(完整版)脲和盐酸胍在包涵体蛋白质提纯中的作用(精)
包涵体的形成原因及其处理方法
2. 4
复性包涵体蛋白
2. 1
破碎细菌细胞
提取包涵体时 , 首先要 裂解 细菌 , 为了 防止 在裂 解细 菌 的过程中目的蛋 白质 变性 , 常常 采取 一些 保护措 施 : 合适 的 缓冲体系 , 如磷酸 盐缓 冲液、 T r is 缓冲 液、 柠檬 酸缓 冲 液 ; 加 入保护剂 , 如还原剂 DDT ( 2- 巯基苏糖醇 ) 、 2- 巯基乙醇 ; 加
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#上海畜牧兽医通讯∃
2009 年第 1 期
包涵体的形成原因及其处理方法
邝爱丽 陈圆圆 彭志峰 郑鹿平 付仁一 徐 雪 郭伦涛 王川庆 ( 河南农业大学牧医工程学院 河南 郑州 450002 )
*
பைடு நூலகம்
20 世纪 90 年代以来 , 基因重组技术得到很大的发展 , 越 来越多的工程菌 ( 或工 程细胞 ) 被构建。 大肠 杆菌表 达系 统 是目前最常用的外 源蛋白 表达 系统。大 肠杆 菌由于 遗传 背 景清楚 , 容易培养以及有大量可供选 择的克隆载 体与表达 载 体 , 使之成为人 们克 隆表达 外源 基因的 主要 细菌 1 。 然而 , 在实践过程中 , 一个十分棘手的问题 是许多外源 基因在大 肠 杆菌、 酵母等表达体系中表达时 , 往往以包 涵体形式 存在 , 高 效表达的重组蛋 白在 细胞 内凝集 , 形 成不 溶的、 无活 性的 固 体颗粒。一般含有 50 % ( 质 量分数 ) 以上 的重组 蛋白 , 其 余 为核糖体元 件、 RNA 聚合酶、 内毒 素、 外 膜蛋白、 环 状或缺 口 的质粒 DNA , 以及脂体、 脂多 糖等 , 大小 为 0. 5~ 1 m, 具 有 很高的密度 ( 约为 1. 3 mg/ ml) , 无 定形 , 非水溶 性 , 可溶于 变 性剂如尿素、 盐酸胍等。因此如何分 离纯化这些 工程菌所 表 达的重组蛋白则是基因工程技术产业化 所面临的重 要问题。 这一工艺过程复 杂 , 需要 较高的 技术 和先 进的设 备条 件 , 且 无固定模式可以 借鉴 , 主 要靠经 验和 实践 摸索 , 具有 很高 的 挑战性。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤?1、包涵体的洗涤问题?通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
?包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
?2、如何得到比较纯的包涵体?对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和?NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50?mM?NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3?mM。
去垢剂如Triton?X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp?T(37?KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
?对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
<包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3 mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体旳纯化和复性总结ﻫ二、包涵体旳洗涤ﻫ1、包涵体旳洗涤问题ﻫ一般旳洗涤措施一般是洗不干净旳,我此前是这样做旳，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充足,过滤除去未溶解旳物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳,如此类推可以始终稀释到合适旳浓度，你可以找到一种合适清除杂质旳措施，其实这就是梯度沉淀旳措施，我觉得比一般旳直接洗脱效果好。
ﻫﻫ包涵体一般难溶解,因此你要注意未溶解旳部分,你可以跑电泳对比，由于有时候难溶解旳就是你旳目旳蛋白，因此每次解决都要把上清和沉淀跑电泳对比,免得把目旳蛋白弄丢了。
ﻫ此外刚解决完旳包涵体好溶解。
冷冻后难溶解,溶解也需要长点时间,也需要大量旳溶剂。
如果说是不少不溶解旳不是你要旳，那就不用管了。
２、如何得到比较纯旳包涵体对于包涵体旳纯化,包涵体旳前解决是很重要旳。
ﻫ包涵体中重要具有重组蛋白,但也具有某些细菌成分,如某些外膜蛋白、质粒ＤＮA和其他杂质。
洗涤常用1%如下旳中性去垢剂，如Ｔwｅen、Trｉton、Ｌuｂｅｌ和ＮP40等加ＥDＴA和还原剂２-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加5０ mM ＮaCL。
这样提取旳包涵体纯度至少可达50％以上，并且可保持元构造。
也可用低浓度旳盐酸胍或尿素/中性去垢剂/ＥDTＡ/还原剂等洗去包涵体表面吸附旳大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液ｐH以与工程菌生理条件相近为宜，使用旳还原剂为0.1-5ｍM。
EDTA为0.1-0.3 mＭ。
去垢剂如Tｒiton X-1０0、脱氧胆酸盐和低浓度旳变性剂如尿素充足洗涤清除杂质，这一步很重要,由于大肠杆菌外膜蛋白Oｍp T(37 KDa)在4-8mｏｌ/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体旳溶解和复性过程中可导致重组蛋白质旳降解。
对于尿素和盐酸胍旳选择:尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强旳可逆性变性作用,所需浓度尿素8－10Ｍ，盐酸胍6-8M。
包涵体的纯化和复性总结__最全的前人经验
包涵体的纯化和复性总结二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。
包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。
此外刚处理完的包涵体好溶解。
冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。
如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。
2、如何得到比较纯的包涵体对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。
包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。
EDTA为0.1-0.3 mM。
去垢剂如Triton X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp T(37 KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。
对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素及盐酸胍对蛋白的变性作用机制
尿素及盐酸胍对蛋白的变性作用机制
简单地说，尿素和盐酸胍在高浓度(4～8mol/L)水溶液时能断裂氢键,从而使蛋白质发生不同程度的变性.同时,还可通过增大疏水氨基酸残基在水相中的溶解度,降低疏水相互作用.
在室温下4～6mol/L尿素和3～4mol/L盐酸胍,可使球状蛋白质从天然状态转变至变性状态的中点,通常增加变性剂浓度可提高变性程度,通常8mol/L尿素和约6mol/L盐酸胍可以使蛋白质完全转变为变性状态.盐酸胍由于具有离子特性,因而比尿素的变性能力强.一些球状蛋白质,甚至在8mol/L尿素溶液中也不能完全变性,然而在8mol/L盐酸胍溶液中,它们一般以无规卷曲(完全变性)构象状态存在.
尿素和盐酸胍引起的变性包括两种机制:
第一种机制是变性蛋白质能与尿素和盐酸胍优先结合,形成变性蛋白质-变性剂复合物,当复合物被除去,从而引起N→D反应平衡向右移动.随着变性剂浓度的增加,天然状态的蛋白质不断转变为复合物,最终导致蛋白质完全变性.然而,由于变性剂与变性蛋白的结合是非常弱的.因此,只有高浓度的变性剂才能引起蛋白质完全变性;第二种机制是尿素与盐酸胍对疏水氨基酸残基的增溶作用.因为尿素和盐酸胍具有形成氢键的能力,当它们在高浓度时,可以破坏水的氢键结构,结果尿素和盐酸胍就成为非极性残基的较好溶剂,使之蛋白质分子内部的疏水残基伸展和溶解性增加. 尿素和盐酸胍引起的变性通常是可逆的,但是,在某些情况下,由于一部分尿素可以转变为氰酸盐和氨,而蛋白质的氨基能够与氰酸盐反应改变了蛋白质的电荷分布.因此,尿素引起的蛋白质变性有时很难完全复性. 还原剂(半胱氨酸,抗坏血酸,β-巯基乙醇,二硫苏糖醇)可以还原二硫交联键,因而能改变蛋白质的构象.。
蛋白质、包涵体复性
目录一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用二、包涵体变复性三、包涵体洗涤纯化——7~10四、包涵体提出、纯化和复性一、二、包涵体变复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。
基本信息中文名称包涵体变复性复性方法稀释复性原因基因工程菌的表达产率过高包涵体变性破菌洗涤溶解目录1包涵体2包涵体变性3包涵体复性包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
包涵体的形成原因主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
(整理)包涵体表达的蛋白的复性
包涵体表达的蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
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脲和盐酸胍在包涵体蛋白质提纯中的作用
脲和盐酸胍
变性剂如脲和盐酸胍等可使蛋白质结构中的氢键发生断裂，这增加了非极性分子包括氨基酸侧链的溶解度，减少了疏水相互作用；脲还可以深入到蛋白质分子的内部影响蛋白质分子的密堆积。
此外，去污剂、有机溶剂、重金属、热、机械力、冷冻、超声、高压、辐射等均可引起蛋白质的变性。
这些变性均不会破坏蛋白质的共价键而是只涉及到氢键、盐键、疏水相互作用、范得华相互作用等次级键的破坏。
有些变性的蛋白质当变性因素被除去后又可自动地恢复到天然状态，这种现象称为蛋白质的复性(renaturation)，这种复性即蛋白质折叠研究中的重折叠(refolding)。
（1931年吴宪提出的蛋白质变性学说）
包涵体蛋白质提纯
大多数在pH8的条件下，一般用强的变性剂如尿素（6-8mol/L）、盐酸胍（GdnHCl 5~8mol/L 或6mol/L），通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。
或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。
用TritonX-100来溶解Zymononas mobilis levansucrase包涵体蛋白。
另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。
还有有机溶剂、碱性环境（大于9）或酸（70%甲酸）也可使之溶解。
在变性液中需加入还原剂，如2－巯基乙醇(β-ME)、二硫苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、还原型的谷胱甘肽（GST）、半胱氨酸。
还原剂的使用浓度一般是50-100mM β-ME或DTT，也有文献使用5mM浓度。
还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。
对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。
同时还需加入金属鳌合剂如EDTA或EGTA，以鳌合Cu2+、Fe2+等金属离子，防止已经处于还原状态的巯基与之发生氧化反应。
变性剂溶解后，蛋白质失去了生物学活性。
蛋白质的变性(denaturation)
▪定义：
蛋白质在某些理化因素作用下，特定的空间结构被破坏而导致其原有的理化性质改变及生物学活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性作用。
变性后的蛋白质称为变性蛋白质。
能引起蛋白质变性的化学试剂称为变性剂。
▪使蛋白质变性的理化因素
•物理因素：加热、紫外线、X线、超声波、剧烈振荡等
•化学因素：强酸、强碱、生物碱试剂、重金属盐、高浓度尿素、盐酸胍、有机溶剂等。
▪蛋白质变性的本质
最早对蛋白质变性本质作出解释的是我国生化学家吴宪教授，他早在1931年就指出：蛋白质变性就是它的肽链从卷曲至伸展的过程。
以后几十年的研究都证明了该学说。
变性因素只破坏了主要的次级键，但不涉及肽键断裂，即变性只破坏了蛋白质的空间结构，但不影响一级结构，换句话说，变性的蛋白质其分子组成和分子量与变性前相比较均未改变。