版中国药典微生物培训菌种的保藏和管理
《中国药典》菌种的传代与保藏35页PPT
66、节制使快乐增加并使享受加强。 ——德 谟克利 特 67、今天应做的事没有做，明天再早也 是耽误 了。——裴斯 泰洛齐 68、决定ห้องสมุดไป่ตู้个人的一生，以及整个命运 的，只 是一瞬 之间。 ——歌 德 69、懒人无法享受休息之乐。——拉布 克 70、浪费时间是一桩大罪过。——卢梭
《中国药典》菌种的传代与保藏
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 。—— 陈鹤琴
微生物菌(毒)种保藏及管理
微生物菌（毒）种保藏及管理文章编号：1004-9231(2007)02-0087-02在微生物检验及研究工作中经常使用菌（毒）种。
菌（毒）种是一种重要的生物资源。
菌（毒）种保藏不仅有利于重现已经做过的实验，证实发现新的菌（毒）种，而且也是研究、推广、开发和实际应用科研成果的基础。
保藏的菌（毒）种有的是开发利用的对象，有的是悉心研究的成果，有从自然界分离得到的，有经生物技术修饰改造获得的，都是有着极大的研究价值和开发利用的潜力［1］。
因此，菌（毒）种的保藏工作至关重要。
菌（毒）种保藏和管理是微生物工作者普遍关注的问题，它要求菌（毒）种在保藏和管理过程中不死亡，不被污染，并保持较高的存活率及遗传稳定性，以便长期使用。
1 菌（毒）种保藏［2］菌（毒）种保藏就是对活体微生物群体进行有效的保藏。
保藏方法有20多种，从总体上可分为4大类：传代法、干燥法、冷冻法和冷冻干燥法［1］。
无论哪种方法，其原理都是创造一个抑制细胞代谢的环境，如低温，干燥，缺氧，营养缺乏等。
简易的方法有定期移植法、液体石蜡法、无菌蒸馏水法、硅胶干燥法、玻璃或瓷珠干燥法、滤纸法、麸皮法、沙土管法等。
不同类型或不同种属的菌（毒）种可根据生理特性选用不同的保藏方法。
如产芽孢或孢子的菌种适用于干燥法，无抗逆性结构的细胞如酵母菌或某些种属的细菌可用定期移植法和液体保藏等方法。
目前公认的长期保存微生物菌（毒）种的较安全、可靠的方法是冷冻法和冷冻干燥法，而其中制备和保存生物材料的最佳方法是冷冻干燥法，此法适用于大多数微生物菌（毒）种的保藏，因为它适用于大多数细胞结构的特点、生存环境及其生理状态，能满足微生物细胞结构和功能的统一性。
其基本原理是运用干燥、低温和隔绝空气的手段，降低细菌（或病毒）新陈代谢的速度，使细菌（或病毒）的生命活动处于半永久性休眠状态，以达到长期保藏的目的［3］。
另外，保藏效果良好的还有液氮保藏法等。
2 保藏方法菌（毒）种的保藏是微生物检验、教学科研和有关生产单位的一项重要工作［4］。
规程–Ⅳ微生物细菌菌种保藏库管理规程
规程–Ⅳ微生物（细菌）菌种保藏库管理规程中国检验检疫微生物菌种保藏管理中心前言微生物菌种资源是自然科学资源的重要组成部分，是生物多样性的重要体现。
本规程是依据我单位的特点，现有的工作基础和实际需要制定的。
制定本规程是为了实现微生物菌种资源保藏管理程序的规范化、标准化，以有效的收藏微生物菌种资源，更好的为检验检疫、科研培训等服务。
本规程制定了4°C菌种库、低温库管理的基本原则，菌种的出入库流程及菌种库的日常管理。
规程起草单位：中国检验检疫微生物菌种保藏管理中心规程起草人：赵贵明、王娉、杨海荣、陈颖、赵勇胜版本：2014-07目录前言--------------------------------------------------------------------第 1 页1 范围------------------------------------------------------------------第 3 页2 规范性引用文件--------------------------------------------------------第3 页3 术语和定义------------------------------------------------------------第 3 页4 菌种保藏库管理的基本原则----------------------------------------------第 4 页5 菌种库的建设----------------------------------------------------------第 4 页6 菌种保藏库的日常管理--------------------------------------------------第 5 页附录A （资料性附录）菌种入库单、出库三联单------------------------------第7 页微生物（细菌）菌种保藏库管理规程1范围本规程规定了菌种保藏库管理的基本原则，菌种的出入库流程及种库的日常管理。
【精品】菌种的管理和保藏完整版
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菌种的传代和使用
• 冻干菌种（0代）
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• 增菌液培养（1代）
•
↓
• 增菌液培养（2代） → 分装冷冻保存
•
↓
• 增菌液培养
• 适宜的斜面培养基 → 使用
• 工作菌株（3传代（4代） → 冷冻保存
•
↓
• 工作菌株传代（5代） → 冷冻保存
• 如使用蛋白胨、甘油水，可取各代的斜面培养物，加入培养基中，在规 定条件培养后冷冻保存。
菌种保藏的重要性
菌种保藏是微生物学检验工作中的一项常规技 术，菌种的科学保藏和管理直接关系到检验结 果的正确性。
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菌种的来源
国内或国外认可的菌种收藏机构的 标准菌株，或使用与标准菌株所 有相关特性等效的商业派生菌株。
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菌种保藏的中心任务
- 广泛收集各种有用的微生物菌种。 -选择最适宜的保藏方法。
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菌种的保藏
工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业衍 生物仅可用作工作菌株。
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菌种的保藏
不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适宜的 保藏方法，菌种的保藏方法一般分四个阶段：
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菌种的保藏
⑴ 挑选特征典型的纯菌菌落。 ⑵确定保藏的合适菌体形态，孢子和芽 孢死亡代谢作用弱，同时对恶劣环境 有很强的抵抗力。 ⑶选择最适宜的方法。 ⑷定期对保藏的菌种进行鉴定，确定保 藏方法的有效性。
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常用菌种保藏方法
菌种保藏的原则 根据微生物菌种的生理、生化特性 降低微生物细胞的代谢强度。
微生物菌种常规保藏作业指导书
微生物菌种常规保藏作业指导书1目的规范药品微生物学检定的管理，最大限度降低变异率，确保菌种的溯源性与稳定性，从而确保微生物学检定结果的准确可靠。
2范围本规程适用于检定用细菌菌种的管理，包括菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等。
3职责实验人员严格按本管理规程的要求完成标准细菌菌种的申购、保存、传代、使用及销毁等工作。
4专业术语4.1标准菌种是指由中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌。
4.2传代用菌种是指标准菌种制备的采用特定保存方法长期固定保存的菌种，用于传代及制备工作用菌种。
4.3菌种的代是指将其接种至一新鲜培养基上或培养基内，每萌发一次即称为一代，从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代。
4.4菌种保藏微生物菌种用适宜的方法妥善保藏，避免死亡、污染，保持其原有性状基本稳定，以便于研究、交换和使用的目的。
4.5定期移植保藏法亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养、液体培养等。
是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适合的条件下培养，待菌种生长完全后，通常置于4～6℃进行保藏，并间隔一定时间进行移植培养的菌种保藏方法。
5检定菌种的申购由部门主管根据检定菌种的使用情况，提出购买计划，交由部门经理审批后，向中检所菌种保藏中心或省（市）药检所购买冻干菌种（标准菌种）；也可以直接向省（市）药检所购买传代用菌种，购买时，需询问与确定菌种的代数，以便传代时控制代数。
6定菌的接收菌种到达实验室后，由部门主管接收菌种，检查其名称和数量，以及每一支的完整性，同时将菌种的所有信息，填写在《检定菌接收记录》（附表1）上，内容包括：名称、数量、编号（无编号则按检定菌种的编号）、代数、来源、接收日期、接收人等，贴好标签并储存于2～8℃直到需要使用时。
储存期最长不超过5年。
7定菌的保存7.1工作用菌种的保存工作用菌种采用斜面低温保存法。
将菌种接种在适合的固体培养基上，待菌生长充分以后，转移至2～8℃冰箱中保存。
菌种使用和保存
补充：菌种的传代和保藏美国药典（USP）中规定：“将微生物接种至一新鲜培养基上/内，每萌发一次即称为一代，因此，当原始菌种复溶并转至一培养基内生长，即认为已传代一次，”并规定“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”。
我国的GMP认证中也如此要求，并且中国药典2005年版药典也已做出“菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代”这个明确的规定。
实验室菌种的传代保藏过程1. 按菌种说明书要求复溶菌粉，转种于适当的增菌培养基内（G1），复壮后转接至平板上，并于适当温度下培养适当时间，分离出单个纯种菌落，此为第2代（G2）。
2. 菌种鉴定完成后，挑取纯菌落制成浓菌悬液用于制备甘油冷冻管，同时挑取纯菌落转接斜面菌种作为工作用菌种。
此时，保藏菌种为第2代，但工作用菌种则为第三代。
3. 将第2代菌种管冷冻保存，将工作用菌种于适当温度下培养适当时间后可用于试验。
4. 取一支冷冻保存的G2代菌种转种于平板和斜面培养基上，平板上的菌种制成冷冻保藏管第三代（G3），斜面培养基经适当温度下培养适当时间后用作工作用菌种（W3）。
5. 将第三代菌种（G3）冷冻或低温保存，将生长、转种后的G2菌种经灭菌处理后丢弃。
6. 当工作用菌种代数小于5时，可直接用上一代工作用菌种转接下一代工作用菌种，如W3可直接转接为W4。
7. 按上述程序操作，直至G4转为W5为止，需重新开启安瓿，再重复上述操作程序、保藏和使用菌种。
以上方法中，菌种被分为两类。
传代用菌种和工作用菌种，传代用菌种用于甘油冷冻管法保藏，工作用菌种用斜面低温保藏法保藏。
实验证明，甘油冷冻管的有效期至少为2年，但其主要适用于细菌（需氧）、酵母菌的传代、保藏、对厌氧菌、真菌和芽孢类细菌则需应用其它方法。
中国医学微生物菌种保藏管理办法
《中国医学微生物菌种保藏管理办法》中文名中国医学微生物菌种保藏管理办法颁布单位卫生部颁布时间1985.03.23实施时间1985.03.23中国医学微生物菌种保藏管理办法根据中国微生物菌种保藏委员会管理和组织条例的规定，为了加强医学微生物菌种（以下简称菌种）的保藏管理，特制定本管理办法。
第一条组织及任务在卫生部领导下，在中国微生物菌种保藏委员会指导下，设下列医学微生物菌种保藏管理中心：中国医学真菌菌种保藏管理中心：由中国医学科学院皮肤病防治研究所负责。
中国医学细菌菌种保藏管理中心：由卫生部药品生物制品检定所负责。
中国医学病毒菌种保藏管理中心：由中国预防医学中心病毒学研究所负责。
保藏管理中心的任务是：（一）负责本门类微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应；（二）开展菌种分类、鉴定及保藏管理的研究；（三）组织学术交流和经验交流；（四）办理国内外菌种交换；（五）编制保管的菌种目录。
保藏管理中心下设专业实验室，承担全国性的业务工作。
专业实验室对其直接领导机构和保藏管理中心负责，并定期向管理中心汇报工作情况。
其具体任务是：（一）负责本专业有关微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应；（二）承担本专业有关疑难菌种鉴定；（三）开展有关菌种分类、鉴定、保藏的研究，包括新技术、新方法的研究和应用；（四）办理对外交流和交换菌种。
各专业实验室科研技术人员的编制和经费由所属主管部门负责。
生物制品生产、检定用的菌种按“生物制品生产、检定用菌种、毒种管理规程”执行，统一由卫生部药品生物制品检定所办理。
第二条菌种的分类菌种的分类根据其危险性决定（包括实验室感染的可能性，感染后发病的可能性，症状轻重及愈后情况，有无致命危险及有效的防止实验室感染方法，用一般的微生物操作方法能否防止实验室感染、我国有否此种菌种及曾否引起流行、人群免疫力等情况）。
依其危险程度的大小，我国的菌种分为四类。
一类：实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌种。
中国医学微生物菌种保藏管理办法
中国医学微生物菌种保藏管理办法根据中国微生物菌种保藏委员会管理和组织条例的规定，为了加强医学微生物菌种(以下简称菌种)的保藏管理，特制定本管理办法。
第一条组织及任务在卫生部领导下，在中国微生物菌种保藏委员会指导下，设下列医学微生物菌种保藏管理中心:中国医学真菌菌种保藏管理中心:由中国医学科学院皮肤病防治研究所负责。
中国医学细菌菌种保藏管理中心:由卫生部药品生物制品检定所负责。
中国医学病毒菌种保藏管理中心:由中国预防医学中心病毒学研究所负责。
保藏管理中心的任务是:(一)负责本门类微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应;(二)开展菌种分类、鉴定及保藏管理的研究;(三)组织学术交流和经验交流;(四)办理国内外菌种交换;(五)编制保管的菌种目录。
保藏管理中心下设专业实验室，承担全国性的业务工作。
专业实验室对其直接领导机构和保藏管理中心负责，并定期向管理中心汇报工作情况。
其具体任务是:(一)负责本专业有关微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应;(二)承担本专业有关疑难菌种鉴定;(三)开展有关菌种分类、鉴定、保藏的研究，包括新技术、新方法的研究和应用;(四)办理对外交流和交换菌种。
各专业实验室科研技术人员的编制和经费由所属主管部门负责。
生物制品生产、检定用的菌种按"生物制品生产、检定用菌种、毒种管理规程"执行，统一由卫生部药品生物制品检定所办理。
第二条菌种的分类菌种的分类根据其危险性决定(包括实验室感染的可能性，感染后发病的可能性，症状轻重及愈后情况，有无致命危险及有效的防止实验室感染方法，用一般的微生物操作方法能否防止实验室感染、我国有否此种菌种及曾否引起流行、人群免疫力等情况)。
依其危险程度的大小，我国的菌种分为四类。
一类:实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌种。
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三、菌种的检查与复壮
菌种的衰退 菌种经过长期人工传代培养或保藏，由自发突 变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的 现象。
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控制菌种的衰退方法 ⑴控制传代次数 ⑵创造适宜的培养条件 ⑶用不同类型的细胞进行传代 ⑷采用有效的保藏方法
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定期检查
菌种在保藏期间必须定期检查，发现变 异或衰退，应及时给予恢复。
试验菌种应是从国家菌种中心获得的标 准菌种，经过实验室复活并在适宜的培 养基中生长后保存.
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菌种保藏的中心任务是广泛收集各种
有用的微生物菌种，选择最适宜的保藏 方法，避免在保藏和传代过程中死亡、 变异、衰退及活力减弱，以保持菌种原 有的各种生物学特性，从而达到保证研 究、检验、交换和使用要求的目的。
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菌种保藏机构
中国菌种保藏管理委员会（CCCCM） 成立于1979年。下设7个菌种保藏管理中
心及有关专 业实验室，共12个单位实行统一领导，按
专业分工管理。 国外的菌种保藏机构
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常用菌种保藏方法
菌种保藏的原则 根据微生物菌种的生理、生化特性， 在人工创造的条件下尽量降低微生物 细胞的代谢强度，使细胞基本上处于 休眠状态，生长繁殖受到抑制但由不 至于死亡，以减低菌种的变异率。
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详细记录 菌种的来源、接收、传代、分离、复壮、使用和鉴 定等均应做好详细记录。包括菌种传代或使用时间、 名称、菌号、代数、传代或保存形式、分离复壮方 式、使用内容、鉴定情况等都应进行详细的记录。
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菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购 买应由登记，并包装严密。 菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理 应有详细记录。
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培养 ：接种后的培养基，根据不同微生物
生长条件的要求，置培养基于适宜微生物生 长的环境中，使其生长繁殖的过程。 需气培养法 厌氧培养法
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培养后微生物的生长判断 固体培养基 液体培养基
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菌种的传代和使用 菌液的制备和使用
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细菌的接种、分离和培养
接种、分离、培养是微生物学实验 的基本
作技术，要求严格的无菌操作和在 无菌环境下进行。
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常用培养基种类 斜面接种
半固体培养基 液体培养基 平板培养基
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接种方法 涂布法 划线法 穿刺法 直接加入法等
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分离：
分段划线法、连续划线法、涂布分 离法、倾注分离法等。
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2、实验室必须建立菌种保存和使用文 件化的程序管理制度. 3、菌种应冷藏或冷冻保存，保存菌种的 冰箱不得放置食品和易挥发性药品，放 置菌种的专门冰箱，应上锁管理。
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4、应由专人按操作规程和有关要求定期进 行传代，并定期对保存的菌种进行检查， 一般每年1～2次，（或定期更换栋干菌 种）。
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二、菌种的传代和使用
工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5 代，（从菌种保藏中心获得的标准菌株为第0 代）防止过度的传代造成菌种变异。1代是指 将活的培养物接种到新鲜培养基中，任何亚 培养的形式均被认为是转种或传代一次。必 要时，实验室应对工作菌株的特性和纯度进 行确认。
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菌悬液的制备与保存
菌悬液的制备与保存 采用经验证的方法制备菌悬液，除另有规定外，微生物限 度试验用菌悬液应按《中国药典2010年版》规定制备
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29Leabharlann 2020/4/2830
菌种保藏
微生物实验过程中，实验菌株可能是最敏感 的，因为它们的生物活性和特性依赖于合适 的试验操作和贮藏条件。
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实验室菌种的处理和保藏的程序应
标准化，使尽可能减少菌种污染和 生长特性的改变。按统一操作程序 制备菌株是微生物试验结果一致性 的重要保证。
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菌种保藏是微生物学检验工作中的一项 常规技术，菌种的科学保藏和管理直接 关系到检验结果的正确性
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常用菌种保藏方法
标准菌株的复活或培养物的制备应按供 应商提供的说明或按验证的方法进行。 标准储备菌株-从国内、外菌种收藏机构 获得的标准菌株经复活并在适宜的培养基 中生长后,既为标准储备菌株。
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低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件 都可以抑制微生物的代谢和生长繁殖，因 此低温、干燥和真空是菌种保藏的重要手 段。
标准储备菌株经纯度和特性确认后保存°
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工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的 商业衍生物仅可用作工作菌株。
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不同的微生物，应根据其生物特征来选择最 适宜 的保藏方法，菌种的保藏方法一般分 四个阶段：
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⑴ 挑选特征典型的纯菌菌落 ⑵确定保藏的合适菌体形态 ⑶选择最适宜的方法保藏 ⑷定期对保藏的菌种进行检查
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菌种的复壮 使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性的 过程。实验室主要采用分离纯化的方法。
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四、菌种的管理
1、使用菌种的单位，应具备从事微生
物工作的条件和设备。 菌种应由专人负责管理，管理人员应 具有微生物专业知识和技术水平，并应 具有较强的责任心。
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