中药材dna条形码分子鉴定法指导原则及其在《中国药典》(版)中的应用复习课程
中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则及其在《中国药典》(20重点
中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则及其在《中国药典》(20重点DNA条形码分子鉴定法是一种基于DNA序列的分子鉴定方法，广泛应用于物种鉴定、中药材真伪鉴定等领域，并已在《中国药典》(20重点)中得到重要的应用。
以下将介绍中药材DNA条形码分子鉴定法的指导原则及其在《中国药典》(20重点)中的具体应用。
1.样本选择：选择符合《中国药典》(20重点)规范的中药材样本，同时保证样本的完整性和纯度。
如有需要，可以根据实际情况对样本进行处理，如去除外部的附着物等。
2.DNA提取：选择适宜的DNA提取方法，根据样本的不同特点和纯度要求，选择合适的提取试剂盒和操作流程，提取出高质量的DNA。
3.DNA扩增：根据《中国药典》(20重点)中药材的DNA条形码序列，选择适宜的引物，进行PCR扩增。
在扩增过程中，注意控制扩增反应的条件，选择合适的PCR仪和反应体系，保证扩增的特异性和可重复性。
4.序列读取和比对：对扩增得到的DNA序列进行测序，选择合适的测序平台和方法，确保测得的序列质量高。
将测序得到的序列与相关数据库中的已知序列进行比对，找到最佳匹配的物种。
5.鉴定结果验证：对鉴定结果进行验证，如测序重复性验证、鉴定结果与形态学特征的对比等，确保鉴定结果的准确性和可靠性。
《中国药典》(20重点)作为中药材质量评价的权威参考，对于中药材DNA条形码分子鉴定法的应用也给出了明确的指导和要求。
《中国药典》(20重点)中明确了中药材DNA条形码分子鉴定法的使用范围和方法，规定了鉴定所需的样本数量、测序平台的选择、引物的设计和数据库比对的要求等。
此外，根据中药材DNA条形码分子鉴定法的特点和应用需求，还可以结合其他分子鉴定方法，如SNP分析、核糖体DNA序列鉴定等，进一步提高中药材的鉴定准确性和可靠性。
综上所述，中药材DNA条形码分子鉴定法作为一种重要的中药材质量评价手段，已在《中国药典》(20重点)中得到明确的指导和应用。
DNA条形码等分子鉴定技术与动植物类中药材的鉴定
·综述·ＤＮＡ条形码等分子鉴定技术与动植物类中药材的鉴定张国林 ，邢以文，薛满苏州市药品检验检测研究中心，江苏 苏州 ２１５０００［摘要］ 中药材鉴定是控制中药质量、确保用药安全与效果的首要环节。
ＤＮＡ分子鉴定是从基因层面上进行中药材鉴别的手段，准确率高。
ＤＮＡ分子鉴定包括电泳技术、免疫技术、随机扩增多态性ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、限制性内切酶片段长度多态性（ＲＦＬＰ）、扩增片段长度多态性（ＡＦＬＰ）、简单重复序列（ＩＳＳＲ）及ＤＮＡ条形码等，以ＤＮＡ条形码应用最为广泛。
ＤＮＡ条形码是基因组中相对较短的、可用于物种鉴定的特异性基因片段。
植物类中药材的条形码多选用核基因和叶绿体基因ＤＮＡ片段，如叶绿体ｐｓｂＡ ｔｒｎＨ基因、内转录间隔区（ＩＴＳ）、叶绿体核酮糖 １，５ 二磷酸羧化酶大亚基（ｒｂｃＬ）和ＲＮＡ转录体Ⅱ型内含子剪切酶基因（ｍａｔＫ）等；动物类中药材的条形码多来自核基因和线粒体基因ＤＮＡ，主要有线粒体细胞色素Ｃ氧化酶亚基１（ＣＯⅠ）、核糖体ＲＮＡ（ｒＲＮＡ）和线粒体细胞色素ｂ基因（ＣｙｔＢ）等。
综述动植物类中药材ＤＮＡ分子标记与鉴定技术应用进展，并探讨ＤＮＡ条形码在药用动植物类中药材鉴定中存在的局限性及发展前景，为中药质量控制提供参考。
［关键词］ 条形码；核基因；叶绿体基因；线粒体基因；微条形码；复合条形码［中图分类号］ Ｒ２８２ ５ ［文献标识码］ Ａ ［文章编号］ １６７３ ４８９０（２０２１）０２ ０３８１ ０８ｄｏｉ：１０ １３３１３／ｊ ｉｓｓｎ １６７３ ４８９０ ２０２００２１６００１ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＮＡＢａｒｃｏｄｉｎｇａｎｄＯｔｈｅｒＭｏｌｅｃｕｌａｒＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡｎｉｍａｌａｎｄＰｌａｎｔＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅＺＨＡＮＧＧｕｏ ｌｉｎ ，ＸＩＮＧＹｉ ｗｅｎ，ＸＵＥＭａｎＳｕｚｈｏｕＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌ，Ｓｕｚｈｏｕ２１５０００，Ｃｈｉｎａ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ ＴｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＴＣＭ）ｉｓｔｈｅｆｉｒｓｔｓｔｅｐｆｏｒｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ ＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｓａｍｅｔｈｏｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙＴＣＭｆｒｏｍｔｈｅｇｅｎｅｌｅｖｅｌｂｙｄｉｒｅｃｔｌｙａｎａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｍａｔｅｒｉａｌｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ Ｉｔｈａｓｈｉｇｈａｃｃｕｒａｃｙａｎｄｉｓｎｏｔｅａｓｙａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅ，ｔｉｓｓｕｅｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｓａｍｐｌｅｓｈａｐｅａｎｄｅｘｔｅｒｎａｌｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｆａｃｔｏｒｓ ＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｃｌｕｄｅｓｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｒａｎｄｏｍａｍｐｌｉｆｉｅｄｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ（ＲＡＰＤ），ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＲＦＬＰ），ａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＡＦＬＰ），ｓｉｍｐｌｅｒｅｐｅａｔｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＩＳＳＲ）ａｎｄＤＮＡｂａｒｃｏｄｅ，ａｍｏｎｇｗｈｉｃｈＤＮＡｂａｒｃｏｄｅｉｓｍｏｓｔｗｉｄｅｌｙａｄｏｐｔｅｄ ＤＮＡｂａｒｃｏｄｉｎｇｉｓａｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｓｈｏｒｔｓｐｅｃｉｆｉｃｇｅｎｅｓｅｇｍｅｎｔｉｎｇｅｎｏｍｅ，ｗｈｉｃｈｃａｎｂｅｕｓｅｄｆｏｒｓｐｅｃｉｅｓｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＩｎｔｈｅｂａｒｃｏｄｅｏｆｐｌａｎｔｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｎｕｃｌｅａｒｇｅｎｅａｎｄｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｇｅｎｅＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓａｒｅｍｏｓｔｌｙｓｅｌｅｃｔｅｄ，ｓｕｃｈａｓｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｐｓｂＡ ｔｒｎＨｇｅｎｅ，ｉｎｔｅｒｎａｌｔｒａｎｓｃｒｉｂｉｎｇｓｐａｃｅｒ（ＩＴＳ），ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｒｉｂｏｋｅｔｏｓｅ １，５ ｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅｌａｒｇｅｓｕｂｕｎｉｔ（ｒｂｃＬ）ａｎｄＲＮＡｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｒｔｙｐｅⅡｉｎｔｒｏｎｓｈｅａｒｅｎｚｙｍｅｇｅｎｅ（ｍａｔＫ） ＩｎａｎｉｍａｌｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅｂａｒｃｏｄｅｍｏｓｔｌｙｃｏｍｅｓｆｒｏｍｎｕｃｌｅａｒｇｅｎｅａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｇｅｎｅＤＮＡ，ｍａｉｎｌｙｉｎｃｌｕｄｉｎｇｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＤＮＡＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＣｏｘｉｄａｓｅｓｕｂｕｎｉｔ１（ＣＯⅠ），ｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ（ｒＲＮＡ）ａｎｄｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｂｇｅｎｅ（ＣｙｔＢ） ＤＮＡｂａｒｃｏｄｉｎｇｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｆａｓｔｅｓｔｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｉｎＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｗｈｉｃｈｐｌａｙｓａｎｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｌｙｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｏｌｅｉｎｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｉｍａｌａｎｄｐｌａｎｔＴＣＭ Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＤＮＡｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎａｎｉｍａｌａｎｄｐｌａｎｔｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｍｅｄｉｃｉｎｅｉｓｒｅｖｉｅｗｅｄ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ；ｎｕｃｌｅａｒｇｅｎｅ；ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｇｅｎｅ；ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌｇｅｎｅ；ｍｉｃｒｏ ｂａｒｃｏｄｉｎｇ；ｃｏｍｐｏｕｎｄｂａｒｃｏｄｉｎｇ［通信作者］ 张国林，副主任药师，研究方向：药品检验及质量控制；Ｔｅｌ：（０５１２）６６０９０２２９，Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｇｕｏｌｉｎ２００６＠１６３ ｃｏｍ由于中药材种类繁多、来源复杂及市场利益的驱使，中药材品种混淆、掺伪现象时有发生。
中草药DNA条形码分子鉴定：从基因到基因组
中草药 DNA条形码分子鉴定：从基因到基因组鉴定中药的“真伪优劣”是确保中药质量的关键所在, 而其中“真伪”更是中药临床用药安全的重要前提, 特别是针对贵重药材以及有毒中药而言。
DNA条形码作为一项快速准确鉴定物种的方法在药用植物基原以及药材鉴定中的应用已非常广泛。
通过构建标准的 DNA条形码参考数据库是该技术应用的主要形式。
尽管不同学者提出了诸多用于植物鉴定的DNA条形码 , 但由于片段长度的限制 , 单一序列或多序列组合的条形码在近缘种之间的鉴定仍有很大的局限性。
植物叶绿体基因组作为用于筛选DNA条形码序列的研究热点 , 其本身也可作为超级条形码 (Super barcode)用于系统进化、亲缘关系以及物种鉴定研究。
本研究围绕 DNA条形码鉴定技术 , 首先以《日本药局方》 ( 以下简称“药局方” ) 中收载的生药材为对象 , 构建了药局方生药DNA条形码分子鉴定系统；其次 , 选取人参属药用植物作为名贵药材代表、乌头属药用植物作为有毒中药代表, 分别对该技术在这两个属中的应用进行了研究；最后, 利用高通量测序技术测定了乌头属叶绿体基因组 , 为叶绿体基因组作为超级条形码奠定基础, 为筛选适合该属的高变异分子标记提供依据。
本研究主要内容及结论如下：1、建立了一套以 ITS2 序列为主 psbA-trnH序列为辅的汉方生药材标准DNA条形码数据鉴定系统。
该系统为用户提供了汉方草药信息查询、 DNA条形码物种鉴定以及从样品采集到数据分析的标准操作流程三项主要功能。
共搜集来自日本及中国不同地区的基原植物和生药材样本共计576 份, 从中获取的标准序列覆盖了97.3%的药局方 ( 十六版 ) 收载生药品种。
另外搜集了100份待测样本 , 用来检验数据库的鉴定效果。
通过 BLAST结果显示 ,100 份样品中有 71 份样品获得的结果与标签上所标注的物种一致 , 即准确鉴定到物种水平。
其余29 份样品鉴定到属水平。
中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则及其在《中国药典》(2015年版)中的应用
《中药制剂分析》课程论文中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则及其在《中国药典》（2015年版）中的应用药学（药物分析方向）2012级指导教师：高晓霞2015 年11月摘要：中药材存在多基原物种及同名异物、同物异名等问题，鉴于传统基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定方法存在局限性，为保证中药材临床应用安全、准确、有效，有必要增加中药材DNA条形码分子鉴定法。
如今分子生物学技术在中药材鉴定领域的应用已逐步深入。
《中国药典》2010年版收载了乌梢蛇饮片、蕲蛇饮片、川贝母药材的DNA分子鉴定方法，而《中国药典》2015年版收载了“中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”，DNA 条形码分子鉴定法是利用公认的相对较短的DNA序列来进行物种假定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。
这标志着中药材的分子鉴定由实验室科研层面进入国家标准的应用层面。
关键词：中药材；DNA；鉴定；指导原则一、中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[1]1.1定义及原理该鉴定方法主要适用于中药材（包括药材、药材粉末及部分药材饮片）及基原物种的鉴定。
DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。
由于DNA序列是由腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）4种碱基以不同顺序排列组成，因此一定长度DNA 序列能够区分不同物种。
中药材DNA条形码分子鉴定指导原则通过对大样本量中药材进行DNA条形码分子鉴定研究，建立以ITS2为核心，psbA-trnH为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系和以COI为主、ITS2为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。
1.2方法与步骤中药材DNA条形码分子鉴定法主要包括供试品处理、DNA提取、PCR扩增、测序、序列拼接及结果判定，以下内容详细说明各流程中的主要原理及注意事项。
1.2.1 供试品处理除特殊标明外，药材使用75%乙醇擦洗表面后晾干，称取10～100 Mg2+备用。
2015年版《中国药典》四部介绍与其在中药分析鉴定中应用
2015年版
一
《中国药典》
四部介绍
山东中医药大学
Shandong University Of Traditional Chinese Medicine
（一） 2015年版《中国药典》四部介绍
1 2015年版《中国药典》四部增修订整体情况：
2015年版《中国药典》四部收载通则总数317个, 将药典一部、二部、三部制剂整合后共计38个，检 测方法附录287个，其中新增通则28个 (检定方法通 则27个、制剂通则1个)，整合通则63个，修订通则 67 个；新增生物制品总论3个；指导原则共计30个， 其中新增15个，修订10个。辅料收载总数约270个 品种，其中新增137 个，修订97个，不收载2个。
山东中医药大学
Shandong University Of Traditional Chinese Medicine
2017年山东省执业药师继续教育学习材料——
2015 《中国药典》四部介绍 及其在中药分析鉴定中的应用
主讲人：李峰 教授
2017年5月
山东中医药大学博士生导师，生药系主任李峰教授
全国中医药高等教育教学名师 国务院特殊津贴专家 国家科技奖励审评专家 国家自然科学基金委员会评审专家 国家中医药管理局中医药科技教育专家 教育部国际科技合作重点项目计划评审专家 山东省中医药学会中药鉴定专业委员会主任委员 世界中医药联合会中药鉴定分会常务理事 中华中医药学会中药鉴定专委会常务理事 全国中医药优秀博士论文指导教师 山东省教学名师 山东省优秀研究生指导教师 山东省教育科学优秀成果一等奖 山东省科技进步一等奖2项 山东省优秀博士论文奖 山东省中医药科技进步一等奖 山东省优秀青年志愿者 山东省暑期三下乡优秀指导教师 全省支教先进个人 山东省高校中青年学术骨干和学科带头人
中药鉴定新技术新方法及其应用
中药鉴定新技术新方法及其应用中药鉴定一直是中医药领域的关键问题之一。
传统的中药鉴定主要依靠经验和观察，这种方法存在主观性和不确定性，容易导致判断错误，限制了中药质量的保障。
近年来，随着科学技术的不断进步，中药鉴定新技术和新方法不断涌现，为中药质量保障提供了更加准确和可靠的手段。
一、 DNA 条形码技术DNA 条形码技术是一种快速、准确鉴定植物物种的分子生物学技术，可以利用特定基因序列的差异性为不同的植物物种打上独特的“条形码”。
中药材是植物的不同器官组织，其 DNA 序列不同，可以通过 DNA 条形码技术进行区分。
DNA 条形码技术具有快速、准确、可靠、高通量等优点，已被广泛应用于药用植物鉴定、种质资源管理、药品质量控制等方面。
中国药典2015年版规定了一些植物药材的 DNA 条形码鉴定方法，包括麻黄、柴胡、青黛等。
还有公司研发出基于 DNA 条形码技术的中药快检仪，可以实现对中药材的快速鉴定。
二、高通量测序技术高通量测序技术是一种分子生物学技术，可以对 DNA 或 RNA 序列进行直接、快速且准确的分析。
这种技术可以在较短的时间内完成海量序列数据的产生和分析，为中药材的鉴定提供了更全面、更快速、更准确的手段。
近年来，有研究者利用高通量测序技术，对一些常见中药材进行了基因组测序和比较。
中医中药研究所在2018年对当归进行了基因组测序，解析了其基因组结构和功能，为当归的遗传改良和利用提供了科学依据。
同样，对于一些难以鉴别的中药材，如三七、川芎、地榆等，高通量测序技术也被应用于种质鉴定和品种保护。
三、毒理学鉴定技术中药毒理学鉴定技术是一种用于中药毒性评价的科学技术，可以通过各种方法评估中药的安全性。
这种技术可以为中药的临床应用提供一定的保障，避免药物毒副作用的发生。
中药毒理学鉴定技术包括细胞毒性评价、小动物毒性实验、基因毒性评价等多种方法。
细胞毒性评价和小动物毒性实验是常用的中药毒理学鉴定方法，可以评估中药对于细胞和动物的毒性反应，并且可以为中药药品的临床适用提供一定的安全保证。
中药材真伪鉴别新方法(DNA分子标记鉴别技术)
中药材真伪鉴别新方法（DNA分子标记鉴别技术）中药品种繁多，应用历史悠久，产区广泛。
由于地理和历史的原因，药材品种混乱，基源复杂，如仅《中华人民共和国药典》2000年版收载的534种中药材，即有143种为多基源(二基源以上)，占收载总数的27%。
加之中药的同名异物或同物异名现象普遍存在以及伪品、混淆品和误用品等因素，对中药的化学成分和药理作用的研究、制剂生产、临床疗效及推广使用等都有直接影响，严重影响了中医药的信誉。
同时，即使是同种药材，由于产地不同、野生与栽培以及生长年限不同都表现出质量和疗效上的差异，这些问题为中药材鉴别方法提出了新的挑战，依赖经典形态分类以及传统鉴别方法已无法满足鉴别的需要。
随着各种先进仪器以及分子生物学的发展，各种新的鉴别方法亦纷纷推出，如红外光谱鉴别、化学指纹图谱鉴别以及DNA分子标记鉴别等，中药材鉴别领域显示出了蓬勃的生机。
近年来，以PCR为基础的DNA分子标记鉴别技术在中药材真伪鉴别中发挥了重要的作用，同时，在多基源品种的鉴别及道地药材鉴别中也崭露头角，显示出了巨大的前景。
以人参、西洋参的分子标记鉴别研究为例，可以清楚地看出中药材分子标记鉴别的研究轨迹。
从1994年AP-PCR首次用于人参、西洋参的鉴别以来，已有24篇相关的报道，按照所用方法的不同可分为三种：①基于PCR技术的方法有18篇文献，其中利用随机引物如RAPD 和Ap-PCR等的有9篇，利用特异引物如MARMS、SCAR等的3篇，AFLP的3篇，PCR-RFLP的3篇；②利用DNA测序技术的有7篇；③基于分子杂交的方法有1篇，主要针对重复序列。
有的报道中同时使用两种方法，如同时使用ITS序列分析与RAPD、PCR―RFLP和RAPD等。
根据各个文献发表时间及其使用的方法可以得到人参类药材分子鉴定的发展特点：①随机引物虽占据主导地位，但随着时间的推移，RAPD等方法逐渐推出舞台。
无须预先知道基因组信息的特点，使RAPD在中药材分子鉴定上成为最主要的方法，但随着18S、matK基因的测序，新方法便得以诞生，如MARMS。
DNA条形码技术在中药鉴定中的应用进展_张彩云
・综述・DNA条形码技术在中药鉴定中的应用进展张彩云1，黄珊珊1，颜海飞2*1. 广东食品药品职业学院广东省中药研究所，广东广州 5105202. 中国科学院华南植物园中国科学院植物资源保护与可持续利用重点实验室广东省应用植物学重点实验室，广东广州510650摘要：DNA条形码（DNA barcoding）技术利用标准的一个或多个DNA片段对物种进行鉴定，是近年来生物学研究的热点领域，也是生物学发展最迅速的方向之一。
总结了植物DNA条形码研究的发展历程及最新进展，重点讨论了超级条形码在近缘物种鉴别中的应用前景，以及DNA条形码在中药材基原物种鉴定、道地药材鉴别以及中药材溯源系统研究中的应用，并强调了植物DNA条形码在中药资源评价、保护和可持续利用中的重要地位和作用，为药用植物DNA条形码研究提供新的思路。
关键词：DNA条形码；道地药材；分子鉴定；叶绿体基因组；超级条形码中图分类号：R282.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2017)11 - 2306 - 07DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.11.026Applications of DNA barcoding in Chinese materia medica identificationZHANG Cai-yun1, HUANG Shan-shan1, YAN Hai-fei21. Guangdong Institute of Chinese Materia Medica, Guangdong Food and Drug V ocational College, Guangzhou 510520, China2. Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Sustainable Utilization, Guangdong Provincial Key Laboratory of AppliedBotany, South China Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510650, ChinaAbstract: DNA barcoding involves the standardized use of one or a few DNA regions to tell species apart. It represents a hotspot of biological studies and one of the most rapid development directions of biology in recent years. Herein, we reviewed the development and current advances of plant DNA barcoding, focusing on the prospect of ultra-barcode in the identification of closely related species; The applications of DNA barcodes in the identification of traditional Chinese herbal medicine, the identification of genuine medicinal material and medicine traceability system. We also emphasized that the plant DNA barcoding will play an important role in the evaluation, protection and sustainable utilization of traditional Chinese medicine resources. This review may offer a new idea for the proceeding studies of medicinal plant DNA barcoding.Key words: DNA barcoding; genuine medicinal material; molecular identification; chloroplast genome; ultra-barcodeDNA条形码（DNA barcoding）是国际上近年来快速发展的有关物种鉴定的新技术，此概念最早由加拿大学者Paul Hebert等[1]于2003年提出，即用标准化的、较短的DNA序列作为条形码，以实现对物种进行快速、准确地鉴定。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
中药材D N A条形码分子鉴定法指导原则及其在《中国药典》(2015年版)中的应用《中药制剂分析》课程论文中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则及其在《中国药典》（2015年版）中的应用药学（药物分析方向）2012级指导教师：高晓霞2015 年 11月摘要：中药材存在多基原物种及同名异物、同物异名等问题，鉴于传统基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定方法存在局限性，为保证中药材临床应用安全、准确、有效，有必要增加中药材DNA条形码分子鉴定法。
如今分子生物学技术在中药材鉴定领域的应用已逐步深入。
《中国药典》2010年版收载了乌梢蛇饮片、蕲蛇饮片、川贝母药材的DNA分子鉴定方法，而《中国药典》2015年版收载了“中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则”，DNA条形码分子鉴定法是利用公认的相对较短的DNA序列来进行物种假定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。
这标志着中药材的分子鉴定由实验室科研层面进入国家标准的应用层面。
关键词：中药材；DNA；鉴定；指导原则一、中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[1]1.1定义及原理该鉴定方法主要适用于中药材（包括药材、药材粉末及部分药材饮片）及基原物种的鉴定。
DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，是传统形态鉴别方法的有效补充。
由于DNA序列是由腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）4种碱基以不同顺序排列组成，因此一定长度DNA序列能够区分不同物种。
中药材DNA条形码分子鉴定指导原则通过对大样本量中药材进行DNA条形码分子鉴定研究，建立以ITS2为核心，psbA-trnH为辅的植物类药材DNA条形码鉴定体系和以COI为主、ITS2为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。
1.2方法与步骤中药材DNA条形码分子鉴定法主要包括供试品处理、DNA提取、PCR扩增、测序、序列拼接及结果判定，以下内容详细说明各流程中的主要原理及注意事项。
1.2.1 供试品处理除特殊标明外，药材使用75%乙醇擦洗表面后晾干，称取10～100 Mg2+备用。
1.2.2 DNA提取 DNA的提取包括破碎细胞壁、释放DNA，DNA的分离和纯化，DNA的浓缩、沉淀与洗涤等基本步骤，目前常用试剂盒法，包括植物基因组DNA提取试剂盒和动物组织/细胞基因组DNA提取试剂盒。
由于植物类中药材种类繁多，可根据所研究中药材的具体情况对提取方法加以改进。
植物细胞内含有大量次生代谢产物，如多糖、多酚等，这些物质在提取DNA的过程中与DNA共沉淀，形成黏稠的胶状物难以溶解或产生褐变，严重影响DNA提取的产量与质量，以及后续的PCR扩增实验。
EDTA（乙二胺四乙酸）螯合Mg2+2+或Mn2+，抑制DNase（DNA酶）活性；CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子表面活性剂，可溶解细胞膜，与DNA形成复合物溶于高盐溶液，降低溶液盐浓度至一定程度，则从溶液中沉淀，经离心即可将CTAB与DNA复合物同蛋白质、多糖类物质分开。
三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl）（pH 8.0）提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏。
β-巯基乙醇是抗氧化剂，在提取DNA过程中加入β-巯基乙醇，可以抑制氧化反应，避免褐化。
PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA提取过程中多酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。
因此将PVP和β-巯基乙醇配合使用，能够有效地防止DNA提取过程中多酚及多糖的污染。
在提取根、根茎、茎木类、皮类的DNA时，一定要注意多糖、多酚的去除；提取叶、花、全草的DNA时要适当增加水浴时间，并可将水浴温度降低；对于果实、种子类以及动物药材类的DNA提取可以参考《中国药典》。
1.2.3 PCR扩增植物类中药材及其基原物种扩增ITS2或psbA-trnH序列，动物类中药材及其基原物种扩增COI序列，通用引物及扩增条件如下，具体如有改变见各药材项下。
ITS2序列扩增正向引物ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；反向引物ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。
psbA-trnH序列扩增正向引物psbAF：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；反向引物trnHR：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。
COI序列扩增正向引物HCO2198：5′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；反向引物LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′。
），PCR反应体系以25 μL为参照，包括1× PCR缓冲液（不含Mg2+Cl22.0 mm ol·L-1 Mg2+Cl，0.2 mmol·L-1 dNTPs，0.1 mmol·L-1引物对，模板2DNA，1.0 U Taq DNA聚合酶，加灭菌双蒸水至25 μL。
设置未加模板DNA的PCR反应为阴性对照。
ITS2序列扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40个循环；72 ℃ 10 min。
psbA-trnH序列扩增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30个循环；72 ℃ 7 min。
COI序列扩增程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 1 min，45 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1.5 min，5个循环；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 5 min。
1.2.4 PCR产物检测采取琼脂糖凝胶电泳方法检测PCR产物。
电泳后，PCR产物应在相应的DNA条形码序列长度位置出现一条目的条带，阴性对照应无条带。
1.2.5 测序有PCR扩增条带的样品送测序公司进行DNA序列测定。
使用DNA测序仪对目的条带进行双向测序，PCR扩增引物作为测序引物，测序原理同Sanger测序法。
1.2.6 中药材DNA条形码序列获得主要包括序列拼接和序列质量与方向2个方面的内容。
对双向测序峰图应用专业软件进行序列拼接，去除引物区，获得相应的DNA序列。
为确保DNA条形码序列的可靠性，需对测序质量进行评估，去除测序结果两端的低质量序列。
序列方向应与PCR扩增正向引物方向一致。
1.2.7 结果判定将获得的序列在中药材DNA条形码鉴定系统（http：//）或GenBank数据库中应用BLAST（basic local alignment search tool）方法进行结果判定，结果中相似性最高的序列对应物种为查询序列最接近的物种。
如果植物类药材ITS2序列比对后最接近的物种为真菌，则需采用psbA-trnH序列重复上述方法流程。
中药材DNA条形码鉴定数据库系统及GenBank数据库BLAST鉴定系统操作流程见下。
登录中药材DNA条形码鉴定数据库系统网站，在主页点击“物种鉴定”。
根据需鉴定物种的种类，选择对应的鉴定数据库，如点击植物类药材鉴定（ITS/ITS2）。
将需要鉴定的物种序列复制后粘贴到“植物类药材鉴定（ITS/ITS2）”的序列输入栏，点击“提交”按钮，进行BLAST鉴定。
在BLAST比对结果中，在“序列比对信息”栏查看相关比对信息，在“物种鉴定结果”栏显示与所查询序列最接近的物种。
登录GenBank数据库BLAST鉴定系统（http：///Blast.cgi），在Basic BLAST中选择nucleotide blast，在Enter Query Sequence中粘贴需要鉴定的序列（Query）（建议用fasta格式）。
在Choose Search Set中选others（nr etc.）数据库，点击左下角BLAST。
在BLAST结果中查看序列相似性最高（max ident）的物种，一般为与查询序列最接近的物种。
1.3 方法学验证1.3.1方法适用性考察采用DNA条形码分子鉴定法对20批次以上药材或基原物种进行测定，积累数据，确定种内序列变异大小，保证该测定方法的适用性。
1.3.2 精密度考察主要分为重复性考察、中间精密度考察及重现性考察。
重复性，至少用3批供试品，每批3次或同批供试品进行6次测定试验后对结果进行评价。
实验结果判定应基本一致。
中间精密度，考察实验室内部条件改变（如不同人员、不同仪器、不同工作日和实验时间）对测定结果的影响，至少应对同实验室不同操作人员的结果进行考察。
重现性，实验结果在3家以上实验室能够重现，相同样品在不同实验室获得DNA条形码序列应相同。
1.3.3影响因素考察考察DNA条形码分子鉴定法的影响因素，包括DNA提取（样品量、水浴温度和水浴时间）、PCR条件（变性时间、退火温度与时间及延伸时间）及产物纯化（考察不同纯化试剂盒），保证实验方法的准确性。
1.3.4 基原物种对比验证以分类学家确认的基原物种叶片为对象，采用该方法获得DNA条形码数据，与相应药材产生的DNA条形码数据进行对比，避免内生真菌等污染，保证结果准确性。
1.4 中药材DNA条形码分子鉴定核心序列选择依据1.4.1植物类中药材ITS2和psbA-trnH条形码的选择依据 DNA条形码研究的首要任务是确定通用DNA条形码序列。
在植物界，研究者主要从叶绿体基因组和核基因组中寻找理想的DNA条形码，曾提出诸多候选条形码序列或组合。
2009年，国际条形码协会植物工作组对来自550个物种907个样品的7个序列（rbcL，matK，rpoC1，ropB，psbA-trnH，psbK-psbI，atpF-atpH）进行了分析比较，建议将rbcL+matK组合作为植物通用条形码[10]。
然而，植物工作组认为该组合还远不够完美，寻找植物DNA条形码的工作还没有结束[2]。
同年，在墨西哥召开的第三届国际条形码大会上，与会代表一致认为应对ITS/ITS2和psbA-trnH序列进行进一步评估。
2010年，陈士林等[3]分析比较了7个候选DNA条形码（psbA-trnH，matK， rbcL， rpoC1， ycf5， ITS2， ITS）。
研究对象为药用植物及其密切相关物种。
研究结果表明ITS2表现突出，在物种水平的鉴定效率高达92.7%。
因此，陈士林等建议将ITS2作为药用植物标准DNA条形码。
鉴于研究中psbA-trnH仅次于ITS2序列，也具有较好鉴定能力，因而推荐其作为ITS2的辅助条形码。
Yao等[4]基于大样本量分析证实ITS2序列可以作为植物物种鉴别的通用条形码，并以ITS2序列为基础初步建立了药用植物DNA条形码数据库网络查询系统（http：///）。