 rpm at 37℃for 3-4 hours. To determine the optimal time for induction of the target protein, it is recommended that a time course experiment be performed varying the induction from 2-16 hours.8. Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 min at 4℃.9. Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃(storage at lower temperatures is also acceptabl e).IPTGPrepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) bydissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.BL21(DE3)基因型F- omp T hsd S B(r B- m B- ) gal dcm(DE3)产品说明BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。
TG1感受态细胞说明书
TG1感受态细胞说明书一、简介大肠杆菌经Ca离子处理后可摄取外源DNA（Plasmid、Phage DNA），处于这种状态的细胞称作感受态细胞（Competent Cells）。
在进行基因重组实验时，使用感受态细胞的转化实验应用十分广泛。
制作基因文库、重组质粒体以及进行亚克隆实验时，特别是在目的基因含量十分低的情况时，使用高效的感受态细胞十分重要。
而TG1菌株常常用于噬菌体的制备。
本公司生产的感受态细胞是采用氯化钙处理得到的感受态细胞，使用pUC19质粒检测，转化效率可达107-108，在-70℃下保存几个月转化效率不发生改变。
二、使用方法（1）取出感受态细胞，置于冰上5min，解冻。
（2）然后将连接体系（5~10ul）加入感受态中（～100ul），轻弹感受态离心管底部，混匀，冰浴30分钟。
（3）将离心管放入42℃水浴90秒后，迅速放于冰上。
（4）每管中加500μl LB(SOC)培养基(不含抗生素)，37℃振荡培养1小时。
目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
（5）室温4,500rpm离心5分钟，弃去900μl上清后，用剩余100μl 培养基重悬细胞并涂布到含Amp的LB琼脂平板或含X-gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板表面。
（6）将平板置于室温直至液体被吸收。
（7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
三、注意事项１. 用此感受态进行转化需要热激，不能电转化，请勿分装。
2 . 感受态细胞应保存在-70 ℃，不可多次冻融和放置时间过长，以避免降低感受态细胞的转化效率。
3 . 为防止转化实验不成功，可以保留部分连接反应液，以重新转化，将损失降到最低。
4 ．所有操作均需注意无菌操作。
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简 介 ：
TG1 来源于 E. coli K-‐12 菌株，是目前生长速度最快的克隆用大肠杆菌
菌株，在平板上 37℃，7h 可见克隆。主要的噬菌体展示用菌株，同时也
可用于普通质粒的构建，lacIqZΔM15 的存在使其可以用于蓝白斑筛选等
面蘸取少量涂板或进行液体培养即可。也可以完全融解后使用，但随着冻融次数
的增加，细菌的活力会逐渐下降。
2，为保证菌种纯正，避免其它细菌污染，尽量先划平板，然后再挑单克隆
菌落进行后续操作。
冷 冻 管 开 封 ：
用浸过 75%酒精的脱脂棉严格消毒冷冻管盖。
储存温度：-‐80℃
基 因 组 ：
F' [traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]supE thi-‐1Δ(lac-‐proAB)
Δ(mcrB-‐hsdSM)5 (rK-‐mK-‐)
实验；但不含核酸酶 endA1 突变，体内核酸酶含量较高，提取质粒时推荐
使用质粒提取试剂盒中去蛋白液以去除菌体内大量的核酸酶。TG1 菌株需
在无抗生素的 LB 中，在 37℃有氧的条件下培养，然后使用 30%的甘油保
藏 菌 种 。
操作说明：
1，本品包含一份甘油菌，使用本甘油菌时可以不用完全融解，在甘油菌表
TG1 大肠杆菌克隆菌株
编号
名称
北京华越洋生物 NRR00730
TG1 大肠杆菌克隆菌株
基 本 信 息 ：
名称：TG1
ห้องสมุดไป่ตู้ 规格：300ul 甘油菌
菌 株 复 溶 ：
无菌环境中旋开装有复溶液的滴瓶盖，吸取 1ml 左右复溶液，加入到冷冻
管中。轻轻振荡，使冻干菌株溶解呈悬浮状。
菌株复壮：
用无菌吸管吸取菌悬液，转移到复溶液滴瓶中。做好标识，在适宜温度下培
养。细菌在 30-‐35℃培养箱中培养 24-‐48h，真菌在 23-‐28℃培养箱中培养 24-‐72h
（必要时，可适当延长培养时间）。
菌 株 传 代 ：
将得到的菌株的新鲜培养物转接到适宜的固体培养基及液体培养基中（尽量
增大接种量：如用无菌吸管吸取≥50μl 新鲜培养物至固体培养基，边移动边缓
慢释放），适宜温度下培养，用以菌株的保藏、传代及制备工作菌株。
注 意 事 项 ：
1、菌种活化前，将冷冻管保存在低温、清洁、干燥的环境中，长时间室温下放 置会导致菌种衰退； 2、冷冻管开封、冻干粉复溶、菌株恢复培养等操作应在无菌条件下进行； 3、一些菌种经过冷冻干燥保存后，延迟期较长，部分需连续两次继代培养才能 正常生长； 4、苛养菌的培养需采用含特定营养成分的培养基，敬请正确选择，不清楚时来 电询问； 5、某些厌氧菌的培养，自开封到接种完成，均需以无氧气体充填，以保持厌氧 状态；培养过程中亦要保持厌氧状态； 6、某些菌种，如肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌等需要 5-‐10%CO2 促 进生长； 7、如发现冷冻管盖松动、复溶液浑浊等异常情况，应停止使用对应产品。 8、部分菌种有致病性、扩散性，请专业人员在专业环境下有保护性操作。 保 藏 条 件 ： -‐20℃保存（复溶液于 2-‐8℃保存） 保 藏 时 间 ： 2-‐10 年，应根据菌种状况及时转接