荧光报告载体
人脂联素基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ２ — ｏ ６ — １ ８
ｍ ｏ ｕ ｒ ｎ ｅ ｃ ｒ ｏ ｓ ｉ ｓ ｆ ａ ｃ ｔ ｏ ｒ — ａ ｌ ｐ ｈ ａ ， Ｔ Ｎ Ｆ — ） 等， 统称 为脂 肪细 胞分泌 因子 （ Ａ ｄ ｉ ｐ ｏ ｋ ｉ ｎ ｅ ｓ ， Ａ Ｄ Ｓ ） 。其 中 Ａ Ｄ 是 脂 肪 组 织 表 达 最 丰 富 的特 异 性 蛋 白质 产 物 之 一 ， 能 够 扩 大
外分 光光度计测定 Ｄ Ｎ Ａ的纯度和含量 。
３ ． Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 Ａ Ｄ基 因启 动 子 片段
报告基 因表达 载体 ｐ Ｇ Ｌ 一 ３ ｂ ａ ｓ ｉ ｃ （ Ｅ ６ ７ ２ １ ） ， 限制
等密切相关 ，但其作用 机制尚不明确 。本 课题利用 Ｐ Ｃ Ｒ技术从人全血基 因组 Ｄ Ｎ Ａ中扩增 出长为 １ ． １ ｋ ｂ
修 回 日期 ： ２ ０ １ ２ —１ ２ — １ ８
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郑 州市科技 公关计 划项 目（ ０ ９ １ ０ Ｓ Ｇ Ｙ Ｓ ３ ３ ３ ９ １ — １ ） ： 以脂肪 细胞分泌因子为靶 点的减肥 中药初 步筛选 ， 负责人 ： 宰军华。
２ ０ １ ３ 第十五卷
第一期
＊Ｖ ｏ １ห้องสมุดไป่ตู้． １ ５ Ｎ ｏ ． １
和２ ． １ ｋ ｂ Ａ Ｄ启 动子 片段 ，并 将其克 隆到荧 光素酶 报告 基 因载体 ｐ Ｇ Ｌ 一 ３ ｂ ａ ｓ ｉ ｃ 上 ，为 今后 研究 Ａ Ｄ基 因表达 调 控 的分 子 生物 学 机制 和药 物 筛选 提 供 实 验工 具 ，亦为进一 步 阐明 Ａ Ｄ在 肥胖及其 相关疾病 中的作用提供实验 学方法 。
KLF3基因3'-UTR区双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建与活性鉴定
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pRL 家族海肾荧光素酶对照报告基因载体系列
pRL家族海肾荧光素酶对照报告基因载体系列产品包装目录号价格pRL-SV40 Vector 20ug E2231pRL-TK Vector 20ug E2241pRL-CMV Vector 20ug E2261pRL-null Vector 20ug E2271描述：pRL家族海肾荧光素酶(Rluc)对照报告基因载体系列是设计应用于双荧光素酶报告基因检测系统的。
pRL载体提供组成性表达的海肾荧光素酶，可与一个萤火虫荧光素酶载体联合共转染哺乳动物细胞。
海肾荧光素酶的表达为使实验的萤火虫荧光素酶报告基因正态化提供内对照值。
pRL载体包含一个编码海肾荧光素酶(Rluc)的cDNA, 这个cDNA从珊瑚虫类腔肠动物海肾(Renilla reniformis)中克隆而来。
目前有四个不同的启动子载体。
其中HSV-胸腺嘧啶核苷激酶启动子(pRL-TK)相对较弱，在提供海肾荧光素酶报告基因载体的组成性表达时特别有用。
早期SV40 增强子/启动子区域(pRL-SV40)和CMV极早期增强子/启动子区域（pRL-CMV）一般提供高水平转录，因此也许不适于应用在实验载体带有强调节因子的辅助报告基因实验中。
一般，我们建议在将要应用的目标细胞中验证一个特定辅助报告基因的性能。
与修饰过的Rluc 基因一样，所有的pRL载体都从dam-/dcm-E.coli K菌株中分离得到，允许使用对dam和dcm 甲基化敏感的限制性内切酶进行消化。
特点：●在紧靠Rluc的上游有一个T7启动子，允许进行海肾荧光素酶的体外合成。
●在Rluc的下游有一个SV40的晚期poly(A)序列，提供有效的转录终止和mRNA的聚腺苷酸化。
●原核复制起点和β-内酰胺酶基因使得pRL载体可在E.coli宿主中进行选择扩增。
●为避免DNA甲基化，所有的pRL载体均从dam-/dcm-E.coli K宿主中分离得到。
操作手册：技术公告：TB237, TB238, TB239, TB240储存条件：载体存于-20℃, 细菌菌株存于-70℃。
荧光蛋白报告载体
荧光蛋白报告载体荧光蛋白（Fluorescent Protein，FP）是一类具有自身天然荧光特性的蛋白质，能够在特定条件下发出可见光。
由于其独特的特性，荧光蛋白被广泛应用于生物学研究、医学诊断和生物工程等领域。
而荧光蛋白报告载体则是指将荧光蛋白基因与其他基因融合，使得该基因在表达时能够产生可见荧光信号，从而实现基因表达的可视化和定量化。
下面将介绍荧光蛋白报告载体的构建和应用过程。
1.荧光蛋白的选择荧光蛋白有多种类型可供选择，如绿色荧光蛋白（GFP）、黄色荧光蛋白（YFP）、红色荧光蛋白（RFP）等。
在选择荧光蛋白时，需考虑其荧光强度、稳定性、激发波长和发射波长等因素，并根据实验需要进行合适的选择。
2.载体的构建将荧光蛋白基因与目标基因进行融合，需要使用合适的载体来实现。
常用的载体包括质粒、病毒载体等。
质粒载体是最常用的载体之一，可以通过分子克隆技术将荧光蛋白基因与目标基因连接起来，形成报告载体。
3.载体的转染将构建好的荧光蛋白报告载体导入到目标细胞内，实现基因的转染。
转染方法有多种，如瞬时转染、稳定转染等。
根据实验需要和细胞类型的不同，选择合适的转染方法。
4.荧光成像与分析转染后的细胞可以通过荧光显微镜观察到荧光信号。
根据荧光蛋白的特性，可以通过激发荧光信号，观察细胞内目标基因的表达情况。
同时，可以利用图像分析软件对荧光图像进行处理和分析，实现基因表达的定量化和定位。
5.应用领域荧光蛋白报告载体在生物学研究、医学诊断和生物工程等领域有广泛的应用。
在生物学研究中，荧光蛋白报告载体可以用于研究基因的表达和调控机制，观察细胞的生理和病理过程，探究蛋白质的定位和交互作用等。
在医学诊断中，荧光蛋白报告载体可以用于检测病原体的存在和活性，实现早期诊断和治疗。
在生物工程中，荧光蛋白报告载体可以用于基因工程的监测和优化，提高基因表达的效率和产量。
总结：荧光蛋白报告载体通过将荧光蛋白基因与目标基因融合，实现了基因表达的可视化和定量化。
双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体
双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体1.什么是双荧光素酶报告基因测试系统（DLR）DLR测试系统灵敏，方便，在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶(Renilla reniformis)，DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。
2.有哪些海肾荧光素酶载体海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。
这类载体还有T7启动子，可用T7RNA聚合物在体外合成海肾荧光素酶，有4个不同的载体：A pRL-SV40载体??? pRL-SV40载体含SV40增强子及早期启动子区域，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。
pRL-SV40载体还含有SV40的复制起始区，可在表达SV40大T抗原的细胞中，如COS-1，COS-7细胞中，瞬时及附加体似地复制。
B pRL-CMV载体pRL-CMV载体含有CMV极早增强子及启动子，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。
a pRL-TK载体pRL-TK载体含HSV胞嘧啶激酶启动子区域，在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。
b pRL-null载体pRL-null载体缺真核启动子及增强子，在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。
3.用双报告基因有何优点一般地说，实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而另一个报告基因作为内对照，以提供实验报告基因测试的归一化。
将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化减弱实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。
海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。
在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。
4.相比用CAT或β-半乳糖苷酶对表达数据作归一化，双荧光素酶报告基因测试系统有何优点用双荧光素酶报告基因测试（DLR）有几个优点：•快速•DLR测试不需保温或对样品作预处理。
人IPIO启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在细胞中的表达
［ 关 键词 ］干扰素 一 一 诱导蛋白 １ ０ ； 转录启动子 ； 红色荧光蛋白； 基因， 调节 ； 基因， 报告
［ 中 图分 类号 ］Ｑ ７ ８
［ 文献标 识 码 ］Ａ
［ 文章编 号 ］１ ０ ０ ０ － ２ ７ ０ ７ （ ２ ０ ０ ７ ） ０ ４ － ０ ３ ４ ５ － ０ ４
酶切和 Ｄ Ｎ Ａ测序证明所 构建的红色荧光蛋 白报 告基因载 体是正确 的 ； 该表 达载 体在 ＨＥ Ｋ ２ ９ ３细胞静 息状态 下 表达水平很低 ， 经Ｌ Ｐ Ｓ刺激后 ， 在荧 光显微镜下可看到高亮度 的红色荧 光。结论 ： 所构 建 的 Ｉ Ｐ Ｉ Ｏ启动子驱 动的 红色荧光蛋 白报告基因载体是正确 的， 对生理相关刺激有很好 的反应 ， 可有效 地用 于 Ｉ Ｐ Ｉ Ｏ基 因表 达信号调控 机
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第３ ２卷 第 ４期 ２ ０ ０ ７年 ８月
贵 阳 医 学 院
学 报
Ｊ ＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＧＵＩ ＹＡＮＧ Ｍ ＥＤＩ ＣＡＬ ＣＯＬＬＥＧＥ
ＶＯ １ ． ３ ２ ＮＯ． ４ ２ ０ ｏ７ ． ８
人 Ｉ Ｐ Ｉ Ｏ启 动 子 红 色 荧 光 蛋 白报 告 基 因 载 体 的 构 建 及 在 细 胞 中 的表 达 帛
Ｍｅ ￣ｏ ｄｓ：Ｈｕ ｍａ ｎ Ｉ ＰＩ Ｏ ｐ ｏ ｍｏ ｒ ｔ ｅ ｒ ｗａ ｓ ｓ ｕ ｂｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ａ ｅｄ ｒ ｌｕ ｆ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｔ ｐ ｏｔ ｒ ｅ ｉ ｎ ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ，ｐ Ｄｓ Ｒｅ ｄｌ 一 １ ．Ｔｈ ｅ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂｉ ｎ ａ ｎ ｔ ｖ ｅ ｃ ｏｒ ｔ ｗａ ｓ ｔ ｈｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｎｓ ｆ ｅ ｃ ｔ ｅ ｄ ｉ ｎｔ ｏ ＨＥＫ ２９ ３ ｃ ｅ ｌ ｌ ｌ ｉ ｎ ｅ ｓ ．Ｔｈ ｅ ｅｃ ｒ ｏ ｂ ｉ ｍ ｎ ｎｔ ａ ｐ ｌ ｓ ｍｉ ａ ｄ ｗａ ｓ ｖ ｅ ｉｆ ｒ ｉｅ ｄ
转染绿色荧光蛋白表达载体
• 肿瘤发病机制的应用 • GFP 与目的基因融合，将目的基因标记为 绿色，即可定量分析目的基因的表达水平 ，显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的 变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中 的作用及其分子机制提供便利条件。
转染原理
• 脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成的。在水 中可以自动生成闭合的双层膜，最初 ,人们只是运用脂质 体模拟生物膜 ,研究膜的构造及功能 ,后来发现了膜的融合 及内吞作用 ,因而可用作外源物质进入细胞的载体。 • 现商品化的脂质体通常都是阳离子脂类和中性脂类的复合 体。其中以阳离子脂类起主要作用，阳离子脂质体既能与 DNA可以通过静电作用形成脂－DNA复合物，也能被表面 带负电荷的细胞膜吸附。从而引导DNA进入细胞。 • 本次用脂质体为invitrogen公司Lipofectamine® 2000
• 而F64L点突变则改善了GFP在37℃的折叠能力， 综上就产生了增强型GFP，分也是钱永健的功劳。现在有蓝色荧光蛋 白（EBFP）、青色荧光蛋白（ECFP）和 黄色荧光蛋白（YFP） • 于2008年获得诺贝尔奖
• 作为一种新型的报告基因，GFP已在生物 学的许多研究领域得到应用。 • 将GFP作为蛋白质标签，即利用DNA重 组 技术，将目的基因与GFP基因构成融合基 因，转染合适的细胞进行表达，然后借助 荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行细胞 内活体观察。 • 利用GFP来检测目标蛋白的定位为我们提 供了一种对细胞内的一些基本的生理过程 进行更详尽观察的新方法。
转染绿色荧光蛋白表达载体
• 绿色荧光蛋白（GFP)是1962年从水母中发现的一个荧光 蛋白，1992年被克隆，近年得到广泛应用。其分子中的发 光基团对蓝色光照特别敏感。当它受到蓝光照射时，会吸 收蓝光的部分能量，然后发射出绿色的荧光。
荧光素酶报告实验
荧光素酶报告实验1 扩增目的片段扩增包含靶基因与miRNA互补位点的3’UTR序列以及mutant序列，上下游引物5’端各含有不同的酶切位点和保护碱基（如Pme I，Spe I）；电泳检测目的条带，看大小是否正确，然后用试剂盒纯化PCR产物备用。
主要采用了2 种方法进行序列突变及扩增，如下图所示：第一种方法：第二种方法：1.2 取1-2 μg纯化的目的片段或pMIR-REPORT载体，按酶切反应体系配制混合液进行酶切（加0.01% BSA），酶切3h后，80℃灭活5 min，冰上降温。
酶切产物进行胶回收。
酶切体系连接体系Component V olume (μl) Component V olume (μl) H2O 16-x H2O 8-m-nVector or DNA x Vector mNEB Buffer I或IV 2 DNA nSpe I 1 10×T4 Ligase Buffer 1Pme I 1 T4 DNA Ligase 1Total voloume 20 Total voloume 101.3 配制连接反应混合液（DNA和Plasmid的molar ratio为3:1到6:1），16℃连接过夜或室温连接10 min。
连接完毕后，将连接产物转化入感受态大肠杆菌（热激法）。
Amp（100 μg/ml）抗性培养板筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定目的片段，送3个样本测序，提取质粒酶切鉴定等。
并扩繁阳性克隆。
重组Luc-3’UTR 质粒主要元件和组成如下图所示（重组Luc-3’UTR-Mut 原理相同）：pLuc-MET 3'UTR 荧光素酶报告基因载体的构建4.接种对数生长期的HEK293细胞（10% FBS+90% DMEM培养）于96孔板，3×103个/孔，每个实验组设置6个复孔，37℃，5% CO2培养箱中培养24h；5.根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，配制转染液，转染HEK293细胞；A 液B液pLuc-3’UTR 0.1 μg Lipofectamine 2000 0.5 μlpRL-SV40 0.05 μg OPTI-MEM 25 μlMimic/NC 100 nM终浓度OPTI-MEM 25 μl6 转染48 h后，吸除96孔板中的培养液，用ddH2O稀释Passive Lysis Buffer至1×浓度，在96孔板中加入1×Passive Lysis Buffer，20 μl/孔，用移液枪反复吸打裂解细胞；7 在白色不透明的96孔板中加入100 μl/孔的Luciferase Assay Substrate；8 从每孔裂解好的细胞悬液中吸出11.5 μl加入Luciferase Assay Substrate中混匀；9 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据；10 用Stop & Glo® Buffer稀释Stop & Glo® Substrate至1×使用浓度；11 在第7步完成后，加入Stop & Glo® Substrate 100 μl/孔，混匀；12 在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据，两次测得数据的比值代表各孔样本的相对荧光强度。
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荧光报告载体
荧光报告载体是一种用于检测生物分子的工具，它通过荧光信号来标记目标分子，快速、高灵敏地检测出目标分子的存在和浓度。
荧光报告载体主要由两个部分组成：报告基团和载体基团。
报告基团是负责发出荧光信号的组分，常见的报告基团有荧光素、荧光素衍生物、生物素、发光酶和量子点等。
这些基团在受到激发光的刺激后，会发出荧光信号，从而实现对目标分子的检测。
载体基团则是负责将报告基团固定在某一特定位置上，并能保持其功能的组分。
常见的载体基团有金属离子、磁性颗粒、生物体内分子和聚合物等。
具体选择何种载体基团，需要根据实际的检测需求来决定。
荧光报告载体广泛应用于生物医学领域的分子诊断、病理学研究、生物分子检测等方面。
例如，可以使用荧光报告载体检测细胞的蛋白质表达情况，以及肿瘤标志物的存在量；还可以使用荧光报告载体检测细菌或病毒的感染等。
荧光报告载体的设计与选择需要注意以下几个方面：1.信号强度：荧光信号的强度越大，检测结果的准确性就越高；2.稳定性：在生物体内，荧光报告载体需要具备较好的稳定性，以免荧光信
号的损失或偏差；3.特异性：荧光报告载体需要具有很高的特异性，以便准确地检测出目标分子。
总的来说，荧光报告载体不仅为现代生物科学的实验提供了重
要的技术手段，更极大地促进和推动了许多生物医学领域的研究
与应用。
有理设计和选择合适的荧光报告载体，将为生物科学的
发展带来新的突破和进展。