诱导分化成熟脂肪细胞方案
脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序
脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序一、试剂准备（一）成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM）配方【1】：试剂名称浓度商品信息1.极限必须培养基(Dulbecco’S Modified Eagle Medium ，DMEM) 1.0 L(SH30021.01B, Hyclone)2.胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）10%(ES-009-B, Millipore)3.青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）1%（TMS-AB2C, CHEMICON）4.地塞米松(Dexamethasone,DM) 1µmo／L 分子量：392.46(D4902-25MG, Sigma)5.胰岛素(Insulin, IS) 10 µmol／L 分子量：5808(91077C—1g, Sigma)6.3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Isobutylmethylxanthine,IBMX) 0.5 mmol／L 分子量：222.24( I5879-100MG, Sigma)7.吲哚美辛(Indomethacin,ID) 200 µmol／L 分子量：357.79(I7378—5G, Sigma)（二）成脂分化诱导液浓储液配制试剂名称质量浓缩倍数配制方法1.Stock A胎牛血清1ml/管1X( liquid）分装1ml/管X100 保存：-20℃2.Stock B青霉素/链霉素0.1ml/管100X( liquid）分装0.1ml/管X100 保存：-20℃3.Stock C地塞米松0.0117738 g 1000X 溶于30ml 无水乙醇(0.1%) 分装0.1ml/管X300保存：-20℃4.Stock D胰岛素0.05808 g100X 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L，PH2.0) 分装0.1ml/管X100保存：4℃5.Stock E3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.05556 g 200X 溶于2.5ml DMSO(0. 5%) 分装0.05ml/EP管X50 保存：-20℃6.Stock F吲哚美辛0.07155 g 500X 溶于2ml 无水乙醇(0.2%) 分装0.02ml/管X100保存：-20℃（三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml）1.取DMEM(L)8.72ml加入15ml离心管（BD）;2.加1管Stock A（1ml）；3.加1管Stock B（0.1ml）；4.取1管Stock C（0.1ml）溶解，加入0.01ml；5.加1管Stock E（0.05ml）；6.加1管Stock F（0.02ml）；7.加1管Stock D（0.1ml）；8.测渗透压，调pH7.2-7.4;9.0.22µm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。
利用培育技术进行脂肪细胞培养的操作指南
利用培育技术进行脂肪细胞培养的操作指南现代生物技术的发展为各个领域带来了许多突破性的技术和方法，其中包括利用培育技术进行脂肪细胞培养。
脂肪细胞是人体内一种特殊的细胞类型，其对于肥胖和代谢疾病等研究具有重要意义。
本文将详细介绍利用培育技术进行脂肪细胞培养的操作指南，希望能为相关研究提供有价值的参考。
一、培养基准备脂肪细胞培养的第一步是准备适当的培养基。
建议使用基于DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）的培养基，并添加适当的补充物，如胰岛素、脂肪酸结合蛋白和抗生素。
同时，为了提供适宜的细胞黏附条件，可以将底物预先涂覆成聚-L-赖氨酸、明胶等。
二、细胞获取与传代脂肪细胞的获取可以通过组织切割、离心分离或细胞系购买等方式进行。
在获得脂肪组织后，应迅速将其转移到培养基中，并进行细胞分散。
这可以通过酶处理（使用胰蛋白酶）或机械分散等方法实现。
分散后的细胞应经过离心沉淀，并将上清转移至新的培养基中进行培养。
为了保持细胞的健康生长，定期进行细胞传代非常重要。
一般情况下，当培养皿中的细胞达到80%～90%的密度时，可进行传代。
传代时应用酶处理或机械振荡将细胞分散，然后按照适当的比例用新鲜培养基进行传代。
三、脂肪细胞分化脂肪细胞培养的核心目标是实现细胞的分化，使其发展成成熟的脂肪细胞。
为此，可在培养过程中添加适当的诱导剂，如甲基异丁基黄酮（IBMX）、地塞米松和青霉素/链霉素。
这些诱导剂可以启动脂肪细胞分化的关键信号途径，从而促进细胞向脂肪细胞的分化。
诱导过程中，要注意避免过度分化或细胞死亡。
适量的诱导剂添加和适时的培养基更换是维持细胞健康的关键。
此外，还可以通过观察细胞形态和特定的标记物表达来判断细胞分化的程度。
四、细胞存活与细胞功能评估脂肪细胞培养后，应对细胞存活和功能进行评估。
细胞存活率可以通过尝试剂（如Trypan blue染色）进行测定。
此外，还可以检测细胞中特定标记物的表达，如脂肪细胞特异性的标记物PPARγ和脂肪酸结合蛋白等。
脂肪细胞分化方法3T3-L1DifferentiationProtocol
3T3-L1 Differentiation ProtocolStep 1: 3T3-L1细胞传代于35或60-mm培养板中，使用DMEM-F12培养基培养2 day（以此为基点，即：诱导分化的第0 day）。
Step2: 使用诱导液I诱导3T3-L1分化。
加入配制好的诱导液I于3T3-L1细胞中，培养2 day（诱导分化的第2 day）。
诱导液I：0.5m M IBMX;0.25 μM地塞米松；1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。
Step3: 使用无血清培养基清洗细胞，去除残余的IBMX和地塞米松。
使用诱导液II诱导细胞分化，并培养2 day （诱导分化的第4 day）。
诱导液II：1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。
Step4: 最后用普通DMEM-F12培养基培养并每2 day 换一次液。
Step5: 每次实验前，用serum-free DMEM-F12 或KRP buffer 培养单层细胞2 h。
Step6: 用于实验的脂肪细胞应该在诱导分化后的8-12 day之间为宜。
这样的条件下≥ 95%的细胞表现为脂肪细胞的表型。
Step7: Oil Red O staining鉴定分化后的脂肪细胞内的脂质，可以使用油红染色。
细胞用PBS轻轻冲洗2次，使用10 %的formalin或4% paraformaldehyde 室温固定30 min。
固定后的细胞使用新配制的Oil Red O solution 染色（注意避光）1 h，之后只用蒸馏水轻轻冲洗3次，最后观察结果。
Oil Red O solution 配制：0.5%（W/V）的Oil Red O-异丙醇溶液。
取0.5%的Oil Red O-异丙醇溶液6份，加入4份的蒸馏水，配制成Oil Red O solution。
Step8: 获得结果并进行后期处理。
Other protocol can be used:美国密歇根大学的3T3-L1细胞分化的PROTOCOL(非常详细)3T3-L1 Differentiation ProtocolMATERIALSDulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; GibcoBRL-Cat# 11965-084: high glucose, with L-glutamine, with pyroxidine HCl, without sodium pyruvate)Calf Serum (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)Fetal Bovine Serum (GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)-filter sterilize (0.22um filter) before mixed into DMEMIsobutylmethylxanthine (IBMX; Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)SOLUTIONS10% Calf Serum/DMEM60mL Calf Serum6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEM10% FBS/DMEM60mL Fetal Bovine Serum (Filter Sterilized)6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEMIBMX Solution (make fresh)a)Dissolve IBMX in a solution made of 0.5N KOH to a final concentration of 0.0115g/mL.b)Filter sterilize through a 0.22 mm syringe filter.Insulin Stock Solution167 uM (1mg/mL) in 0.02M HClFilter sterilized through 0.22 mm filterCan store at -20C for long term, 4C short term.Dexamethasone Stock SolutionsFreezer Stock: 10mM of Dex in 100% ethanol (store at -20C)Working Stock: Dilute Freezer stock to 1mM in PBSFilter sterilize and store at 4C.MDI Induction Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:100 IBMX1:1000 Insulin1:1000 Dexam ethasone working stockInsulin Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:1000 InsulinMETHODPreadipocyte maintenance and passage:We plate the cells in 10% CS/DMEM on treated polystyrene culture dishes from Corning (Cat#430167) and incubate them at 37C in 10% CO2. It is important to feed the preadipocytes every couple of days and avoid letting them get too confluent (>70%), if you want to continue to passage them and differentiate them at a later date. So, take care to split them appropriately. They can be split as far as 1:15, though we usually do 1:10 or less depending on need.Adipocyte Differentiation Protocol:1. Grow preadipocytes to confluency in 10% calf serum/DMEM2. Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media. You will notice a distinct change in the morphology of the cells (becom e more spindly) in the next 2 days.3. Two days after MDI (DAY 2) change the media to Insulin Media. The m edia will begin to get more viscous as free fatty acids are produced by the cells and secreted into the media.4. Two days later (DAY 4) change media to 10% FBS/DMEM. Feed cells with 10%FBS/DMEM every two days. Full differentiation is usually achieved by DAY 8.。
脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序
脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序一、试剂准备（一）成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM）配方【1】：试剂名称浓度商品信息1.极限必须培养基(Dulbecco’S Modified Eagle Medium ，DMEM) 1.0 L(SH30021.01B, Hyclone)2.胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）10%(ES-009-B, Millipore)3.青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）1%（TMS-AB2C, CHEMICON）4.地塞米松(Dexamethasone,DM) 1µmo／L 分子量：392.46(D4902-25MG, Sigma)5.胰岛素(Insulin, IS) 10 µmol／L 分子量：5808(91077C—1g, Sigma)6.3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Isobutylmethylxanthine,IBMX) 0.5 mmol／L 分子量：222.24( I5879-100MG, Sigma)7.吲哚美辛(Indomethacin,ID) 200 µmol／L 分子量：357.79(I7378—5G, Sigma)（二）成脂分化诱导液浓储液配制试剂名称质量浓缩倍数配制方法1.Stock A胎牛血清1ml/管1X( liquid）分装1ml/管X100 保存：-20℃2.Stock B青霉素/链霉素0.1ml/管100X( liquid）分装0.1ml/管X100 保存：-20℃3.Stock C地塞米松0.0117738 g 1000X 溶于30ml 无水乙醇(0.1%) 分装0.1ml/管X300保存：-20℃4.Stock D胰岛素0.05808 g100X 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L，PH2.0) 分装0.1ml/管X100保存：4℃5.Stock E3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.05556 g 200X 溶于2.5ml DMSO(0. 5%) 分装0.05ml/EP管X50 保存：-20℃6.Stock F吲哚美辛0.07155 g 500X 溶于2ml 无水乙醇(0.2%) 分装0.02ml/管X100保存：-20℃（三）成脂分化诱导液工作液配制（10ml）1.取DMEM(L)8.72ml加入15ml离心管（BD）;2.加1管Stock A（1ml）；3.加1管Stock B（0.1ml）；4.取1管Stock C（0.1ml）溶解，加入0.01ml；5.加1管Stock E（0.05ml）；6.加1管Stock F（0.02ml）；7.加1管Stock D（0.1ml）；8.测渗透压，调pH7.2-7.4;9.0.22µm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。
3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化及油红O染色步骤
3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化1)将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37℃、5％CO2培养;2)待细胞长满至80-90%，融合2天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为0.5 mmol/L IBMX（储存液浓度0.5 mmol/L）、终浓度为1 umol/L(储存液浓度为1 mg/ml (2.5 mmol/L)) DEX和终浓度为10 ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48 h；（诱导剂临用时再加到培液中混匀）加入aspirin(5 mM)，salsalate(1、5 mM)3)48 h后换含终浓度为10 ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液再培养48h，48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2天后换培养液一次，诱导分化8～12天，3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。
油红O染色1）先小心轻缓倒去培养夜。
2）用pbs轻缓漂洗。
3）加10%多聚甲醛固定30 min。
4）用60％异丙醇洗涤5）油红O母液现用现配：称取0.5g油红O粉末，以异丙醇溶解并定容至100 ml，4℃避光贮存。
稀释油红O母液，油红：去离子水＝3:2，滤纸过滤，室温放置10 min（除去一些杂质，染色结果更清晰）。
6）油红O染色10 min左右，加的体积覆盖住板底即可，如6孔加1. 5 ml，24孔加0.5-1 ml（实际染色时间1小时都可以）。
7）脱色，用75%酒精/60%异丙醇漂洗，除去多余的染料（实际用其他平衡液洗也没问题，背景并不会残留多少）。
8）甘油明胶封片。
9）显微镜观察拍照。
TL诱导分化成熟脂肪细胞方案
TL诱导分化成熟脂肪细胞方案为了诱导分化成熟脂肪细胞，需要采取一系列措施来模拟体内脂肪细胞的发育过程。
下面是一个基于胎儿稳定细胞株人类成熟脂肪细胞系（ST-13）的方案，在富含小鼠成年体内碎屑坏死和抗生素的DMEM培养基中进行诱导分化。
1.培养脂肪前体细胞：将ST-13细胞接种于DMEM培养基中，并在37℃、5%CO2的条件下培养。
培养基需添加10%胎牛血清（FBS）和生长因子（如胰岛素、肾上腺皮质激素等），以促进细胞增殖和生长。
2. 诱导分化：当细胞生长到80%的密度时，将培养基更换为富含诱导因子的培养基，如胰岛素、胰高血糖素苷（IBMX）和去氧皮质酮（Dex）等。
让细胞在这样的培养基中继续培养48小时。
3.培养终分化脂肪细胞：将细胞培养基更换为富含10%FBS和高浓度胰岛素的DMEM培养基。
这样的培养条件可以帮助细胞继续分化成完全成熟的脂肪细胞。
4. 油红O染色：使用油红O染色方法来检测分化程度。
将细胞固定在4% paraformaldehyde中，然后用60%异丙醇洗涤。
将油红O溶液添加到细胞上，染色20分钟后洗涤。
观察细胞内的红色油滴，这是脂肪细胞特有的特征。
5.RT-qPCR：利用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）来测量脂肪细胞特异基因表达水平。
收集分化脂肪细胞，提取总RNA，并合成cDNA。
使用特异性引物检测目标基因的表达水平，如脂肪细胞标记基因PPARγ和C/EBPα等。
6.蛋白质免疫印迹：用免疫印迹方法检测特定蛋白质的表达水平。
收集分化脂肪细胞，提取蛋白质，并进行电泳分离。
将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶上，然后用特异性抗体检测目标蛋白质的表达水平。
7. 脂肪细胞代谢测定：应用适当的测定方法来评估脂肪细胞代谢特性。
例如，使用改良的AdipoRed（泛素酯类）试剂，它可以选择性地结合脂肪细胞中的甘油三酯，以测定细胞的脂肪含量。
8. 细胞迁移和侵袭实验：测量分化脂肪细胞的迁移和侵袭能力，以评估其功能。
3t3-l1细胞诱导分化原理
3t3-l1细胞诱导分化原理
3T3-L1细胞是一种常用的成纤维细胞株，可通过特定的诱导条件转分化为脂肪细胞。
其诱导分化的原理是通过连续培养和控制细胞外
环境，使细胞经历特定的分化过程。
首先，3T3-L1细胞会被培养在含有高营养的培养基中，其中含有高浓度的葡萄糖和羊血清。
这一步骤有助于细胞增殖和发育。
接下来，在细胞生长至达到密度的时候，减少培养基中营养物的浓度，同时添
加较低浓度的羊血清。
这种改变细胞外环境的操作有助于减少细胞增殖，促进细胞向分化方向发展。
然后，在细胞进入密集生长阶段之后，可以应用一种称为诱导剂
的物质来促使细胞向脂肪细胞分化。
常用的诱导剂有一种混合物，包
括二甲苯和异丙基甲基酰胺(DMI)。
这种物质可以诱导细胞内的转录因
子PPARγ和C/EBPα的表达，这两个转录因子在脂肪细胞分化中起到
关键作用。
最后，在细胞处于诱导剂作用下，可以观察到细胞的形态和特征
从成纤维样逐渐转变为脂肪细胞特征。
这包括细胞膜的变化、细胞内
脂滴的积聚以及与脂肪细胞相关的基因表达的增加。
综上所述，3T3-L1细胞的诱导分化原理主要包括通过调节细胞外环境和应用特定的诱导剂，促使细胞向脂肪细胞方向分化，并最终表
现出脂肪细胞特征。
骨髓间充质干细胞成脂诱导分化
骨髓间充质干细胞成脂诱导分化
1.1 接种干细胞
取对数生长期的细胞，按照2.0x 10e4cells/cm2的细胞密度接种至培养器皿，于37°C,5% CO2培养环境下培养至汇合度90~100%，弃掉上清，加入成脂诱导分化培养基诱导液。
NOTE:如细胞贴壁性较差，建议使用0.1%明胶对培养底面进行包被。
1.2 细胞分化诱导
于37°C, 5% CO2培养环境下培养约3天，更换为成脂诱导分化培养基维持液，培养1天后，再更换为成脂诱导分化培养基诱导液，继续培养3天。
按照以上换液频率诱导14~21天,并注意观察细胞形态变化。
根据细胞诱导形成的脂滴数量和大小，决定终止细胞诱导的时间，并进行染色鉴定。
2. 染色鉴定
2.1 细胞固定
吸去培养基使用适量1xPBS清洗一次,弃去后取适量4%中性甲醛溶液覆盖培养器皿底面,室温固定30~60min,弃去固定液再使用1xPBS 清洗两次。
2.2 油红0染色
取生理盐水或1xPBS与油红O原液配制油红0工作液(油红0原液:生理盐水=3:2)，现用现配。
配制后可对油红0工作液进行离心，以沉淀染色液中的过饱和析出物。
向清洗干净的诱导孔内加入适量油红0工作液,静置染色30min。
吸走油红0工作液，用1xPBS清洗两次，并加入适量1xPBS避免细胞干燥。
2.3 诱导评估
显微镜下观察成脂染色效果，并进行图像采集和诱导评估。
诱导成功时，脂滴与油红0染料结合后呈现红色或橘红色。
NOTE:干细胞的成脂分化水平因细胞类型、细胞供体来源，培养条件、细胞代次、细胞状态和分化时间等因素而异。
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诱导分化成熟脂肪细胞
方案
集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018)
Dexamethasone (Sigma D-4902)
Insulin (Bovine; Sigma I-5500)
gibco血清：小牛血清 (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)
胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)
培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084）
MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)
Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)
一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿， 3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿。
共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。
二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。
两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。
三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。
一、诱导液配制
1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。
分子量222，几乎不溶于水，现配现用，过滤除菌。
100×母液（50mmol/L）： IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。
每毫升培养基加10ul IBMX.
2、胰岛素溶液配制。
比较难溶，-20℃保存1个月，使用PH 2~3的稀盐酸溶液助溶，过滤除菌。
100×母液（1mg/ml）：10mg INS+10ml L HCL。
每毫升培养基加10ul胰岛素。
3、地塞米松溶液配制。
分子量，过滤除菌，-20℃保存1个月。
使用无水乙醇溶解，1000×母液（1mmol/L）。
1mg溶于25ml无水乙醇，每1ml加10ul。
二、3T3-LI细胞系的培养、诱导
1、按常规贴壁细胞培养法培养于含l0% NCS DMEM高糖培养基中，37℃、体积分数为5％CO
2、饱和湿度条件下培养，2d换液一次。
2、3T3-Ll细胞系的诱导：细胞生长状态良好时实验。
细胞传代分瓶，每一瓶中的细胞数约为1×105，每48h换液。
当细胞接触抑制2d后，加入诱导剂 (10%胎牛血清FBS的高糖DMEM培养液（含10ug/ml胰岛素，1umol/L地塞米松，L IBMX），培养2d。
然后换为10%胎牛血清的高糖DMEM培养液（含10ug/ml的胰岛
素），培养2d。
改为10%的胎牛血清的DMEM培养液，每2d换液一直到诱导成为成熟的脂肪细胞(细胞体积增大，细胞中出现串状的脂肪滴)，占总体积的90%。
三、注意事项
1、待细胞接触抑制后2d加入诱导剂。
太早，细胞没有退出生长周期。
太迟，细胞诱导后容易漂浮。
2、3T3细胞株20代以后分化困难，最好挑选5代左右开始诱导分化。
将细胞冻存起来，使用时再复苏。
3、大约需要8~10天，可以诱导分化成功。
之后换液处理需要轻缓，以免损失细胞。
4、诱导前后使用油红O染色鉴定。
证明是成熟脂肪细胞，而不是空泡样变性。
方法：油红O是一种可以特异地和细胞内三酰甘油结合的红色染料，与未分化细胞和细胞外脂质不结合。
吸弃培养板里的分化培养基；1×PBS冲洗细胞2次或3次；加入10%的甲醛磷酸盐缓冲液4 mL/孔，室温固定1 h；吸弃固定液；加入油红O溶液，室温染色3 h；吸弃染色剂；无菌三蒸水冲洗2次，洗去未着色染料；显微镜下观察，照相。