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几种常见荧光素极其特性介绍
几种常见荧光素极其特性介绍 荧光素（英语：Fluorescein，又称为荧光黄）是一种合成有机化合物，它是具有光致荧光特性的染料，外观为暗橙色/红色粉末，可溶于乙醇，微溶于水，在蓝光或紫外线照射下，发出绿色荧光。荧光染料种类很多，目前常用于标记抗体的荧光素有以下几种：异硫氰酸荧光素，四乙基罗丹明，四甲基异硫氰酸罗丹明，酶作用后产生荧光的物质。目前荧光素广发应用在免疫荧光、免疫荧光染色实验中。 下面介绍几种常用荧光素及其基本生物学特性： 1、异硫氰酸荧光素，简称“FITC”。是一种小分子荧光素，其效率取决于于溶液的pH 值，因此，在使用FITC时应注意溶液的酸碱度。FITC分子量为389.4，最大吸收光波长为490～495nm，最大发射光波长为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。 FITC在冷暗干燥处可保存多年，是目前应用最广泛的荧光素。其主要优点是人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的绿色荧光少于红色。 2、藻红蛋白，简称“PE”。相对分子质量较大，约为240kD，最大吸收峰为564nm，当使用488nm激光激发时其发射荧光峰值约为576nm，故可能会对其它大探针产生空间位阻。 但PE的化学结构非常稳定，有很高的荧光效率，并易与抗体分子结合。需要注意的是PE作为天然染料，因来源不同可能造成荧光素结构上的微小差别，导致其特征的不一致。 3、PI和EB。两者都具有嵌入到双链DNA和RNA的碱基对中并与碱基对结合的特异性。为了获得特异的DNA分布，染色前必须用RNA酶处理细胞，排除双链RNA的干扰。 PI和EB不能进入完整的细胞膜，因此，又可以用于检测死活细胞。PI和EB各种理化性质相似，但PI比EB的发射光光谱峰向长波方向移动，因而在做DNA和蛋白质双参数测量时，PI的红色荧光和FITC的绿色荧光更易于区分和测量。另外，PI比EB测得的DNA 分布的变异系统（CV值）低，所以PI得到更广泛的应用。
荧光探针设计原理
荧光化学传感器是建立在光谱化学和化学波导与量测技术基础上的将分析对象的化学信息以荧光信号表达的传感装置。其主要组成部件有三个(图 1.1)：1．识别结合基团(R),能选择性地与被分析物结合,并使传感器所处的化学环境发生改变。这种结合可以通过配位键，氢键等作用实现。２．信号报告基团(发色团, F），把识别基团与被分析物结合引起的化学环境变化转变为容易观察到的输出信号。信号报告基团起到了信息传输的作用，它把分子水平上发生的化学信息转换成能够为人感知(颜色变化)或仪器检测的信号（荧光等)。3.连接基团(S),将信号报告基团和识别结合基团连接起来,根据设计的不同连接基团可有多种选择，一般用做连接基团的是亚甲基等短链烷基。连接基团的合适与否将直接影响是否有输出信号的产生。信号表达可以是荧光的增强或减弱、光谱的移动、荧光寿命的变化等。 图1．1 荧光探针的结构 1.1.1 荧光探针的一般设计原理 (1) 结合型荧光探针[２1］ +
Analyte Signalling subunit Space Binding subunit Output signal 图1．２ 共价连接型荧光探针 结合型荧光探针是利用化学共价键将识别基团和荧光基团连接起来的一类荧光探针,是比较常见的一类荧光探针。该类探针通过对比加入分析物前后荧光强度的变化、光谱位置的移动或荧光寿命的改变等实现对分析物的检测。在该类荧光化学传感器的设计中,必须充分考虑下列三个方面的因素。(ａ） 受体分子的荧光基团设计、合成:考虑到用于复杂环境体系的荧光检测，要求荧光基团要有强的荧光（高荧光量子产率，有利于提高检测的灵敏性）,Ｓｔｏｋｅs 位移要大（可有效消除常规荧光化合物如荧光素等具有的自猝灭现象)，荧光发射最好要在长波长区(最好位于5０0 nm 以上，可避免复杂体系的常位于短波长区的背景荧光的干扰,另外由于长波长区发射的荧光能量的降低可减少荧光漂白现象的发生而延长传感器的使用寿命）。(b) 受体分子的识别基团：受体分子的识别基团设计以软硬酸碱理论、配位作用以及超分子作用力(如氢键、范德华力等）作为理论指导,多选择含氮、硫、磷杂环化合物作为识别分子。(ｃ) 荧光超分子受体的组装:组装荧光超分子受体就是利用一个连接基将识别基团和荧光基团通过共价键连接在一起,要充分考虑到识别基团和荧光
不同标记荧光基团的稳定性、半衰期介绍说明
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(完整word版)荧光机理
1光致电子转移(PET) 递给荧光基团的键合基团(RecePtor)，负责光吸收并产生荧光发射信号的荧光基团(Fluorophorc)—其荧光发射强度反映键合基团的结合状态，以及连接键合集团和荧光基团的连接基团(Spacer)。键合基团和荧光基团通常为电子给体或者电子受体。 光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后，激发态的电子给体与电子受体之间发生电子转移从而导致荧光的淬灭过程。例如，当荧光分子传感器的键合基团是电子给体，荧光基团是电子受体时，具体PET作过程如下:在光激发下，具有电子给予能力的键合基团能够将其处于最高能级的电子转入激发态下荧光基团空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁巨}到原基态轨道发射荧光，从而导致荧光的淬灭;当键合基团与底物结合后，降低了键合基团的给电子能力，抑制了PET过程，荧光基团中被光激发的电子可以直接跃迁回到原基态轨道，从而增强了的荧光基团的荧光发射。因此在未结合底物前，传感器分子表现为荧光淬灭，一旦键合基团与底物相结合，荧光基团就会发射荧光(见图) 由于与客底物结合前后的荧光强度差别很大，呈现明显的“关”、“开”状态，因此这类荧光化学传感器又被称为荧光分子开关。PET荧光分子传感器的作用机制可由前线轨道理论“来进一步说明(见图 1.5)。
2分子内电荷转移(ICT) ICT荧光化学传感器由推电子基团、吸电子基团通过p电子体系连接而成，在基态时表现为极化结构，一端为缺电子部分，另一端为富电子部分;而在光激发下，偶极矩增大，强化了这种极化特征，容易发 生ICT过程(如图)。 ICT荧光化学传感器的工作原理有两种(见图l.7a):当底物是缺电子基团(阳离子)时，一种是底物与吸电子基团结合，将增大分子内电荷转移程度，导致荧光光谱红移;一种是底物与推电子基团结合，则使原来向共扼体系转移的孤对电子用于与阳离子形成配位键，导致ICT 推一拉电子的特征下降，导致荧光光谱蓝移。当底物是富电子基团(阴离子)时，情况相反。一般情况下，ICT荧光化学传感器对荧光强度的影响不如PET荧光化学传感器显著。典型例子是同时含有吸电子
常见有机物及基团的缩写
% %de 非对映体过量百分比（不对称合成术语） %ee 对映体过量百分比（不对称合成术语） A A/MMA 丙烯腈/甲基丙烯酸甲酯共聚物 AA 丙烯酸 AAS 丙烯酸酯-丙烯酸酯-苯乙烯共聚物 ABFN 偶氮（二）甲酰胺 ABN 偶氮（二）异丁腈 ABPS 壬基苯氧基丙烷磺酸钠 Ac 乙酰基 acac 乙酰丙酮基 AIBN 2,2'-二偶氮异丁腈 aq. 水溶液 B BAA 正丁醛苯胺缩合物 BAC 碱式氯化铝 BACN 新型阻燃剂 BAD 双水杨酸双酚A酯 BAL 2，3-巯（基）丙醇 9-BBN 9-硼二环[3.3.1]壬烷 BBP 邻苯二甲酸丁苄酯 BBS N-叔丁基-乙-苯并噻唑次磺酰胺 BC 叶酸 BCD β－环糊精 BCG 苯顺二醇 BCNU 氯化亚硝脲 BD 丁二烯 BE 丙烯酸乳胶外墙涂料 BEE 苯偶姻乙醚 BFRM 硼纤维增强塑料 BG 丁二醇 BGE 反应性稀释剂 BHA 特丁基-4羟基茴香醚 BHT 二丁基羟基甲苯 BINAP （2R,3S）-2.2'-二苯膦－1.1'-联萘，亦简称为联二萘磷，BINAP是日本名古屋大学的Noyori（2001年诺贝尔奖）发展的一类不对称合成催化剂 BL 丁内酯 BLE 丙酮-二苯胺高温缩合物 BLP 粉末涂料流平剂 BMA 甲基丙烯酸丁酯 BMC 团状模塑料 BMU 氨基树脂皮革鞣剂 BN 氮化硼
Bn 苄基 BNE 新型环氧树脂 BNS β－萘磺酸甲醛低缩合物 BOA 己二酸辛苄酯 BOC 叔丁氧羰基（常用于氨基酸氨基的保护）BOP 邻苯二甲酰丁辛酯 BOPP 双轴向聚丙烯 BP 苯甲醇 BPA 双酚A BPBG 邻苯二甲酸丁（乙醇酸乙酯）酯 BPF 双酚F BPMC 2-仲丁基苯基-N-甲基氨基酸酯 BPO 过氧化苯甲酰 BPP 过氧化特戊酸特丁酯 BPPD 过氧化二碳酸二苯氧化酯 BPS 4，4’-硫代双（6-特丁基-3-甲基苯酚）BPTP 聚对苯二甲酸丁二醇酯 Bpy 2,2'-联吡啶 BR 丁二烯橡胶 BRN 青红光硫化黑 BROC 二溴（代）甲酚环氧丙基醚 BS 丁二烯-苯乙烯共聚物 BS-1S 新型密封胶 BSH 苯磺酰肼 BSU N，N’-双（三甲基硅烷）脲 BT 聚丁烯-1热塑性塑料 BTA 苯并三唑 BTX 苯-甲苯-二甲苯混合物 Bu 正丁基 BX 渗透剂 BXA 己二酸二丁基二甘酯 BZ 二正丁基二硫代氨基甲酸锌 Bz 苯甲酰基 C c- 环－ CA 醋酸纤维素 CAB 醋酸-丁酸纤维素 CAM 甲基碳酰胺 CAN 硝酸铈铵 CAN 醋酸-硝酸纤维素 CAP 醋酸-丙酸纤维素 Cat. 催化 CBA 化学发泡剂 CBz 苄氧羰基
关于荧光染(资料集合)
关于荧光染料（资料集合） ●人肉眼对光源波长的颜色感觉 红色770-622 nm 橙色622~597 nm 黄色597~577 nm 绿色577~492 nm 蓝靛色492～455nm 紫色455～350nm ●理想的荧光染料一般具有以下几个特点： 1.具有高的光子产量，信号强度高； 2.对激发光有较强的吸收，降低背景信号； 3.激发光谱与发射光谱之间距离较大，减少背景信号的干扰； 4.易与被标记的抗原、抗体或其他生物物质结合而不影响被标记物的特异性； 5.稳定性好，不易受光、温度、PH、标本抗凝剂和固定剂的影响。 ●染料在生物化学中最早的应用是直接对切片进行染色，然后进行观察。随着生物技术、计算机技术以及荧光光谱测定技术的不断发展，许多染料尤其是荧光染料在细胞检测、肿瘤基因蛋白分析、毒物分析、临床医疗诊断等方面得到了广泛的应用。 荧光染料泛指吸收某一波长的光波后能发射出另一大于吸收光波长的光波的物质。利用荧光染料进行抗体标记分析在现代生物免疫学领域中应用广泛，并逐步显示出明显的优越性。 下面简要介绍应用于标记抗体的荧光染料及其种类： 1.荧光素类染料，包括异硫氰酸荧光素(FITC)、羟基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)等及其类似物。这是一类具有较多苯环的化合物。应用最广泛的是FITC(如图为FITC标记的组织荧光图)，在488nm 处由氩离子激光激发，发射525nm的蓝绿色荧光。FITC能够与各种抗体蛋白结合，并在碱性溶液中稳定呈现蓝绿色荧光。 2.罗丹明类染料，包括红色罗丹明（RBITC）、四甲基罗丹明（TAMRA）、罗丹明B（TRITC）等。TRITC在550nm处被激发可发射出570nm的黄色荧光。 3.Cy系列菁染料，菁染料通常有两个杂环体系组成，包括Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7及其类似物。 4.Alexa系列染料，它是由MolecularProbes开发的系列荧光染料。其激发光和发射光光谱覆盖大部分可见光和部分红外线光谱区域，应用广泛。以高亮度、稳定性、仪器兼容性、多种颜色、pH值不敏
荧光染料基础知识大全
荧光染料基础知识大全 益阳纺织染整团队今天 荧光显微镜技术的基本原理是借助荧光剂让细胞成分呈现高度具体的可视化效果，比如在目的蛋白后面连一个通用的荧光蛋白—GFP。在组织样本中，目的基因无法进行克隆，则需要用免疫荧光染色等其他技术手段来观察目的蛋白。为此，就需要利用抗体，这些抗体连接各种不同的荧光染料，直接或间接地与相应的靶结构相结合。此外，借助荧光染料，荧光显微镜技术不只局限于蛋白质，它还可以对核酸、聚糖等其他结构进行染色，即便钙离子等非生物物质也可以检测出来。 1免疫荧光 (IF) 在荧光显微镜技术中，可以通过两种方式观察到你的目的蛋白：利用内源荧光信号，即通过克隆手段，用遗传学方法将荧光蛋白与目的蛋白相连；或利用荧光标记的抗体特异性结合目的蛋白。 有些生物学问题采用第二种方法会更有用或更有必要。比如，组织学样品无法使用荧光蛋白，因为通常来说，标本都是从无法保存荧光蛋白的生物体中获取。此外，当有一个有功能的抗体可用时，免疫荧光法会比荧光蛋白技术快很多，因为后者必须先克隆目的基因再将DNA转染到适当的细胞中。 荧光蛋白的另一项劣势在于其本身属于蛋白质。因此，细胞内的这些荧光蛋白具有特定的蛋白质特性，其会导致附着的目的蛋白质发生功能紊乱或出现误释的情况。然而，荧光蛋白技术仍然是观察活细胞的首选方法。 免疫荧光法利用了抗体可以和相应抗原特异性结合的这个特性，对此它还有两种不同的表现形式。最简单的方式是使用可与目的蛋白相结合的荧光标记抗体。这种方法被称为“直接免疫荧光法”。 在很多情况下，我们可以利用两种不同特性的抗体。第一种抗体可以结合目的蛋白，但其本身并未进行荧光标记（一抗）。第二种抗体本身就携带荧光染料（二抗），并且可以特异性结合一抗。这种方法被称为“间接免疫荧光法”。 这种方法存在诸多优势。一方面，它会产生放大效应，因为不只一个二抗可以与一抗相结合。另一方面，没有必要始终用荧光染料标记目的蛋白的每个抗体，但可以使用市售荧光标记的二抗。免疫荧光中广泛使用的荧光染料包括FITC、TRITC 或一些Alexa Fluor?染料，下文均有提及。 2FITC 和TRITC 异硫氰酸荧光素(FITC) 是一种有机荧光染料，目前，这种荧光染料仍用于免疫荧光和流式细胞术中。在495/517 nm 处，该染料会产生激发/发射峰值，并可借助异硫氰酸盐反应基团与不同抗体结合，该基团可以和蛋白质上的氨基、巯基、咪唑、酪氨酰、羰基等基团相结合。 而它的基本成分——荧光素，其摩尔质量为332 g/mol，常被用作荧光示踪剂。FITC(389 g/mol) 是用于荧光显微镜技术的首批染料，且其被当成Alexa Fluor?488 等后续荧光染料的发端。该染料的荧光活性取决于它的大共轭芳香电子系统，而该系统受蓝色光谱中的光所激发。
荧光机理
1光致电子转移(PET) 光致电子转移是指电子给体或电子受体受光激发后，激发态的电子给体与电子受体之间发生电子转移从而导致荧光的淬灭过程。具体PET过程如下:在光激发下，具有电子给予能力的键合基团能够将其处于最高能级的电子转入激发态下荧光基团空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁到原基态轨道发射荧光，从而导致荧光的淬灭;当键合基团与底物结合后，降低了键合基团的给电子能力，抑制了PET过程，荧光基团中被光激发的电子可以直接跃迁回到原基态轨道，从而增强了的荧光基团的荧光发射。因此在未结合底物前，传感器分子表现为荧光淬灭，一旦键合基团与底物相结合，荧光基团就会发射荧光(见图) 由于与客底物结合前后的荧光强度差别很大，呈现明显的“关”、“开”状态，因此这类荧光化学传感器又被称为荧光分子开关。PET荧光分子传感器的作用机制可由前线轨道理论来进一步说明(见图1.5)。 2002年Nolan 小组合成了手性的二氮杂环-9-冠-3 衍生物化合物1，它是第一个用来检测Li+的PET 荧光探针[56]。在乙腈溶液中，相较于其它碱金属和碱土金属，能够高选择性的识别锂离子。用280 nm 光激发，不断向溶液中加入
LiClO4，化合物 1（Φ = 0.022）对Li+的滴定表现出 5 倍荧光信号增强效应，表明从胺的冠醚到荧光团的电子转移，荧光量子效率升高（Φ = 0.11），形成 1 : 1 的配合物，结合常数 log β = 5.4。 Gunnlaugsson, Bichell, Nolan, A Novel Fluorescent Photoinduced Electron Transfer (PET) Sensor for Lithium [J]. Tetrahedron Lett., 2002, 43, 4989-4992. NH H 3C O HN CH 3 O N O N ×× PET PET Li + Bozdemir, Altan Sozmen, Fazli Buyukcakir, et al. Reaction-Based Sensing of Fluoride Ions Using Built-in Triggers for Intramolecular Charge Transfer and Photoinduced Electron Transfer[J]. Organic Letters, 2010, 12(7) : 1400-1403. 2010年Akkaya 等[18]通过在BODIPY 的中位引入一个含三异丙基硅烷的酚盐基团,已知酚盐是强的给电子基团,当被硅烧保护后,酚盐的强给电子能力被抑制,即PET 现象被抑制,所以探针2在与F 离子作用之前发出很强的荧光,当探针与F-离子作用之后,硅浣保护基团被去除,酚盐的强给电子能力恢复,发生PET 现象,荧光被淬灭。在F-离子的浓度达到0.5mM 时,探针的荧光被完全淬灭。
常见荧光基团
Dihydrorhodamine 123 二氢罗丹明123 Tetramethylrhodamine-6-maleimide 四甲基罗丹明-6-马来酰亚胺 Tetramethylrhodamine-5-maleimide 四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺 5--IAF ,5-Iodoacetamidofluorescein 5-吲哚乙酰氨基荧光素 6-TET 6-羧基-2',4,7',7-四氯荧光素琥珀酰亚胺酯 BIS[N,N-BIS(CARBOXYMETHYL)AMINOMETHYL]FLUORESCEIN TETRASODIUM SALT 双[NN-双(羧甲基)氨甲基]荧光素四钠盐 Fluorescein-5-maleimide 荧光素-5-马来酰亚胺 5-FITC cadaverine 5-异硫氰酸荧光素尸胺 Sulforhodamine G 磺基罗丹明G 7-Hydroxy-4-methylcoumarin 7-羟基-4-甲基香豆素 3-Cyano-7-hydroxycoumarin 3-氰基-7-羟基香豆素 Fluorescein, disodium salt 荧光素二钠盐 Fluorescein 荧光素 6-FAM phosphoramidite 5'-荧光素氨基磷酸酯 6-TRITC四甲基罗丹明-6-异硫氰酸 6-Carboxy-X-rhodamine, succinimidyl ester 6-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯 5-Carboxy-X-rhodamine, succinimidyl ester 5-羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯 6-Carboxy-X-rhodamine 6-羧基-X-罗丹明 5-TAMRA, 5-Carboxytetramethylrhodamine, succinimidyl ester 5-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯 6-TAMRA, 6-Carboxytetramethylrhodamine 6-羧基四甲基罗丹明 5-TAMRA, 5-Carboxytetramethylrhodamine 5-羧基四甲基罗丹明 6-CR6G, 6-Carboxyrhodamine 6G 6-羧基罗丹明6G 5-FITC, luorescein-5-isothiocyanate 异硫氰酸荧光素 6-FAM,succinimidyl ester 6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 5-FAM,succinimidyl ester 5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 5-FAM 5-羧基荧光素 6-FAM 6-羧基荧光素 Rhodamine B 罗丹明B Rhodamine 6G 罗丹明6G AMC, 7-Amino-4-methylcoumarin 7-氨基-4-甲基香豆素 Cy3,succinimidyl ester Cy3,succinimidyl ester Cy3 Cy3 AP2635 Cy5,,succinimidyl ester Cy5,,succinimidyl ester Cy5 Cy5
荧光蛋白(整理)
荧光 一、定义 荧光（fluorescence ）又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。 二、原理 光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。 荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。大多数情况下，发光波长比吸收波长较长，能量更低。但是，当吸收强度较大时，可能发生双光子吸收现象，
导致辐射波长短于吸收波长的情况发射。当辐射波长与吸收波长相等时，既是共振荧光。 荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消光系数的乘积决定，与成像检测灵敏度密切相关。 三、荧光蛋白 1、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP） 在光谱的绿光区（500nm-525nm）已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的Aequorea 、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。然而多数有齐聚反应，即使最好的荧光蛋白与EGFP相比，也没有明显的优点。或许目前活细胞成像最好的选择是GFP衍生的Emerald（祖母绿），它与EGFP的特性相似。Emerald包含F64L 和S65T突变，另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以及亮度。虽然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些环境下其定量成像会受到影响。 下面主要介绍GFP及其衍生型荧光蛋白： （1）来源 绿色荧光蛋白最早由美籍日裔科学家下村修于1962年在水母中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。在水母中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为。 （2）性质 GFP由238个氨基酸残基组成。GFP序列中的65-67位残基（Ser65-Tyr66-Gly67）可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮GFP的激发光谱在400nm附近有
荧光定量PCR中探针的荧光修饰基团
荧光定量PCR中探针的荧光修饰基团 1. 荧光定量PCR两种方法 荧光定量PCR技术是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA 的含量等。为了达到高效反应，应将实时PCR应用的引物设计为能生成短的扩增子。常用的方法有SYBR Green的荧光染料法和TaqMan探针法，两种方法的特点及应用如下表： 名称SYBR Green染料法TaqMan探针法 引物一对特异性的引物一对特异性的引物和一条探针 原理SYBR Green一种DNA结合染料，能非特异 地掺入到DNA双链的小沟当中去，在游离状 态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链 DNA中以后，便可以发出荧光。 探针的5’端有一荧光报告基团，3’端有一荧光淬灭 基团，当两个基团相互先靠近的时候，由于发生能 量传递作用，报告基团不能发出荧光，但随着扩增 反应的进行，5’端的报告基团随着探针的水解而脱落 下来，不再与淬灭发生能量传递作用，从而能发出 荧光，被信号探测器所捕获。 特点从实验成本来讲，SYBR Green是最好的， 普通PCR加上一点SYBR Green荧光染料 即可，其信号强度也很好，还可以进行融解 曲线分析等， 但缺点是只能在一个反应管内进行一种 PCR反应的检测，出现非特异扩增会影响 到定量结果的可靠性与重复性。 由于增加了探针的特异性，因此其扩增曲线反映的 就是特异性产物的扩增曲线，不含有非特异性扩增 的成分，其敏感性要比SYBR Green高出10倍。其 缺点在于探针成本较高，有时设计的探针并不合适， 有造成损失的可能性。并且要进行较多的实验条件 的优化。 扩增长度SYBR Green法不超过500 bp，一般选择 250-400bp，过大会影响到PCR扩增的效率， 过小则很难通过融解曲线与引物二聚体分 开。 TaqMan法的扩增片段都很小，几十或是100多，一 般不超过300，通常为80－150bp。 适用实验该法的最大优点就是可以与任意引物、模板 相配合，用于任意反应体系中，如需要检测 的基因很多，而每个反应管中进行一种PCR 反应的检测可以满足实验要求，则SYBR Green是最好的选择。 如果需要进行多通道实验，或是检测很多相同样本 的同一基因，最常用的是TaqMan探针法。 2.TaqMan探针
荧光光谱基础知识
荧 光 光 谱(Fluorescence Spectroscopy ) 韩荣成(10303023) 北京大学,03级生物医学工程 一、背景知识： 1.荧光，是指物质在吸收紫外光后发出的波长较长的紫外荧光或可见荧光，以及吸收波长较短的可见光后发出波长较长的可见荧光。除了紫外荧光和可见荧光，还有红外荧光、X 射线荧光等。 在很多情况下，分子从激发态回到基态过程中，能量通过热量等形式散失到周围。但 是在某些情况下，能量能以光子发射的形式释放出来。 分子的能量状态在光学分析中涉及的分子能量有：E 0=Ee+Ev+Er ，其中Ee:价电子运动能（electron ）； Ev ：原子在平衡位置的振动能（vibration ）；Er ：分子绕其重心的转动能（rotation ）。Ee 大 约为1eV 数量级；Ev 大约为10－1～10－2 eV ；Er 大约为10－4～10－5eV 数量级， 可见⊿Ee>⊿Ev>⊿ Er 分子吸收能量后，处于激发态的分子通过非辐射过程丢失能量，首先到达S1的最低振动能 级，这一过程称为内转换（internal conversion）,发生在10－11s内。从S1的最低振动能级以光子形式放出能量而回到基态的不同振动能级，这一过程称为荧光 （fluorescence）,发生在10－9s内；如果以非辐射的形式丢失能量则称为淬灭 （quenching）。如果某种物质在被某种波长的光照射以后能在较长的时间内发出比
荧光波长更长的波长的光，则称这种光为磷光。磷光产生的机制与荧光是不同的，虽然它们都属于发射光谱，但磷光不是处于第一电子激发态的最低振动能级的分子直接释放出光子回到基态的结果，而是从某种能量低于第一电子激发态的最低振动能级的另一种亚稳能级?三重态向基态的各振动能级以辐射方式产生跃迁时发出的光。 所谓三重态或三线态，是指分子中电子自旋量子数S=1，即原来两个配对的自旋 方向相反的电子之一自旋方向改变，以至电子自旋之和不为0的情况。处于第一电子激发态最低振动能级的分子，有可能通过无辐射跃迁(系间交连，intersystem crossing)消耗部分能量，其中一个电子的自旋方向倒转，从而处于三线态。从三线态的最低振动能级向基态的各振动能级跃迁并释放出光子，则其发光为磷光。由于三线态的电子自旋和不为零，这种跃迁是一种被禁跃迁，即跃迁几率很小。这样， 在三线态停留的时间即寿命就比较长(从10-3秒到数秒)，强度很弱。由于三线态能 量低于第一电子激发态最低振动能级，因此磷光的波长比荧光长。 二、荧光光谱： 荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作 用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率；发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况， 也就是荧光中不同波长的光 成分的相对强度。 激发谱既然是表示某种荧光 物质在不同波长的激发光作 用下所测得的同一波长下荧 光强度的变化，而荧光的产生 又与吸收有关，因此激发谱和 吸收谱极为相似，呈正相关。 由于激发态和基态有相似的 振动能级分布，而且从基态的 振动能级跃迁到基态各振动能级的几率也相近，因此吸收谱与发射谱呈镜象对称关系.λex:maximum excitation wavelength; λem(λax): maximum emissio wavelength 最低振动能级跃迁到第一电子激发态各振动能级的几率与由第一电子激发态的最低n
常见荧光基团
Diｈydrorhodamine１２３二氢罗丹明123 Tetｒamethｙlｒhoｄamine-6-ｍａｌeimiｄe四甲基罗丹明-6－马来酰亚胺?Tetｒamethｙlrhodaｍine-5-ｍaleimidｅ四甲基罗丹明-5-马来酰亚胺?５--IAF ,５-Iｏdoacetａmｉdofluoreｓcein ５－吲哚乙酰氨基荧光素 ６－TET 6-羧基－2＇，4，7'，7-四氯荧光素琥珀酰亚胺酯 BIS[N,Ｎ-BIＳ(ＣARBOXYMETHYL)ＡＭＩＮOMETHYL]FLＵOＲESCＥIN TETRASOＤIＵＭSALT 双[NN-双（羧甲基)氨甲基］荧光素四钠盐 Fｌuoｒｅｓｃein-5-maｌｅimｉde 荧光素-5－马来酰亚胺?５-FＩＴCｃａdavｅrｉｎe５－异硫氰酸荧光素尸胺?Sulｆoｒｈoｄamｉne G 磺基罗丹明G ?７-Ｈydroxｙ-４-meｔhylｃｏｕmarin 7-羟基- 3－Cyano-７-hyｄroxycoumarｉn ３-氰基－７-羟基香豆素?Ｆｌuorescｅｉｎ,dｉ４-甲基香豆素? sodium sａlt 荧光素二钠盐?Fluorｅｓcｅｉn 荧光素 6-Ｃaｒb 6-TRＩTC四甲基罗丹明-6-异硫氰酸? ６-ＦAM pｈosphoramiｄiｔe 5'－荧光素氨基磷酸酯? ｏxy－X-rｈodamiｎｅ, succiniｍiｄylｅster 6-羧基-X－罗丹明琥珀酰亚胺酯 ５-Carbｏxy-X-rhodamine, succinimidyl esｔｅr 5-羧基-X－罗丹明琥珀酰亚胺酯 6-Caｒbｏxｙ-X－rhoｄaｍine 6－羧基-Ｘ-罗丹明 5－ＴAMRＡ，5-Carboｘyｔeｔrａmｅthyｌｒhodamｉne, succinｉmidyl ester 5-羧基四甲基罗丹明琥6－TAMRＡ, 6-Caｒｂoxyｔetraｍethylｒhodamine 6－羧基四甲基罗丹明?５－ＴAＭRＡ, 珀酰亚胺酯? 5－Caｒboｘｙtｅtｒａmethylrhｏｄamine 5-羧基四甲基罗丹明?６－CR6G, 6-Caｒboxyｒhｏdaminｅ5－FＩTＣ, luoｒescｅｉn-５-isoｔhｉocyａｎａtｅ异硫氰酸荧光素 6G 6－羧基罗丹明6Ｇ? 5－FＡM,suｃciniｍiｄｙl eｓｔer 6-ＦＡM,ｓuｃcｉnimｉｄyl ester6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯? 5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯?５-FＡＭ5-羧基荧光素?６－FAＭ６-羧基荧光素 Rｈodａｍｉne B 罗丹明B ?Rｈodａmine6G 罗丹明６G ＡMC, 7-Ａmiｎo-4-mｅtｈyｌｃｏumａrｉn ７－氨基-4-甲基香豆素?Cy3,sｕｃcｉnｉmidｙl ｅster Cy3,succiniｍiｄｙl ester?Ｃｙ３Cy3 AP2６35 Cy5,,suｃｃiｎiｍidyl esｔer Ｃｙ５,,ｓｕｃcinｉmiｄyl esｔer ?Cｙ5 Cy5 1,3-二苯基异苯并呋喃(0Ｆ3Ｔ） 罗丹明B
荧光物质的基本性质
荧光：荧光，又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。在日常生活中，人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光，而不去仔细追究和区分其发光原理。 应用：采用荧光标记的链终止剂所得到的DNA测序图 用于对DNA进行自动测序的链末端终止法：在原初的方法中，需要对DNA的引物端进行荧光标记，以便在测序凝胶板上确定DNA色带的位置。在改进的方法中，对作为链终止剂的４种双脱氧核苷酸（ddTBP）分别进行荧光标记，电泳结束后不同长度的DNA分子彼此分开，经紫外线照射，４种被标记的双脱氧核苷酸发出不同波长的荧光。通过分析荧光的光谱便可以分辨出DNA的序列。DNA探测：溴化乙啶是一种荧光染料，当它在溶液中自由改变构型时，只能发出很弱的荧光；当它嵌入核酸双链的碱基对之间与DNA分子结合后，便可以发出很强的荧光。因此在凝胶电泳中，一般加入溴化乙啶对DNA染色。DNA微阵列（生物芯片）：需要对基因组探针进行荧光标记，最后通过荧光信号确定靶标序列。免疫学中的免疫荧光检查法：对抗体进行荧光标记，从而可以根据荧光的分布和形态确定抗原的部位和性质。流式细胞仪（又称荧光激活细胞分选器，FACS）：对样本细胞进行荧光标记，再用激光束激发使之产生特定的荧光，然后用光学系统检测并将信号传输到计算机进行分析，从而得到细胞相应的各种特性。荧光技术还被应用于探测和分析DNA及蛋白质的分子结构，尤其是比较复杂的生物大分子。水母发光蛋白最早是从海洋生物水母（Aequorea victoria）中分离出来的。当它与Ca离子共存时，可以发出绿色的荧光。这一性质已经被应用于实时观察细胞内Ca离子的流动。水母发光蛋白的发现推动了人们进一步研究海洋水母并发现了绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）。绿色荧光蛋白的多肽链中含有特殊的生色团结构，无需外加辅助因子或进行任何特殊处理，便可以在紫外线的照射下发出稳定的绿色荧光，作为生物分子或基因探针具有很大的优越性，所以绿色荧光蛋白及相关蛋白已经成为生物化学和细胞生物学研究的重要工具。萤光显微成像技术：全内反射荧光显微镜很多生物分子具有内禀的荧光性，不需要外加其他化学基团就可以发出荧光。有时侯这种内禀的荧光性会随着环境的改变而改变，从而可以利用这种对环境变化敏感的荧光性来探测分子的分布和性质。例如胆红素与血清白蛋白的一个特殊位点结合时，可以发出很强的荧光。又如当血红细胞中缺少铁或者含有铅时，会产生出锌原卟啉而不是正常的血红素（血红蛋白）；锌原卟啉具有很强的荧光性，可以用来帮助检测病因。
荧光蛋白--(整理)
荧光蛋白--(整理)
荧光 一、定义 荧光（fluorescence ）又作“萤光”，是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。 二、原理 光照射到某些原子时，光的能量使原子核周围的一些电子由原来的轨道跃迁到了能量更高的轨道，即从基态跃迁到第一激发单线态或第二激发单线态等。第一激发单线态或第二激发单线态等是不稳定的，所以会恢复基态，当电子由第一激发单线态恢复到基态时，能量会以光的形式释放，所以产生荧光。 荧光是物质吸收光照或者其他电磁辐射后发出的光。大多数情况下，发光波长比吸收波长较长，能量更低。但是，当吸收强度较大时，可能发生双光子吸收现象，导致辐射波长短于吸收波长的情况发射。当辐射波长与吸收波长相等时，既是共振荧光。 荧光强度：荧光强度与该种物质的荧光量子产率、消光系数以及含量等因素有关。荧光量子产率Q：量子产率表示物质将吸收的光能转化为荧光的本领，是荧光物质发出光子数与吸收光子数的比值。荧光蛋白分子的亮度由其量子产率与消
光系数的乘积决定，与成像检测灵敏度密切相关。 三、荧光蛋白 1、绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP） 在光谱的绿光区（500nm-525nm）已经发现了多种荧光蛋白，而且来源广泛，包括不同种属的Aequorea 、桡足类动物、文昌鱼以及珊瑚。然而多数有齐聚反应，即使最好的荧光蛋白与EGFP相比，也没有明显的优点。或许目前活细胞成像最好的选择是GFP衍生的Emerald（祖母绿），它与EGFP的特性相似。Emerald包含F64L和S65T突变，另外还有四个点突变从而改进了折叠、37℃时的突变率以及亮度。虽然Emerald比EGFP更有效，但含有快速光漂白成分，可能在某些环境下其定量成像会受到影响。 下面主要介绍GFP及其衍生型荧光蛋白： （1）来源 绿色荧光蛋白最早由美籍日裔科学家下村修于1962年在水母中发现。这种蛋白质在蓝色波长范围的光照激发下发出绿色荧光，其发光过程需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，而且，这个冷光蛋白质可与钙离子（Ca2+）相互作用。在水母中发现的野生型绿色荧光蛋白的分子量较小，仅为27~30kDa，而编码GFP的基因序列也很短，为2.6kb。 （2）性质 GFP由238个氨基酸残基组成。GFP序列中的65-67位残基（Ser65-Tyr66-Gly67）可自发形成荧光发色基团——对羟基苯咪唑啉酮GFP的激发光谱在400nm附近有一个主激发峰，在470nm附近有一个次激发峰。发射光谱在505nm附近有一尖锐的主发射峰，在540nm附近有一肩峰GFP的化学性质相当稳定，无光漂白现象（Photobleaching），用甲醛固定和石蜡包埋亦不影响其荧光性质。在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色荧光蛋白基因常被用作报告基因。 （3）野生型 野生型GFP（wild type GFP, wtGFP）从一开始就引起了人们极大的兴趣，而且被用作新型的简单报告基因及体内标记，但GFP在异源生物体中的表达并非那么简单。例如，研究人员很早就发现需要在较高的温度下孵育才能在细胞或生物体中表达GFP，并且wtGFP在37℃的热稳定性差。这些都阻碍了它在转基因中的应用。这些难题促使人们进一步筛选分离wtGFP的变体。现在，人们已经找到了荧光强度更强且更耐热的变体。这些变体多数为经突变的脱辅基蛋白，它们可防止高温导致的错误折叠。近年来出现的新型wtGFP基因突变体的激发和发射谱发生了改变，热稳定性和荧光强度得到了提高，GFP报告基因在小鼠中的应用就是以这些变体作为基础的。 （4）增强型绿色荧光蛋白（EGFP） 现在，应用最为广泛的是红移变体增强型GFP（EGFP）。诸如EGFP这些红移变体的最大激发峰发生红向移动，大约为490nm，这一波长也恰好是多数分光设备、
荧光材料文献综述
一、荧光材料的种类与特性 总的说来，荧光材料分有机荧光材料和无机荧光材料。 有机荧光材料又有有机小分子发光材料和有机高分子光学材料之分。有机小分子荧光材料种类繁多，它们多带有共轭杂环及各种生色团，结构易于调整，通过引入烯键、苯环等不饱和基团及各种生色团来改变其共轭长度，从而使化合物光电性质发生变化。如恶二唑及其衍生物类，三唑及其衍生物类，罗丹明及其衍生物类，香豆素类衍生物，1,8-萘酰亚胺类衍生物，吡唑啉衍生物，三苯胺类衍生物，卟啉类化合物，咔唑、吡嗪、噻唑类衍生物，苝类衍生物等。它们广泛应用于光学电子器件、DNA诊断、光化学传感器、染料、荧光增白剂、荧光涂料、激光染料[7]、有机电致发光器件(ELD)等方面。但是小分子发光材料在固态下易发生荧光猝灭现象，一般掺杂方法制成的器件又容易聚集结晶，器件寿命下降。因此众多的科研工作者一方面致力于小分子的研究，另一方面寻找性能更好的发光材料，高分子发光材料就应运而生了。 有机高分子光学材料通常分为三类：(1) 侧链型：小分子发光基团挂接在高分子侧链上，(2) 全共轭主链型：整个分子均为一个大的共轭高分子体系，(3) 部分共轭主链型：发光中心在主链上，但发光中心之间相互隔开没有形成一个共轭体系。目前所研究的高分子发光材料主要是共轭聚合物，如聚苯、聚噻吩、聚芴、聚三苯基胺及其衍生物等。还有聚三苯基胺，聚咔唑，聚吡咯，聚卟啉[8]及其衍生物、共聚物等，目前研究得也比较多。 常见的无机荧光材料有硫化物系荧光材料、铝酸盐系荧光材料、氧化物系荧光材料及稀土荧光材料等。 碱土金属硫化物体系是一类用途广泛的发光基质材料[8211 ] 。二价铕掺杂的CaS 及SrS 可以被蓝光有效激发而发射出红光,因而可用作蓝光L ED 晶片的白光L ED 的红色成分,可制造较低色温的白光L ED ,其显色性明显得到改善,目前使用的红粉硫化物体系主要是(Ca1-X ,SrX ) S : Eu2+ 体系,在蓝区宽带激发,红区宽带发射。通过改变Ca2+ 的掺杂量,可使发射峰在609～647 nm 间移动。共掺杂Er3 + , Tb3 + ,Ce3 +等可增强红光发射。 铝酸盐系荧光材料中SrAl2O4, CaAl2O4, BaAl2O4为常用的发光基质。 例如，Sr3A12O6 是一种新型红色荧光粉,它的激发峰位于460～470nm 范围内, 是与主峰为465nm 的蓝光L ED 晶片相匹配的红色荧光材料。刘阁等[31 ] 利用水热沉淀法合成了Sr3A12O6 。通过对其纯相粉末的荧光性质的研究,发现 该荧光粉样品的最大激发峰位于459nm 波长处且在415nm 波长处有一小的激发峰。而样品的发射带落在615～683nm 的波长范围内, 其中最大发射峰的波长位于655nm 处, 表明在459nm 波长的光激发下,样品能够发出红色光。 氧化物荧光材料在荧光粉中的应用较多。如，以ZnO 作为基质合成的红色荧光 材料稳定性很好。红色荧光材料ZnO : Eu ,Li 和ZnO :Li + 的最晶片的发L ED 紫光370nm ～365与,范围内370nm ～340大激发峰范围都在． 射峰大部分相交,因而适用于三基色白光L ED 制造。 稀土离子因其具有特殊的电子结构和成键特征，故能表现出独特的荧光性质，而通过与配体的作用，又可以在很大程度上增强它的荧光强度，因此稀土配合物的研究为荧光材料分子的设计提供了广阔的前景。近些年来，人们分别从制备与表征方面对镧系荧光材料进行了比较多的研究。