中药材DNA条形码分子鉴定指导原则
中药材dna条形码分子鉴定指导原则
中药材dna条形码分子鉴定指导原则【知识文章】中药材DNA条形码分子鉴定指导原则导语：中药材是中国传统独特的资源，其药材种类繁多，但存在着品质和真伪鉴定等难题。
中药材的分子鉴定指导原则，通过应用DNA条形码技术，可以有效提高中药材鉴定的准确性和可靠性。
本文将介绍中药材DNA条形码分子鉴定原理及其应用，并探讨其在传统中药材鉴定中的价值和前景。
一、DNA条形码技术简介DNA条形码技术是一种利用物种特异性基因序列进行组织或生物样本分类和鉴定的技术。
其基本原理是通过放大目标DNA片段，并根据其序列差异性进行比对，从而实现物种鉴定。
DNA条形码技术具有高保真性、高重复性和高鉴定率等优点，成为生物多样性研究的重要工具。
二、中药材DNA条形码分子鉴定的原理中药材DNA条形码分子鉴定主要是利用基因序列的遗传差异作为鉴定依据。
在大量中药材样本中，选择一段特定的核酸序列作为DNA条形码，如ITS2（内转录间隔区）、rbcL（Rubisco大亚基）、matK(maturase K)等。
使用PCR技术从不同药材样本中扩增目标基因片段，测定其序列，并将其与参考数据库中的已知序列进行比对和匹配，从而进行中药材的鉴定。
三、中药材DNA条形码分子鉴定的应用1. 提高鉴定准确性和可靠性：传统的中药材鉴定方法受制于样品的形态学差异和外部环境因素，鉴定结果常受到人为主观因素的干扰。
而DNA条形码技术通过分子水平的信息，弥补了传统鉴定方法的不足，提高了鉴定的准确性和可靠性。
2. 探寻中药材资源：DNA条形码技术可以追踪和识别中药材的基因信息，帮助发现和保护珍稀的中药材资源。
通过对中药材进行DNA条形码分析，可以确定其真正的品种和产地，为中药材资源的可持续利用提供科学依据。
3. 提高市场监管和品质保障：中药材市场普遍存在品质和真伪问题，影响了消费者的信心。
中药材DNA条形码分子鉴定技术可以快速检测中药材的真伪，提供可靠的品质鉴定和来源溯源，有助于改善市场监管和品质保障体系。
中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则及其在《中国药典》(20重点
中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则及其在《中国药典》(20重点DNA条形码分子鉴定法是一种基于DNA序列的分子鉴定方法，广泛应用于物种鉴定、中药材真伪鉴定等领域，并已在《中国药典》(20重点)中得到重要的应用。
以下将介绍中药材DNA条形码分子鉴定法的指导原则及其在《中国药典》(20重点)中的具体应用。
1.样本选择：选择符合《中国药典》(20重点)规范的中药材样本，同时保证样本的完整性和纯度。
如有需要，可以根据实际情况对样本进行处理，如去除外部的附着物等。
2.DNA提取：选择适宜的DNA提取方法，根据样本的不同特点和纯度要求，选择合适的提取试剂盒和操作流程，提取出高质量的DNA。
3.DNA扩增：根据《中国药典》(20重点)中药材的DNA条形码序列，选择适宜的引物，进行PCR扩增。
在扩增过程中，注意控制扩增反应的条件，选择合适的PCR仪和反应体系，保证扩增的特异性和可重复性。
4.序列读取和比对：对扩增得到的DNA序列进行测序，选择合适的测序平台和方法，确保测得的序列质量高。
将测序得到的序列与相关数据库中的已知序列进行比对，找到最佳匹配的物种。
5.鉴定结果验证：对鉴定结果进行验证，如测序重复性验证、鉴定结果与形态学特征的对比等，确保鉴定结果的准确性和可靠性。
《中国药典》(20重点)作为中药材质量评价的权威参考，对于中药材DNA条形码分子鉴定法的应用也给出了明确的指导和要求。
《中国药典》(20重点)中明确了中药材DNA条形码分子鉴定法的使用范围和方法，规定了鉴定所需的样本数量、测序平台的选择、引物的设计和数据库比对的要求等。
此外，根据中药材DNA条形码分子鉴定法的特点和应用需求，还可以结合其他分子鉴定方法，如SNP分析、核糖体DNA序列鉴定等，进一步提高中药材的鉴定准确性和可靠性。
综上所述，中药材DNA条形码分子鉴定法作为一种重要的中药材质量评价手段，已在《中国药典》(20重点)中得到明确的指导和应用。
DNA分子标记在中药材鉴定中的应用研究
DNA分子标记在中药材鉴定中的应用研究一、本文概述中药材作为中华传统医学的瑰宝，其品质与真伪直接关系到患者的疗效与健康。
然而，随着市场需求的增加，中药材的掺假、混淆现象日益严重，因此，中药材的鉴定成为了中医药领域的重要研究课题。
近年来，DNA分子标记技术的快速发展为中药材鉴定提供了新的解决方案。
本文旨在探讨DNA分子标记在中药材鉴定中的应用，以期为提高中药材品质、保障患者用药安全提供科学依据。
本文首先介绍了中药材鉴定的传统方法及其局限性，包括形态学鉴定、化学鉴定等，并指出了这些方法在面临复杂中药材鉴定时的不足。
随后，详细介绍了DNA分子标记技术的基本原理、分类及其在中药材鉴定中的应用案例。
通过对比分析，本文阐述了DNA分子标记技术在中药材鉴定中的优势，如准确性高、稳定性好、操作简便等。
在此基础上，本文进一步探讨了DNA分子标记技术在中药材鉴定中的具体应用，包括中药材真伪鉴别、品种鉴定、产地溯源等方面。
本文也关注了DNA分子标记技术在应用中面临的挑战与问题，如技术成本、操作标准化等，并提出了相应的解决策略。
本文总结了DNA分子标记技术在中药材鉴定中的应用价值及前景，认为随着技术的不断完善与成本的降低，DNA分子标记技术将在中药材鉴定中发挥越来越重要的作用，为保障中药材品质、促进中医药产业健康发展提供有力支持。
二、DNA分子标记技术概述DNA分子标记技术，也被称为DNA指纹技术，是一种通过直接分析生物体DNA序列的多态性来鉴定生物种类和个体间遗传差异的方法。
该技术基于DNA分子的独特性质，如高度的稳定性、个体间的特异性以及可遗传性等，为中药材鉴定提供了新的视角和有效手段。
DNA分子标记技术的核心在于通过特定的方法识别DNA序列中的多态性，这些多态性可以是单核苷酸多态性（SNP）、插入或删除、倒位、易位等。
这些多态性在DNA序列中形成独特的“标记”，可以作为鉴定生物种类和个体间遗传关系的依据。
在中药材鉴定中，DNA分子标记技术具有显著的优势。
中药材DNA条形码鉴定研究进展
中药材DNA条形码鉴定研究进展近年来，随着DNA条形码技术的快速发展，中药材DNA条形码鉴定研究也取得了长足的进展。
中药材是中医药学的重要组成部分，其安全性和有效性对于患者的治疗非常重要。
因此，确保中药材的质量和真实性成为了一个迫切的问题。
DNA条形码鉴定技术以其高分辨率、高灵敏度和快速的特点，成为中药材鉴定领域的重要手段。
DNA条形码是通过分析中药材基因组DNA的一小段特定基因序列来进行鉴定的。
目前，主要有两种方法用于中药材DNA条形码的鉴定。
一种是对整个基因组进行测序，然后通过进行分子鉴定比对来确定中药材的物种；另一种是通过选取一个或多个具有高变异性的基因进行快速测序，以从而判断中药材的真实性。
DNA条形码鉴定技术在中药材鉴定中的应用已取得了一些重要的进展。
首先，通过对中药材的DNA条形码进行比对，可以准确鉴定中药材的种属。
例如，对于那些外形相似但植物学特征不同的中药材，如桂枝和白花蛇舌草，通过DNA条形码技术可以迅速鉴定它们的物种。
其次，通过DNA条形码技术还可以检测中药材的真实性。
许多中药材市场上存在着掺杂、替代和伪劣产品的问题，这给患者的治疗带来了很大的风险。
DNA条形码技术可以通过对中药材基因组DNA进行比对，准确判断中药材的物种，从而保证患者选择到真实的中药材。
虽然中药材DNA条形码鉴定技术在中药材质量鉴定中的应用前景广阔，但其中也存在一些挑战和问题。
首先，中药材的DNA条形码鉴定技术还处于起步阶段，研究较少，对于很多中药材的DNA条形码特征还不清楚。
其次，中药材的DNA条形码鉴定技术需要建立起一个全面的数据库，以便与标准样品进行比对。
然而，由于目前中药材种类繁多，对每个物种进行DNA条形码测序是一个巨大的工程。
最后，中药材的DNA条形码鉴定技术需要高质量的DNA样品，而中药材作为植物材料，其DNA样品的提取和质量保证也是一个挑战。
综上所述，中药材DNA条形码鉴定技术是中药材质量鉴定的重要手段。
2010药典第3增补本
一部修订附录ⅨT 甲醇量检查法ⅨU 二氧化硫残留量测定法ⅨQ 农药残留量测定法XVIII J-中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则-新增二部修订附录附录I A 片剂（增订口崩片）附录Ⅱ药用辅料附录Ⅵ G 黏度测定法附录Ⅸ B 澄清度检查法附录Ⅹ A 崩解时限检查法（增订口崩片检查法）附录ⅩK 锥入度测定法附录ⅩⅨ F 药品杂质分析指导原则二部新增附录附录ⅩⅨR 药用辅料性能指标研究指导原则附录ⅩⅧ J中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则1本法用于中药材(包括药材及部分药材饮片)及基原物种的鉴定。
DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。
由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四种碱基以不同顺序排列组成，因此对一定长度的DNA序列进行分析即能够区分不同物种。
中药材DNA条形码分子鉴定是以核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)注1为主体条形码序列鉴定中药材的方法体系，其中植物类中药材选用ITS2为主体序列，以叶绿体psbA-trnH 注2为辅助序列，动物类中药材采用细胞色素c氧化酶亚基I(COI)注3为主体序列，ITS2为辅助序列。
一、仪器的一般要求所用仪器有电子天平、离心机、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)仪、电泳仪和测序仪。
DNA序列测定用测序仪，是一台具有自动灌胶、自动进样、自动数据收集分析等全自动电脑控制的测定DNA片段中碱基顺序或大小，以及定量用精密仪器。
测序方法主要采用双脱氧链终止法，又称Sanger法，传统Sanger法采用同位素标记，目前常用的自动测序仪是基于毛细管电泳和荧光标记技术的DNA测序仪，从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。
4种双脱氧核苷酸(ddNTP)的碱基分别用不同的荧光进行标记，在通过毛细管时，不同长度的DNA片段上的4种荧光基团被激光激发，发出不同颜色的荧光，被电荷藕合元件图像传感器(charge-coupled device，CCD)检测系统识别，并直接翻译成DNA序列，获得供试品的峰图文件和序列文件。
DNA条形码技术在中药材鉴定中的应用
DNA条形码技术在中药材鉴定中的应用
DNA条形码技术是一种基于DNA序列的分子鉴定技术，可以通过对DNA序列的比对和分析，快速准确地鉴定物种的身份。
由于中药材的鉴定涉及众多物种和其混合体，传统的鉴定方法往往耗时费力，且易受到操作者主观因素的影响。
而DNA条形码技术通过分析DNA 序列，可以提供客观准确的鉴定结果，因此在中药材鉴定中具有广阔的应用前景。
DNA条形码技术可以用于中药材真伪鉴定。
中药材市场上常常存在着以次充好、混杂夹杂的情况，给消费者的权益造成了损害。
传统的鉴定方法需要对中药材的形态特征进行观察和比对，容易受到干扰和误判。
而DNA条形码技术可以在分子水平上鉴定中药材的真伪，不受外观特征的影响，提供客观准确的结果。
DNA条形码技术还可以用于中药材的质量控制。
中药材的质量控制是保证中药药效和安全性的关键环节。
传统的质量控制方法往往需要对中药材的化学成分进行分析，耗时费力且易受到多种因素的影响。
而DNA条形码技术可以通过对DNA序列的分析，提供客观准确的中药材质量信息，为中药材的质量控制提供科学依据。
DNA条形码技术在中药材鉴定中具有广泛的应用前景。
通过DNA条形码技术，可以快速准确地鉴定中药材的真伪和种属，并提供中药材质量控制的科学依据，从而保证中药的质量和安全性。
随着DNA条形码技术的不断发展和应用推广，相信其在中药材鉴定领域将发挥越来越重要的作用。
DNA条形码等分子鉴定技术与动植物类中药材的鉴定
·综述·ＤＮＡ条形码等分子鉴定技术与动植物类中药材的鉴定张国林 ，邢以文，薛满苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 ２１５０００［摘要］ 中药材鉴定是控制中药质量、确保用药安全与效果的首要环节。
ＤＮＡ分子鉴定是从基因层面上进行中药材鉴别的手段，准确率高。
ＤＮＡ分子鉴定包括电泳技术、免疫技术、随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、限制性内切酶片段长度多态性（ＲＦＬＰ）、扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ）、简单重复序列（ＩＳＳＲ）及ＤＮＡ条形码等，以ＤＮＡ条形码应用最为广泛。
ＤＮＡ条形码是基因组中相对较短的、可用于物种鉴定的特异性基因片段。
植物类中药材的条形码多选用核基因和叶绿体基因ＤＮＡ片段，如叶绿体ｐｓｂＡ ｔｒｎＨ基因、内转录间隔区（ＩＴＳ）、叶绿体核酮糖 １，５ 二磷酸羧化酶大亚基（ｒｂｃＬ）和ＲＮＡ转录体Ⅱ型内含子剪切酶基因（ｍａｔＫ）等；动物类中药材的条形码多来自核基因和线粒体基因ＤＮＡ，主要有线粒体细胞色素Ｃ氧化酶亚基１（ＣＯⅠ）、核糖体ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）和线粒体细胞色素ｂ基因（ＣｙｔＢ）等。
综述动植物类中药材ＤＮＡ分子标记与鉴定技术应用进展，并探讨ＤＮＡ条形码在药用动植物类中药材鉴定中存在的局限性及发展前景，为中药质量控制提供参考。
［关键词］ 条形码；核基因；叶绿体基因；线粒体基因；微条形码；复合条形码［中图分类号］ Ｒ２８２ ５ ［文献标识码］ Ａ ［文章编号］ １６７３ ４８９０（２０２１）０２ ０３８１ ０８ｄｏｉ：１０ １３３１３／ｊ ｉｓｓｎ １６７３ ４８９０ ２０２００２１６００１ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＮＡＢａｒｃｏｄｉｎｇａｎｄＯｔｈｅｒＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｎｉｍａｌａｎｄＰｌａｎｔＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＺＨＡＮＧＧｕｏ ｌｉｎ ，ＸＩＮＧＹｉ ｗｅｎ，ＸＵＥＭａｎＳｕｚｈｏｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌ，Ｓｕｚｈｏｕ２１５０００，Ｃｈｉｎａ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ ＴｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＴＣＭ）ｉｓｔｈｅｆｉｒｓｔｓｔｅｐｆｏｒｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ ＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｓａｍｅｔｈｏｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙＴＣＭｆｒｏｍｔｈｅｇｅｎｅｌｅｖｅｌｂｙｄｉｒｅｃｔｌｙａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｍａｔｅｒｉａｌｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｉｔｈａｓｈｉｇｈａｃｃｕｒａｃｙａｎｄｉｓｎｏｔｅａｓｙａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅ，ｔｉｓｓｕｅｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｓａｍｐｌｅｓｈａｐｅａｎｄｅｘｔｅｒｎａｌｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｆａｃｔｏｒｓ ＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｃｌｕｄｅｓｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ（ＲＡＰＤ），ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ），ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＡＦＬＰ），ｓｉｍｐｌｅｒｅｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＩＳＳＲ）ａｎｄＤＮＡｂａｒｃｏｄｅ，ａｍｏｎｇｗｈｉｃｈＤＮＡｂａｒｃｏｄｅｉｓｍｏｓｔｗｉｄｅｌｙａｄｏｐｔｅｄ ＤＮＡｂａｒｃｏｄｉｎｇｉｓａｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｓｈｏｒｔｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｓｅｇｍｅｎｔｉｎｇｅｎｏｍｅ，ｗｈｉｃｈｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｓｐｅｃｉｅｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＩｎｔｈｅｂａｒｃｏｄｅｏｆｐｌａｎｔｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｎｕｃｌｅａｒｇｅｎｅａｎｄｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｇｅｎｅＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓａｒｅｍｏｓｔｌｙｓｅｌｅｃｔｅｄ，ｓｕｃｈａｓｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｐｓｂＡ ｔｒｎＨｇｅｎｅ，ｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｉｎｇｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ），ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｒｉｂｏｋｅｔｏｓｅ １，５ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｌａｒｇｅｓｕｂｕｎｉｔ（ｒｂｃＬ）ａｎｄＲＮＡｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｒｔｙｐｅⅡｉｎｔｒｏｎｓｈｅａｒｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅ（ｍａｔＫ） ＩｎａｎｉｍａｌｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅｂａｒｃｏｄｅｍｏｓｔｌｙｃｏｍｅｓｆｒｏｍｎｕｃｌｅａｒｇｅｎｅａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｇｅｎｅＤＮＡ，ｍａｉｎｌｙｉｎｃｌｕｄｉｎｇｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｏｘｉｄａｓｅｓｕｂｕｎｉｔ１（ＣＯⅠ），ｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ（ｒＲＮＡ）ａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｂｇｅｎｅ（ＣｙｔＢ） ＤＮＡｂａｒｃｏｄｉｎｇｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｆａｓｔｅｓｔｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｉｎＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｗｈｉｃｈｐｌａｙｓａｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｌｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｉｍａｌａｎｄｐｌａｎｔＴＣＭ Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎａｎｉｍａｌａｎｄｐｌａｎｔｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｓｒｅｖｉｅｗｅｄ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ；ｎｕｃｌｅａｒｇｅｎｅ；ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｇｅｎｅ；ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｇｅｎｅ；ｍｉｃｒｏ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ；ｃｏｍｐｏｕｎｄｂａｒｃｏｄｉｎｇ［通信作者］ 张国林，副主任药师，研究方向：药品检验及质量控制；Ｔｅｌ：（０５１２）６６０９０２２９，Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｇｕｏｌｉｎ２００６＠１６３ ｃｏｍ由于中药材种类繁多、来源复杂及市场利益的驱使，中药材品种混淆、掺伪现象时有发生。
中草药DNA条形码分子鉴定：从基因到基因组
中草药 DNA条形码分子鉴定：从基因到基因组鉴定中药的“真伪优劣”是确保中药质量的关键所在, 而其中“真伪”更是中药临床用药安全的重要前提, 特别是针对贵重药材以及有毒中药而言。
DNA条形码作为一项快速准确鉴定物种的方法在药用植物基原以及药材鉴定中的应用已非常广泛。
通过构建标准的 DNA条形码参考数据库是该技术应用的主要形式。
尽管不同学者提出了诸多用于植物鉴定的DNA条形码 , 但由于片段长度的限制 , 单一序列或多序列组合的条形码在近缘种之间的鉴定仍有很大的局限性。
植物叶绿体基因组作为用于筛选DNA条形码序列的研究热点 , 其本身也可作为超级条形码 (Super barcode)用于系统进化、亲缘关系以及物种鉴定研究。
本研究围绕 DNA条形码鉴定技术 , 首先以《日本药局方》 ( 以下简称“药局方” ) 中收载的生药材为对象 , 构建了药局方生药DNA条形码分子鉴定系统；其次 , 选取人参属药用植物作为名贵药材代表、乌头属药用植物作为有毒中药代表, 分别对该技术在这两个属中的应用进行了研究；最后, 利用高通量测序技术测定了乌头属叶绿体基因组 , 为叶绿体基因组作为超级条形码奠定基础, 为筛选适合该属的高变异分子标记提供依据。
本研究主要内容及结论如下：1、建立了一套以 ITS2 序列为主 psbA-trnH序列为辅的汉方生药材标准DNA条形码数据鉴定系统。
该系统为用户提供了汉方草药信息查询、 DNA条形码物种鉴定以及从样品采集到数据分析的标准操作流程三项主要功能。
共搜集来自日本及中国不同地区的基原植物和生药材样本共计576 份, 从中获取的标准序列覆盖了97.3%的药局方 ( 十六版 ) 收载生药品种。
另外搜集了100份待测样本 , 用来检验数据库的鉴定效果。
通过 BLAST结果显示 ,100 份样品中有 71 份样品获得的结果与标签上所标注的物种一致 , 即准确鉴定到物种水平。
其余29 份样品鉴定到属水平。
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中药材DNA条形码分子鉴定指导原则1. 背景中药材存在多基原物种及同名异物、同物异名等问题，鉴于传统基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定方法存在局限性，为保证中药材临床应用安全、准确、有效，有必要增加中药材DNA条形码分子鉴定法。
2. 定义及原理DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。
由于DNA序列是由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)四种碱基以不同顺序排列组成，因此一定长度DNA序列能够区分不同物种。
中药材DNA条形码分子鉴定是以ITS2为主体条形码序列鉴定中药材的方法体系，其中植物类中药材选用ITS2为主体序列，psbA-trnH为辅助序列，动物类中药材采用COI为主体序列，ITS2为辅助序列，符合中药材鉴定简单、精确的特点，有明确的判断标准，能够实现对中药材及其基原物种的准确鉴定。
本指导原则用于规范中药材DNA条形码分子鉴定法，为其应用提供指导。
3. 适用范围适用于中药材(包括药材、药材粉末及部分药材饮片)及基原物种的鉴定。
4. 方法流程中药材DNA条形码分子鉴定法主要包括供试品处理、DNA提取、PCR扩增、测序、序列拼接及结果判定，以下内容详细说明各流程中的主要原理及注意事项。
1）供试品处理除特殊标明外，药材使用75%乙醇擦洗表面后晾干，称取10-100 mg备用。
具体见各药材项下。
2）DNA提取DNA的提取包括破碎细胞壁、释放DNA，DNA的分离和纯化，DNA的浓缩、沉淀与洗涤等基本步骤，目前常用试剂盒法，包括植物基因组DNA提取试剂盒和动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒。
由于植物类中药材种类繁多，可根据所研究中药材的具体情况对提取方法加以改进。
植物细胞内储存了大量次生代谢产物，如多糖、多酚等，这些物质在提取DNA的过程中与DNA共沉淀，形成粘稠的胶状物难以溶解或产生褐变，严重影响DNA提取的产量与质量，以及后续的PCR扩增实验。
β-巯基乙醇是抗氧化剂，在提取DNA过程中加入β-巯基乙醇，可以抑制氧化反应，避免褐化。
PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA提取过程中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
因此将PVP和β-巯基乙醇配合使用，能够有效地防止DNA提取过程中多酚及多糖的污染。
EDTA(乙二胺四乙酸)螯合Mg2+或Mn2+，抑制DNase(DNA酶)活性；CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与DNA形成复合物。
在天然状态下，DNA与蛋白质以DNP(DNA蛋白质复合物)的形式存在，CTAB 可使细胞中的DNA蛋白质复合物释放出来，该复合物在高盐溶液中(>0.7mol/L NaCl)能充分溶解，存在于液相中。
通过有机溶剂抽提，去除蛋白质、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使DNA分离出来。
三羟甲基氨基甲烷(Tris-HCl) (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏。
根、根茎、茎木类、皮类通常根和根茎组织中多酚、多糖含量高，在研磨时多酚极易氧化成醌类，在纯化过程中很难去除，使DNA带有一定颜色，影响后续的PCR反应，所以在提取根及根茎类药材DNA时一定要注意多糖、多酚的去除。
提取根及根茎类药材DNA时水浴时间一般为90分钟，对于质地坚硬的根、根茎类和茎木类药材，可以采用延长水浴时间，如56℃水浴过夜，使得DNA充分释放到缓冲溶液中。
此外，根茎类药材由于富含纤维和贮藏物质，需较多样品量才能提取到足量DNA，可用大体积离心管(5 mL或15 mL)抽提。
皮类中药材组织中富含薄壁组织和纤维等，加液氮不易研磨成细粉，需适当增加样品量，同时应增加β-巯基乙醇和PVP的使用量。
叶、花、全草类该类药材采用试剂盒一般都能成功提取其DNA，对于保存时间较久的叶、花、全草类药材可适当增加水浴时间，同时适当降低水浴温度，如56℃水浴过夜等。
果实、种子类果实及种子类中药材中多富含油脂，研磨时易被氧化，且易粘着在研钵壁上，损失较大，提取时需增加样品量。
另外，对研磨后的材料可用丙酮浸提，去除脂溶性酚类化合物。
动物药材肌肉类动物药材如海龙、蛇类、蛤蚧等，需进行紫外杀菌处理，并且需要充分磨碎。
含有脂类较多的动物内脏器官如蛤蟆油，首先用不含蛋白酶K和SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液浸泡药材，SDS是一种阴离子表面活性剂，在55～65℃条件下能裂解细胞，释放出核酸；然后在试剂盒消化缓冲液中增加SDS含量，有利于脱去脂类。
骨甲类药材如龟甲、鳖甲和鹿茸等，由于DNA含量较低，样品量要适当增大，也可用大体积离心管(5 mL或15 mL)抽提。
3）PCR扩增植物类中药材及其基原物种扩增ITS2或psbA-trnH序列，动物类中药材及其基原物种扩增COI序列，通用引物及扩增条件如下，具体如有改变见各药材项下。
ITS2序列扩增正向引物ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；反向引物ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。
psbA-trnH序列扩增正向引物psbAF：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；反向引物trnHR：5′-CGCGCA- TGGTGGATTCACAATCC-3′。
COI序列扩增正向引物HCO2198：5′-TAAACTT- TCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；反向引物LCO1490：5′-GGTCAACAAATCA- TAAAGATATTGG-3′。
PCR反应体系以25 μL为参照，包括：1× PCR缓冲液(不含MgCl2)，2.0 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，0.1 μmol/L引物对，模板DNA，1.0 U Taq DNA聚合酶，加灭菌双蒸水至25 μL。
设置未加模板DNA的PCR反应为阴性对照。
ITS2序列扩增程序：94℃5 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃45 s，40个循环；72℃10 min。
psbA-trnH序列扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃1.5 min，30个循环；72℃7 min。
COI序列扩增程序：94℃1 min；94℃1 min，45℃1.5 min，72℃1.5 min，5个循环；94℃1 min，50℃1.5 min，72℃1 min，35个循环；72℃5 min。
4）PCR产物检测采取琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。
电泳后，PCR产物应在相应的DNA 条形码序列长度位置(具体见各药材项下)出现一条目的条带，阴性对照应无条带。
5）测序使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序，PCR扩增引物作为测序引物，测序原理同Sanger测序法。
有PCR扩增条带的样品送测序公司进行DNA序列测定。
6）中药材DNA条形码序列获得（1）序列拼接对双向测序峰图应用专业软件进行序列拼接，去除引物区，获得相应的DNA 序列。
（2）序列质量与方向为确保DNA条形码序列的可靠性，需对测序质量进行评估，去除测序结果两端的低质量序列。
序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。
7）结果判定将获得的序列在中药材DNA条形码鉴定系统()或GenBank数据库中应用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)方法进行结果判定，结果中相似性最高的序列对应物种为查询序列最接近的物种。
如果植物类药材ITS2序列比对后最接近的物种为真菌，则需采用psbA-trnH序列重复上述方法流程。
（1）中药材DNA条形码鉴定数据库系统鉴定操作流程登录中药材DNA条形码鉴定数据库系统网站，在主页点击“物种鉴定”。
根据需鉴定物种的种类，选择对应的鉴定数据库，如点击植物类药材鉴定(ITS/ITS2)。
将需要鉴定的物种序列复制后粘贴到“植物类药材鉴定(ITS/ITS2)”的序列输入栏，点击“提交”按钮，进行BLAST鉴定。
在BLAST比对结果中，在“序列比对信息”栏查看相关比对信息，在“物种鉴定结果”栏显示与所查询序列最接近的物种。
（2）GenBank数据库BLAST鉴定系统操作流程登录GenBank数据库BLAST鉴定系统(/Blast.cgi)，在Basic BLAST中选择nucleotide blast，在Enter Query Sequence中粘贴需要鉴定的序列(Query)(建议用fasta格式)。
在Choose Search Set中选others(nr etc.)数据库，点击左下角BLAST。
在BLAST结果中查看序列相似性最高(Max ident)的物种，一般为与查询序列最接近的物种。
5. 中药材DNA条形码数据库构建原则建立中药材DNA条形码数据库时，应在药材原产地及主产地采集供试品，采用经典分类方法确定其基原，采集样本尽可能覆盖其分布区，每个物种采集来自不同产地样本20份以上。
根据具体药材测定ITS2或psbA-trnH或COI等DNA条形码序列，分析确定该药材DNA条形码序列种内变异大小。
对实验获得或GenBank中的中药材DNA条形码序列必须经过核准后方可录入中药材DNA条形码数据库，同时需定期对数据库进行更新。
6. 方法学验证1）影响因素考察考察DNA条形码分子鉴定法的影响因素，包括DNA提取(样品量、水浴温度和水浴时间)、PCR条件(变性时间、退火温度与时间及延伸时间)及产物纯化(考察不同纯化试剂盒)，保证实验方法的准确性。
2）精密度考察（1）重复性至少用3批供试品，每批3次或同批供试品进行6次测定试验后对结果进行评价。
实验结果判定应基本一致。
（2）中间精密度考察实验室内部条件改变(如不同人员、不同仪器、不同工作日和实验时间)对测定结果的影响，至少应对同实验室不同操作人员的结果进行考察。
（3）重现性实验结果在3家以上实验室能够重现，相同样品在不同实验室获得DNA条形码序列应相同。
3）方法适用性考察采用DNA条形码分子鉴定法对20批次以上药材或基原物种进行测定，积累数据，确定种内序列变异大小，保证该测定方法的适用性。
4）基原物种对比验证以分类学家确认的基原物种叶片为对象，采用该方法获得DNA条形码数据，与相应药材产生的DNA条形码数据进行对比，避免内生真菌等污染，保证结果准确性。
7. 注意事项1）实验场所应具备分子生物学实验室的基本条件。
2）中药材DNA条形码分子鉴定法暂不适用于混合物及炮制品的鉴定。
3）为防止外源真菌污染，实验前须将实验用具进行高压灭菌，并用75%乙醇擦洗药材表面。
有些药材本身含有内生真菌，如果内生真菌存在于药材的外围组织，则选用内部组织进行实验。