葡萄球菌属的常规鉴定标准操作程序
葡萄球菌属鉴定
敏感：抑菌圈直径≥16mm 耐药： 抑菌圈直径<16mm
医学检验学院
讨论:
做触酶试验时应注意哪些问题。
试述血浆凝固酶试验的原理、检测方法和用 途。 试述金黄色葡萄球菌的主要鉴定依据。 如何鉴定致病性葡萄球菌。
10
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葡萄球菌属鉴定
实验目的
掌握葡萄球菌的鉴定方法 熟悉葡萄球菌的菌落特点 熟悉葡萄球菌的菌体形态
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1. 菌种
金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌 腐生葡萄球菌
2. 试剂（1）革兰染色液 （2） 3％H2O2（临用时现配）、新鲜兔血浆 （或人血浆）
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3
操作步骤
1、形态观察
＋
（1）触酶试验原理：葡萄球菌属均可产生触酶 触酶
2[O]
触酶
取菌
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（2）血浆凝固酶试验原理：病原性葡萄球菌产生 血浆纤维蛋白原 方法：
生理盐水 血浆
血浆凝固酶
纤维蛋白
取待检菌混匀
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（3）新生霉素敏感试验 待检菌涂布
5¼ g/片 新生霉素纸片 35℃，16h～20h
观察抑菌圈大小
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取菌 NS
革兰染色
革兰阳性球菌， 散在或呈不规则葡萄状排列。
镜检
2、菌落观察 待检菌划Fra bibliotek接种医学检验学院
血琼脂平板
普通琼脂平板
35℃ 培养1 8h～2 4h
观察菌落
（各三块）
3．生化反应 H2O2 2[O]
方法：
3%H2O2
1 2 3 4 1 2 3 4
30”
医学检验学院 H2O O2 (产生气泡）
葡萄球菌属检验
精心整理1．概述葡萄球菌属是一类触酶试验阳性的革兰阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、中间型葡萄球菌等35个种，17个亚种。
金黄色葡萄球菌是最重要的致病葡萄球菌。
2.标本类型血液、尿液、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。
3.鉴定3.1形态与染色革兰阳性球菌，成单、双、短链或不规则葡萄状排列。
3.2培养特性金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上的典型菌落为金黄色，周围有明显的 溶血环，部分菌落也可呈灰白色或柠檬色。
在高盐甘露醇平板上呈淡橙黄色菌落。
表皮葡萄球菌在血琼脂平板上菌O/F试”为3.5.1涂片、染色观察菌落特征，在血平板上挑取可疑菌落，涂片染色镜检。
3.5.2触酶试验参见《触酶试验标准操作规程》。
3.5.3凝固酶试验参见《凝固酶试验标准操作规程》。
3.5.4鉴定从血琼脂平板上挑取纯菌落，用微生物鉴定仪或传统生化反应进行细菌鉴定。
4.药敏参见《药物敏感性试验标准操作规程》及CLSIM100-S20最新版本文件。
5.质量控制参见《质量管理程序》。
6.检验结果解释与分析6.1由于葡萄球菌分布广泛，从临床标本中分离到金黄色葡萄球菌时，将其定为致病菌时应慎重。
精心整理应根据凝固酶试验进一步确认。
对可疑菌株的鉴定，最好利用商品化的鉴定系统根据生化图谱进行确定。
表皮葡萄球菌分离自导管相关血流感染时，通常视为致病菌。
溶血性葡萄球菌从泌尿感染病人分离得到时，尤其是细菌量较大或作为优势菌时，通常被视为致病菌。
6.2甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA）对多种广谱强效抗菌药物呈多重耐药性。
如果检测出耐甲氧西林的葡萄球菌菌株则报告耐所有青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类和?-内酰胺药/?-内酰胺酶抑制剂类抗生素，对氨基糖苷类和大环内酯类抗生素常协同耐药。
若葡萄球菌属对四环素敏感，则对多西环素和米诺环素敏感。
某些菌对四环素中介或耐药，而对多西环素和米诺环素敏感。
临床感染葡萄球菌的病人用喹诺酮类治疗3-4日后，原来敏感的葡萄球菌易产生耐药。
金黄色葡萄球菌检验步骤
金黄色葡萄球菌检验步骤一.设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ 。
2 冰箱：2 ℃ ~5 ℃ 。
3 恒温水浴箱：37 ℃±1 ℃ 。
4 天平：感量0.19 。
5 均质器。
6 振荡器。
7 无菌吸管：1 mL （具0.01mL 刻度）、10mL （具0.lmL 刻度）或微量移液器及吸头。
8 无菌锥形瓶：容量100 mL 、500 mL 。
9 无菌培养皿：直径90 mm 。
10 注射器：0.5 mL 。
11 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
二、培养基和试剂1 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤2、7.5%氯化钠肉汤3 血琼脂平板4 Baird - Parker 琼脂平板5 脑心浸出液（BHI）肉汤6 兔血浆7 磷酸盐缓冲液8 营养琼脂斜面9 革兰氏染色液10 无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中，121 ℃ 高压灭菌15 min 。
11 1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠（NaOH ）溶于1 000 mL 蒸馏水中。
12 1 mol/L 盐酸（HCL ) : 37 ％浓盐酸90 mL ，加蒸馏水到1 000 mL 。
操作步骤5.1 样品的稀释5.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品至盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min~10 000r/min 均质1 min~2 min ，或放人盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min ~2 min ，制成1 : 10 的样品匀液。
5.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品至盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1 : 10 的样品匀液。
5.2 增菌和分离培养5.2.1 增菌培养：吸取5 mL 上述样品匀液，接种于50 mL 7.5 ％氯化钠肉汤或10 ％氯化钠胰酪胨大豆肉汤培养基内，36 ℃±1 ℃培养18h ~24h 。
葡萄球菌属鉴定
葡萄球菌属鉴定一、目的对某一细菌的鉴定水平，可提供以下几方面的价值：（1）决定治病方法；（2）作流行病学研究；（3）了解细菌与感染的关系；（4）进行学术交流。
二、原理根据葡萄球菌的形态染色、培养特性、生化反应、抗原构造等将葡萄球菌由属鉴定到具体种类。
三、标本不同病种及不同检查目的而定，可为脓汁、渗透液、咽拭子、血、脑脊液、食物、呕吐物、粪便等，置于无菌瓶内送检。
四、试剂及器材革兰氏染液、培养皿、培养瓶、生化鉴定管、血浆、玻片、接种针（环）、酒精灯等。
五、鉴定程序标本涂片、染色痰、脓汁、血、脑脊液粪便、呕吐物平皿可凝菌落纯培养涂片、染色、触酶实验葡萄状（G+）、触酶（+）血浆凝固酶、葡萄糖甘露醇分解、高盐耐受实验甘露醇分解（需O2、甘露醇分解（—）厌O2均+）血浆凝固酶（+）、新生霉素（+）血浆凝固酶（—）新生霉素S R表皮葡萄球菌腐生葡萄球菌六、质量控制每周进行一次葡萄球菌标准菌株的革兰氏染色、触酶、血浆凝固酶及新生霉素实验。
七、实验室解释及临床意义1、葡萄球菌广泛存在于自然界，医院内葡萄球菌的存在成为院内交叉感染的重要因素。
2、葡萄球菌是化脓性感染的重要病原菌。
3、葡萄球菌引起尿路感染的比例很大。
八、安全防护措施在操作过程中，要穿好工作衣，戴好口罩、手套，必要时戴眼罩，严格按操作规程，结束后，用次氯酸溶液（0.2%）擦拭实验台、显微镜手柄、载物台，浸泡手，然后紫外线消毒30分钟。
九、标本处理废弃标本，培养基等统一由专门人员高压消毒处理。
十、参考文献诊断细菌学，李仲兴等主编、第一版、香港、黄河文化出版社，1992。
微生物金黄色葡萄球菌的操作规程
凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，血浆凝固酶实验阳性，可报告检出金黄色葡萄球菌。
5.4血琼脂培养1采样方法见GB18204.4-2013附录A
6.2将1ml样品放入9ml氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤培养基中，36℃培养24h。
6.3从培养液中取1接种环-2接种环，划线接种在Baird Parker平板或用血琼脂培养基，于36℃培养24h。在Baird Parker平板培养基上菌落为圆形、光滑、凸起湿润、颜色呈黑灰色、边缘整齐、周围浑浊、外层有一透明带；在血琼脂平板上菌落呈圆形、金黄色、凸起、表面光滑、周围有溶血圈。
6.4挑取典型菌落作涂片染色镜检，为革兰氏阳性，呈葡萄状排列。
6.5血浆凝固酶实验：吸取1:4新鲜血浆0.5ml放入灭菌小试管中，再加入待测检菌24h肉汤培养物0.5ml。混匀，放36℃温箱或水浴锅中，每30min观察1次，24h之内如呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5ml，分别加入小试管内与1:4血浆0.5ml混匀，作为对照。
四、设备和材料
4.1恒温培养箱
4.2电炉或微波炉。
4.3恒温水浴箱
4.4显微镜
4.5天平
4.6离心机
4.7高压灭菌锅
4.8无菌试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等。
4.9PH计或PH试纸。
4.10载玻片
4.11酒精灯
五、培养基和试剂
5.1胰酪胨大豆肉汤
5.2氯化钠肉汤（75g/L）
5.3Baird Parker平板
作业指导书1
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版本号/修订状态：
金黄色葡萄球菌的测定
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实施日期：
金黄色葡萄球菌国家标准检验方法
金黄色葡萄球菌国家标准检验方法一、国家标准检验办法参见GB 4789.10-2010《食品平安国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验》其次法和第三法。
1、Baird-Parker平板计数（其次法）本办法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中金黄色葡萄球菌的计数。
1.1、检验流程 1.2、试验步骤 (1）样品的稀释①固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL 缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000-10000r/min均质1-2min，或置盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1：10的样品匀液。
②液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品，置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。
③用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL，沿管壁缓慢注于盛有9mL 稀释液的无菌试管中（注重吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使其混合匀称，制成1：100的样品匀液。
④按③操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。
每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或吸头。
(2）样品的接种按照对样品污染情况的估量，挑选2-3个相宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在举行10倍递增稀释时，每个稀释度分离吸取1mL样品匀液以0.3mL, 0.3mL, 0.4mL接种量分离加入三块Baird-Parker平板，然后用无菌L棒涂布囫囵平板，注重不要触及平板边缘。
用法前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25-50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消逝。
(3）培养在通常状况下，涂布后，将平板静置l0min，如样液不易汲取，可将平板放在培养箱（(36±1)℃培养1h；等样品匀液汲取后翻转平皿，倒置于培养箱，(36±1)℃培养，45一48h。
葡萄球菌的鉴定
血浆凝 固酶
甘露醇 发酵
金葡
表葡
腐生
（4）新生霉素敏感试验
血平板 菌悬液涂布 5ug/L新生霉素纸片 35℃孵育16~18h S:抑菌圈直径>16mm，R:≤16mm
结果 ATCC25923 表葡 S R
腐生
阳性结果 （S）
实验七 葡萄球菌鉴定
检验系微生物教研室
（一）葡萄球菌检验程序
脓液、咽拭子、穿刺液 尿液、痰液脑脊液血液粪便、呕吐 物
直接涂片染色
初报
分离培养 （血平板）
分离培养
增菌培养 （高盐甘露醇 平板）
涂片染色 触媒 血浆凝固酶 甘露醇发酵 耐热核酸酶 其他鉴定试验
取可疑菌落
鉴定试验
药敏试验
报告
（二）目的要求
培养基：血琼脂平板，MH琼脂，甘露醇发酵管 试剂：生理盐水，3%H2O2,EDTA抗凝兔血浆，革兰染液，
新生霉素纸片、头孢西丁、红霉素、克林霉素纸片 其他：酒精灯，接种环，接种针，玻片，显微镜，孵箱等
（四）步骤方法
1.细菌菌落特征观察：
大小 形态 光泽 表面 边缘 透明度 颜色 溶血 金葡 表葡 腐生
玻片法
【操作】取兔血浆和生理盐水各1滴分别滴于载玻 片上，用接种环挑取细菌，混合后观察。
【操作】
试管法
（3）甘露醇发酵试验：
【原理】致病性葡萄球菌多含有分解甘露醇的酶类， 能发酵甘露醇产酸，培养基由紫色变为黄色。
【操作】细菌分别接种甘露醇单糖发酵管，经35℃ 孵育18-24h观察结果。
【结果】金葡为阳性，表皮、腐生为阴性
H2O2
H2O + O2
葡萄球菌属检验
1 •概述葡萄球菌属是一类触酶试验阳性的革兰阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、中间型葡萄球菌等35个种，17个亚种。
金黄色葡萄球菌是最重要的致病葡萄球菌。
2.标本类型血液、尿液、脑脊液、穿刺液、脓液等标本。
3.鉴定3.1形态与染色革兰阳性球菌，成单、双、短链或不规则葡萄状排列。
3.2培养特性金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上的典型菌落为金黄色，周围有明显的［溶血环，部分菌落也可呈灰白色或柠檬色。
在高盐甘露醇平板上呈淡橙黄色菌落。
表皮葡萄球菌在血琼脂平板上菌落为白色或柠檬色，多数不溶血。
3.3生化反应金黄色葡萄球菌触酶试验阳性，分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和甘露醇，不分解棉子糖和水杨苷，明胶、血浆凝固酶和DNA酶试验阳性，七叶苷试验阴性。
3.4 鉴别要点3.4.1本菌属特征革兰阳性球菌，呈葡萄状排列，触酶试验阳性。
金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上菌落呈金黄色或白色，DNA酶和血浆凝固酶试验均阳性，发酵苷露醇。
3.4.2与微球菌属的鉴别葡萄球菌属葡萄糖0/F试验为发酵型，镜下以葡萄状排列为主，菌体较小，而微球菌属为氧化型或无反应，镜下以四联排列为主，且菌体较大。
3.4.3与链球菌属的鉴别葡萄球菌属0/F试验为发酵型，触酶试验阳性，链球菌属葡萄糖0/F试验为氧化型，触酶试验阴性。
3.4.4凝固酶试验阳性葡萄球菌的鉴别见下表1。
表1凝固酶阳性葡萄球菌鉴别的关键性试验半乳糖菌名凝固酶触酶溶血硝酸盐海藻糖苷酶金黄色葡萄球菌金黄色亚种+ + + + + - 金黄色葡萄球菌厌氧亚种+ - + - - - 施氏葡萄球菌聚集亚种+ + + + - ND 中间葡萄球菌+ + d + + + 海豚葡萄球菌+ + + + - ND S.lutrae + + + + + + 猪葡萄球菌 d + - + + -注：“ + ”为90%以上菌株为阳性，“为90%以上菌株为阴性，“d”为11%-89%阳性，“ND 为无资料。
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葡萄球菌属的常规鉴定标准操作程序
1 概述
葡萄球菌属是一类触媒试验阳性的革兰阳性球菌，包括金黄色葡萄球菌，表面葡萄球菌、腐生葡萄球菌等32个种。
是临床最常见的化脓性球菌，广泛分布于自然界中，在人体表面鼻、咽、肠道也经常存在。
2 形态与染色
革兰阳性球菌，直径0.4~1.2µm成单、双、短链或不规则状排列。
在液体培养基浓汁标本中，往往排列成双或短链状多数有鞭毛。
3 培养特性
金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上典型菌落为金黄色，周围有明显的透明（β）溶血环，部分菌落呈橙色，在高盐甘露醇平板上呈橙色菌落。
表皮葡萄球菌等其他葡萄球菌在血琼脂平板上菌落为白色或柠檬色，不溶血。
4 生化反应
触酶试验阳性，多数能分解葡萄糖、麦蚜糖、蔗糖和甘露醇。
不分解棉籽糖和水杨苷，液化明胶，血浆凝固酶和DNA酶实验分阳性。
5 鉴别要点
5.1 本菌属特征：触酶实验阳性，革兰阳性球菌，葡萄状排列，菌落中等大小，中等干燥。
5.2 与微球菌属的鉴别：触酶实验都为阳性，但O∕F试验葡萄球菌属为发酵型，而微球菌为氧化型或无反应，而且菌体较葡萄菌属更大，排列呈四联状为主。
5.3 与链球菌属的鉴别：葡萄球菌属触酶试验都为阳性，而链球菌为阴性，O∕F试验葡萄球菌属为发酵型而链球菌为氧化型。
5.4 凝固酶阳性葡萄球菌的鉴别见下表。
结合型凝游离型凝鸟氨酸脱
菌名PYP试验DNA试验VP试
验
固酶试验固酶试验
羧酶实验
金黄色葡萄球菌+ + - + + -
中间型葡萄球菌- + + + - -
施氏葡萄球菌+ - + + + -
路邓葡萄球菌+ - + - + +
注：“+”为90%以上菌株为阳性，“--”为90%以上菌株为阳性。
5.5 凝固酶阳性葡萄球菌的鉴别见下表
+
腐生葡萄球菌——+ V + +
—
溶血葡萄球菌+ ——V + —
—
人型葡萄球菌——+ —+ —
—
华纳葡萄球菌——+ V + ——
模仿葡萄球菌+ —+ + + ——
头状葡萄球菌——V + + ——
耳葡萄球菌V ———V ——
施氏葡萄球菌+ + —————
路邓葡萄球菌+ V V — + —V
注：“+"为90%以上菌株为阳性，“—”为90%以上菌株为阴性。
6 细菌鉴定与药物敏感试验
6.1 取平板上菌落直接涂片、革兰染色并镜检，葡萄球菌为革兰阳性球菌。
呈单个、成双或葡萄状排列，菌体呈圆形。
6.2 在血琼脂平板上，成圆形、凸起、边缘整齐、表面光滑、湿润德不透明菌落，可产生脂溶性色素，在血琼脂平板上部分葡萄球菌表现为β溶血。
6.3 触酶试验（3%过氧化氢试验）阳性。
发酵葡萄糖产酸。
6.4 血浆凝固酶试验（用混合德人血浆）。
6.4.1 试管法：检测分泌型凝固酶：取1：4枸橼酸钠抗凝血浆0.5ml，加入3~5个菌落，35℃培养箱4~6小时，观察血浆有无凝固发生，凝固者为阳性，若阴性，继续观察到24小时，不凝固者为阴性，试验应同时作阴性、阳性对照。
6.4.2 玻片法：检测结合凝固酶，但要注意假阳性和假阴性的出现。
6.5 取纯化后的单个菌落，用Vitek2系统GPS药敏卡进行细菌鉴定和药敏试验，如有必要加入做补充试验。
6.6 耐苯唑西林的金黄色葡萄球菌为MRSA，耐苯唑西林的凝固酶阴性葡萄球菌为MRSCN。
也可选头报西丁来检测MRSA和MRSCN。
7 检验结果分析与报告
金黄色葡萄球菌在任何标本中分离出都要及时鉴定报告，输液管、人工植入组织分离的表皮葡萄球菌和尿液中的腐生葡萄球菌视为病原菌；凝固酶阴性
感染鉴定到种；注意MRS的报告。
根据NCCLS标准，如果该菌β-内酰胺酶阳性，则应报告该菌对所有的青霉素类、大多数一代头孢菌素耐药，治疗时建议临床
医师选择含酶抑制的复合抗生素或对该酶稳定的药物；如该菌MRS阳性，则应报告该菌对所有β-内酰胺酶类抗生素（包括含抑酶剂复合剂）耐药，要注意其他药物的多重耐药性。
8 临床意义
葡萄球菌属在自然界分布很广，大部分无致病性。
金黄色葡萄球菌是最重要的治病性葡萄球菌，以金黄色葡萄球菌代表的致病性葡萄球菌寄人类化脓性感染中最重要的病原菌，能引起多组织、多系统尤其是深部组织的化脓性感染，另外还可以引起心内膜炎、败血症等全身感染，现在临床中凝固酶阴性的葡萄球菌感染上升，是医院感染的重要病原菌，另外MRSA和MRSCN感染也呈上升趋势，是医院感染的主要问题，应该足够重视。