3T3-L1诱导分化成熟脂肪细胞方案
小鼠3T3-L1前脂肪细胞培养与诱导分化方法的建立
小鼠 ３ Ｔ ３ 一 Ｌ １ 前脂肪 细胞培 养与诱导分化 方法 的建立
郭秀玲 徐民 岗 张秀丽 师 磊 陈显 久
【 摘
要】 目的 建立小 鼠 ３ Ｔ ３ ． Ｌ １ 前脂肪细胞 的培养及诱导分化为成熟脂肪 细胞 的方法 。 方法
使用含
１ ０ ％胎牛血清（ Ｆ Ｂ Ｓ ） 的高糖 达氏修正伊 氏培养基 （ Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ） Ｆ １ ２ 液体培养基 在体 积分数 ５ ％二氧化碳 （ ｃ ｏ ） 、 ３ ７℃ 条件下 常规培养 ３ Ｔ ３ Ｌ １ 细胞 ， ２ － ３ ｄ 换液 １次 ； 诱导分化 培养基 １培养 ２ ｄ ， 诱 导分化培养基 Ⅱ培养 ２ ｄ ； 基础培 养基培养 ４ ～ ６ ｄ ， １ － ２ ｄ 换液 １ 次。 结果 小 鼠 ３ Ｔ ３ ． Ｌ １ 前脂肪 细胞状态 良好 ， 成铺路石状生长 ， 布满培养 瓶底 ， ３ ｄ 传代 １ 次。 ９ ０ ％以上细胞诱导分化成功 ， 细胞呈 圆形 ， 有大量酯滴 聚集 ， 油红 Ｏ染色呈橘红色 。 结论
ｕ ｎ ｄ ｅ ｒ ａ ｎ ａ ｔ ｍｏ ｓ ｐ ｈ ｅ ｒ ｅ ｗ ｉ ｔ ｈ ５ ％ Ｃ ０， ａ ｔ ３ ７℃． ｄ ｕ ｉ ｒ ｎ ｇ ｗｈ ｉ ｃ ｈ ｔ ｈ ｅ ｉ ｎ ｃ ｕ ｂ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗａ ｓ ｒ ｅ ｐ ｌ ｅ ｎ ｉ ｓ ｈ ｅ ｄ ｅ ｖ ｅ ｒ ｙ ２ ｔ ｏ ３ ｄ ａ ｙ ｓ ．
３ Ｔ３ 一 Ｌ １ ｐ ｒ ｅ ａ ｄ ｉ ｐ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ｓ ｇ ｒ ｅ ｗ ｉ ｎ ａ ｐ ａ ｖ ｉ ｎ ｇ ｓ ｔ ｏ ｎ ｅ ｆ ａ ｓ ｈ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ａ ｐ ｐ ｅ ａ ｒ ｅ ｄ ｉ ｎ ｇ ｏ ｏ ｄ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ． ｈｅ Ｔ ｓ ｅ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｃ ｏ ｖ ｅ ｒ ｅ ｄ ｔ ｈ ｅ ｂ ｏ ｔ ｔ ｏ ｍ ｏ ｆ
3T3-L1诱导分化小结
3T3-L1 前体脂肪细胞诱导分化小结1、诱导液配制先配母液：IBMX（0.5 mM）碱性溶液或乙醇溶解，由于下面的Dex 需要用乙醇溶解，所以这里建议用碱性溶液溶解，因为乙醇对细胞分化有影响（可以查到相关文献）。
100×母液配制：0.0115 g IBMX + 940 µl dd H2滤膜过这只是1 ml体积，你可以按照比例多配些。
保存温度我记不清了，你自己查一下。
Dex (1 µM)配制成1000×母液，-20 ℃保存Insulin (10 µg/ml, 比文献中报道的浓度高，可能是我买的胰岛素是分装的，效价比他们的低些，你可以稍微摸索一下)配制成300×母液溶于pH 2-3 0.22µm滤膜过滤除菌，用PCR小管分装，-20以上母液配好后，下面来配诱导液：诱导液Ⅰ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 600 µl IBMX + 200 µl Insulin + 60 µl Dex再加140 µl DMEM 补齐到60 ml诱导液Ⅱ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 200 µl Insulin再加800 µl DMEM 补齐到60 ml注：“59 ml DMEM”可以用20 ml或30 ml注射器加比较方便。
最终浓度：IBMX 0.5 mMDex 1 µMInsulin10 µg/ml2、诱导分化程序按照经典的“鸡尾酒”法进行诱导分化，稍微改动点，具体细节自己把握。
一般第5天可以看到明显脂滴，第8-10天左右，能有90%左右的分化率。
未分化的3T3-L1 第5天以上所述，仅供参考。
许多细节自己可以根据实验结果来摸索调整。
提前大家实验顺利，新年快乐！xiaoma44。
诱导分化成熟脂肪细胞方案
诱导分化成熟脂肪细胞方案集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)gibco血清：小牛血清 (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084）MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿， 3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿。
共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。
二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。
两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。
三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。
一、诱导液配制1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。
3T3-L1细胞诱导分化
3T3-L1细胞诱导分化首先细胞数一定要够，接触抑制后，加诱导液，诱导液一（IBMX 是SIGMA的，浓度我用0.5m mol/l,配的时候用DMSO浓缩1000倍，DEX我用的是Solarbio分装的100MG的也用DMSO 溶，Ins我用的人用胰岛素，医院买的），最主要的是要细胞代数20代以内，换诱导液2时不用1ML的移液枪加用200ul的慢慢加.让细胞长满以后，接触抑制2天（是细胞退出生长周期），加入含有IBMX（一般使用浓度0.5mmol/L），DEX（地塞米松，一般使用浓度是1umol/L）和insulin（胰岛素，一般使用浓度1-10ug/ml）的培基2天，再换成只含胰岛素的培基2天，然后每两天换液（普通培基）。
这是分化的步骤，但是最关键的是细胞的传代次数，我现在就在做诱导，细胞传代次数较多，分化率很低。
一般说不能超过20代，最好在10代以内。
诱导分化中，细胞的传代数和状态是最重要的。
诱导剂的配制IBMX(异丁基-甲基-黄嘌呤):分子量：222.2（Sigma:I5879）-20度保存用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml（0.5mol/L）储存液终浓度为0.5mmol/L,即每100ml培养液加100ul储存液。
DEX：分子量：392.5（Sigma:D4902）-20度保存用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液终浓度为1umol/L,即每100ml培养液加40ul储存液。
可用2年。
Insulin：分子量：6000 ,4度保存原液为诺和灵R：400IU/10ml终浓度为10ug/ml,即每100ml培养液加600ul原液。
4度保存3T3-L1前脂肪细胞株的诱导分化1)将3T3-L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37℃、5％CO2培养;2)待细胞长满至80-90%，融合2天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为0.5mmol/L IBMX （储存液浓度0.5mmol/L）、终浓度为1umol/L(储存液浓度为1mg/ml(2.5mmol/L))DEX 和终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48h；（诱导剂临用时再加到培液中混匀）3)48h后换含终浓度为10ug/ml的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液再培养48h，48h后再换10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2天后换培养液一次，诱导分化8～12天3T3-L1细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可用于实验。
3T3-L1 细胞说明书
小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1说明书目录号：SCSP-5038细胞名称：3T3-L1细胞描述：这株细胞是3T3（Swiss albino）通过克隆分离而得到的能连续传代的亚株，表达insulin受体。
当细胞从快速分裂到汇合和接触抑制状态的过程中，细胞会经历脂肪前向脂肪的转化。
培养基中的高血清含量会增加脂肪的积累。
检测表明鼠痘病毒（ectromelia virus，ECTV）阴性。
小鼠品系：Swiss albino细胞来源：2018年引进生物安全等级：BSL-1完全培养液配方：见下方备注批次/冻存日期：详见冻存管/培养瓶标识参考传代周期：3天左右参考传代比例：1:2-1:4参考换液频率：每周2次冻存液：完全培养液95%，DMSO5%细胞状态：成纤维细胞，贴壁生长。
支原体检测结果：阴性STR鉴定结果：①该株细胞DNA进行小鼠细胞STR分型结果显示，扩增后图谱清晰，分型结果良好：1-1：10,15；1-2：13；2-1：9；3-2：14；4-2：19.3；5-5：13,15；6-4：15.3；6-7：12, 15；7-1：25.2,29；8-1：15,16；11-2：15；12-1：19；13-1：15.1；15-3：20.3；17-2：12,15；18-3：17,21；19-2：12；X-1：26。
②该株细胞确为小鼠细胞，没有人源细胞污染。
小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1细胞照片参考文献：备注：1.小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1完全培养液配方（100ml）：DMEM(Invitrogen11960044)87mlNewborn calf serum(Ausbian)10mlGlutamax（invitrogen35050061）1mlNon-essential Amino Acids,100⨯(Invitrogen11140050)1mlSodium pyruvate100mM Solution（invitrogen11360070）1ml不可使用胎牛血清（FBS）2.该细胞起始接种密度应在3⨯103/cm2，并且在细胞达到80%融合或者密度介于5⨯104-6⨯104/cm2时传代，避免细胞完全融合。
脂肪细胞分化方法 3T3-L1 Differentiation Protocol
3T3-L1 Differentiation ProtocolStep 1: 3T3-L1细胞传代于35或60-mm培养板中，使用DMEM-F12培养基培养2 day（以此为基点，即：诱导分化的第0 day）。
Step2: 使用诱导液I诱导3T3-L1分化。
加入配制好的诱导液I于3T3-L1细胞中，培养2 day（诱导分化的第2 day）。
诱导液I：0.5m M IBMX;0.25 μM地塞米松；1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。
Step3: 使用无血清培养基清洗细胞，去除残余的IBMX和地塞米松。
使用诱导液II诱导细胞分化，并培养2 day （诱导分化的第4 day）。
诱导液II：1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。
Step4: 最后用普通DMEM-F12培养基培养并每2 day 换一次液。
Step5: 每次实验前，用serum-free DMEM-F12 或KRP buffer 培养单层细胞2 h。
Step6: 用于实验的脂肪细胞应该在诱导分化后的8-12 day之间为宜。
这样的条件下≥ 95%的细胞表现为脂肪细胞的表型。
Step7: Oil Red O staining鉴定分化后的脂肪细胞内的脂质，可以使用油红染色。
细胞用PBS轻轻冲洗2次，使用10 %的formalin或4% paraformaldehyde 室温固定30 min。
固定后的细胞使用新配制的Oil Red O solution 染色（注意避光）1 h，之后只用蒸馏水轻轻冲洗3次，最后观察结果。
Oil Red O solution 配制：0.5%（W/V）的Oil Red O-异丙醇溶液。
取0.5%的Oil Red O-异丙醇溶液6份，加入4份的蒸馏水，配制成Oil Red O solution。
Step8: 获得结果并进行后期处理。
Other protocol can be used:美国密歇根大学的3T3-L1细胞分化的PROTOCOL(非常详细)3T3-L1 Differentiation ProtocolMATERIALSDulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; GibcoBRL-Cat# 11965-084: high glucose, with L-glutamine, with pyroxidine HCl, without sodium pyruvate)Calf Serum (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)Fetal Bovine Serum (GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)-filter sterilize (0.22um filter) before mixed into DMEMIsobutylmethylxanthine (IBMX; Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)SOLUTIONS10% Calf Serum/DMEM60mL Calf Serum6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEM10% FBS/DMEM60mL Fetal Bovine Serum (Filter Sterilized)6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEMIBMX Solution (make fresh)a)Dissolve IBMX in a solution made of 0.5N KOH to a final concentration of 0.0115g/mL.b)Filter sterilize through a 0.22 mm syringe filter.Insulin Stock Solution167 uM (1mg/mL) in 0.02M HClFilter sterilized through 0.22 mm filterCan store at -20C for long term, 4C short term.Dexamethasone Stock SolutionsFreezer Stock: 10mM of Dex in 100% ethanol (store at -20C)Working Stock: Dilute Freezer stock to 1mM in PBSFilter sterilize and store at 4C.MDI Induction Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:100 IBMX1:1000 Insulin1:1000 Dexamethasone working stockInsulin Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:1000 InsulinMETHODPreadipocyte maintenance and passage:We plate the cells in 10% CS/DMEM on treated polystyrene culture dishes from Corning (Cat#430167) and incubate them at 37C in 10% CO2. It is important to feed the preadipocytes every couple of days and avoid letting them get too confluent (>70%), if you want to continue to passage them and differentiate them at a later date. So, take care to split them appropriately. They can be split as far as 1:15, though we usually do 1:10 or less depending on need.Adipocyte Differentiation Protocol:1. Grow preadipocytes to confluency in 10% calf serum/DMEM2. Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media. You will notice a distinct change in the morphology of the cells (become more spindly) in the next 2 days.3. Two days after MDI (DAY 2) change the media to Insulin Media. The media will begin to get more viscous as free fatty acids are produced by the cells and secreted into the media.4. Two days later (DAY 4) change media to 10% FBS/DMEM. Feed cells with 10%FBS/DMEM every two days. Full differentiation is usually achieved by DAY 8.。
3T3-L1诱导分化小结
3T3-L1 前体脂肪细胞诱导分化小结1、诱导液配制先配母液：IBMX（0.5 mM）碱性溶液或乙醇溶解，由于下面的Dex 需要用乙醇溶解，所以这里建议用碱性溶液溶解，因为乙醇对细胞分化有影响（可以查到相关文献）。
100×母液配制：0.0115 g IBMX + 940 µl dd H2滤膜过这只是1 ml体积，你可以按照比例多配些。
保存温度我记不清了，你自己查一下。
Dex (1 µM)配制成1000×母液，-20 ℃保存Insulin (10 µg/ml, 比文献中报道的浓度高，可能是我买的胰岛素是分装的，效价比他们的低些，你可以稍微摸索一下)配制成300×母液溶于pH 2-3 0.22µm滤膜过滤除菌，用PCR小管分装，-20以上母液配好后，下面来配诱导液：诱导液Ⅰ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 600 µl IBMX + 200 µl Insulin + 60 µl Dex再加140 µl DMEM 补齐到60 ml诱导液Ⅱ：59 ml DMEM（10% FBS）+ 200 µl Insulin再加800 µl DMEM 补齐到60 ml注：“59 ml DMEM”可以用20 ml或30 ml注射器加比较方便。
最终浓度：IBMX 0.5 mMDex 1 µMInsulin10 µg/ml2、诱导分化程序按照经典的“鸡尾酒”法进行诱导分化，稍微改动点，具体细节自己把握。
一般第5天可以看到明显脂滴，第8-10天左右，能有90%左右的分化率。
未分化的3T3-L1 第5天以上所述，仅供参考。
许多细节自己可以根据实验结果来摸索调整。
提前大家实验顺利，新年快乐！xiaoma44。
脂肪细胞分化方法3T3-L1DifferentiationProtocol
3T3-L1 Differentiation ProtocolStep 1: 3T3-L1细胞传代于35或60-mm培养板中，使用DMEM-F12培养基培养2 day（以此为基点，即：诱导分化的第0 day）。
Step2: 使用诱导液I诱导3T3-L1分化。
加入配制好的诱导液I于3T3-L1细胞中，培养2 day（诱导分化的第2 day）。
诱导液I：0.5m M IBMX;0.25 μM地塞米松；1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。
Step3: 使用无血清培养基清洗细胞，去除残余的IBMX和地塞米松。
使用诱导液II诱导细胞分化，并培养2 day （诱导分化的第4 day）。
诱导液II：1μg/ml insulin;含10% FBS 的DMEM-F12。
Step4: 最后用普通DMEM-F12培养基培养并每2 day 换一次液。
Step5: 每次实验前，用serum-free DMEM-F12 或KRP buffer 培养单层细胞2 h。
Step6: 用于实验的脂肪细胞应该在诱导分化后的8-12 day之间为宜。
这样的条件下≥ 95%的细胞表现为脂肪细胞的表型。
Step7: Oil Red O staining鉴定分化后的脂肪细胞内的脂质，可以使用油红染色。
细胞用PBS轻轻冲洗2次，使用10 %的formalin或4% paraformaldehyde 室温固定30 min。
固定后的细胞使用新配制的Oil Red O solution 染色（注意避光）1 h，之后只用蒸馏水轻轻冲洗3次，最后观察结果。
Oil Red O solution 配制：0.5%（W/V）的Oil Red O-异丙醇溶液。
取0.5%的Oil Red O-异丙醇溶液6份，加入4份的蒸馏水，配制成Oil Red O solution。
Step8: 获得结果并进行后期处理。
Other protocol can be used:美国密歇根大学的3T3-L1细胞分化的PROTOCOL(非常详细)3T3-L1 Differentiation ProtocolMATERIALSDulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM; GibcoBRL-Cat# 11965-084: high glucose, with L-glutamine, with pyroxidine HCl, without sodium pyruvate)Calf Serum (GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)Fetal Bovine Serum (GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)-filter sterilize (0.22um filter) before mixed into DMEMIsobutylmethylxanthine (IBMX; Sigma I-7018)Dexamethasone (Sigma D-4902)Insulin (Bovine; Sigma I-5500)MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)SOLUTIONS10% Calf Serum/DMEM60mL Calf Serum6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEM10% FBS/DMEM60mL Fetal Bovine Serum (Filter Sterilized)6mL 100mM MEM Sodium Pyruvate6mL 100x P/S/G500mL DMEMIBMX Solution (make fresh)a)Dissolve IBMX in a solution made of 0.5N KOH to a final concentration of 0.0115g/mL.b)Filter sterilize through a 0.22 mm syringe filter.Insulin Stock Solution167 uM (1mg/mL) in 0.02M HClFilter sterilized through 0.22 mm filterCan store at -20C for long term, 4C short term.Dexamethasone Stock SolutionsFreezer Stock: 10mM of Dex in 100% ethanol (store at -20C)Working Stock: Dilute Freezer stock to 1mM in PBSFilter sterilize and store at 4C.MDI Induction Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:100 IBMX1:1000 Insulin1:1000 Dexam ethasone working stockInsulin Media (10mL/10cm plate; 5mL/6cm plate)To required volume of 10% FBS/DMEM add:1:1000 InsulinMETHODPreadipocyte maintenance and passage:We plate the cells in 10% CS/DMEM on treated polystyrene culture dishes from Corning (Cat#430167) and incubate them at 37C in 10% CO2. It is important to feed the preadipocytes every couple of days and avoid letting them get too confluent (>70%), if you want to continue to passage them and differentiate them at a later date. So, take care to split them appropriately. They can be split as far as 1:15, though we usually do 1:10 or less depending on need.Adipocyte Differentiation Protocol:1. Grow preadipocytes to confluency in 10% calf serum/DMEM2. Two days post confluency (DAY 0) stimulate the cells with MDI induction media. You will notice a distinct change in the morphology of the cells (becom e more spindly) in the next 2 days.3. Two days after MDI (DAY 2) change the media to Insulin Media. The m edia will begin to get more viscous as free fatty acids are produced by the cells and secreted into the media.4. Two days later (DAY 4) change media to 10% FBS/DMEM. Feed cells with 10%FBS/DMEM every two days. Full differentiation is usually achieved by DAY 8.。
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Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018)
Dexamethasone (Sigma D-4902)
Insulin (Bovine; Sigma I-5500)
gibco血清：小牛血清(GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198)
胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566)
培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084）
MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070)
Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016)
一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿，3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿。
共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。
二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。
两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。
三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。
一、诱导液配制
1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。
分子量222，几乎不溶于水，现配现用，0.22um过滤除菌。
100×母液（50mmol/L）：11.5mg IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。
每毫升培养基加10ul IBMX.
2、胰岛素溶液配制。
比较难溶，-20℃保存1个月，使用PH 2~3的稀盐酸溶液助溶，0.22um 过滤除菌。
100×母液（1mg/ml）：10mg INS+10ml 0.01mol/L HCL。
每毫升培养基加10ul 胰岛素。
3、地塞米松溶液配制。
分子量516.41，0.22um过滤除菌，-20℃保存1个月。
使用无水乙醇溶解，1000×母液（1mmol/L）。
1mg溶于25ml无水乙醇，每1ml加10ul。
二、3T3-LI细胞系的培养、诱导
1、按常规贴壁细胞培养法培养于含l0% NCS DMEM高糖培养基中，37℃、体积分数为5％CO
2、饱和湿度条件下培养，2d换液一次。
2、3T3-Ll细胞系的诱导：细胞生长状态良好时实验。
细胞传代分瓶，每一瓶中的细胞数约为1×105，每48h换液。
当细胞接触抑制2d后，加入诱导剂(10%胎牛血清FBS的高糖DMEM培养液（含10ug/ml胰岛素，1umol/L地塞米松，0.5mmol/L IBMX），培养2d。
然后换为10%胎牛血清的高糖DMEM培养液（含10ug/ml的胰岛
素），培养2d。
改为10%的胎牛血清的DMEM培养液，每2d换液一直到诱导成为成熟的脂肪细胞(细胞体积增大，细胞中出现串状的脂肪滴)，占总体积的90%。
三、注意事项
1、待细胞接触抑制后2d加入诱导剂。
太早，细胞没有退出生长周期。
太迟，细胞诱导后容易漂浮。
2、3T3细胞株20代以后分化困难，最好挑选5代左右开始诱导分化。
将细胞冻存起来，使用时再复苏。
3、大约需要8~10天，可以诱导分化成功。
之后换液处理需要轻缓，以免损失细胞。
4、诱导前后使用油红O染色鉴定。
证明是成熟脂肪细胞，而不是空泡样变性。
方法：油红O是一种可以特异地和细胞内三酰甘油结合的红色染料，与未分化细胞和细胞外脂质不结合。
吸弃培养板里的分化培养基；1×PBS冲洗细胞2次或3次；加入10%的甲醛磷酸盐缓冲液4 mL/孔，室温固定1 h；吸弃固定液；加入油红O溶液，室温染色3 h；吸弃染色剂；无菌三蒸水冲洗2次，洗去未着色染料；显微镜下观察，照相。