高效液相色谱法测定婴儿配方奶粉中乳铁蛋白含量.

中 圈 奶 斗２ ０ １ ５ ・ １ ３
Ｍ Ｉ ＬＫ Ａ Ｎ Ｉ ）Ｍ Ｉ Ｉ Ｋ ＰＲ０Ｄ ＵＣＴ
圈
高效 液相 色谱法测定 婴儿 配方奶粉 中 乳铁蛋 白含量
贾云虹 ，宋晓青 ，杨凯 ，申雪然
（ 河北 三元食 品有 限公 司技术研发部 ，石 家庄
０ ５ ０ ０ ７ ３ ）
Ｎ ａ ２ Ｈ Ｐ Ｏ ４ ＋ １ ． ０ ｍｏ ｌ ／ Ｌ ￣ ｌ ９ ， Ｎ ａ Ｃ Ｉ 溶液 （ ｐ Ｈ ７ ． ０ ０），梯 度洗 ２ ． １ ． ３ 检 测 波长 、流 速及 进 样体 积 的确 定
脱 流速 度 １ ｍＬ／ ｍｉ ｎ ，洗脱 程序 如表 １ 所示。
表１ 梯度洗脱程序
法还能把乳铁蛋白与其他蛋 白有效分离。肝素琼脂糖柱
是 分 离糖 基 化 蛋 白质 的通 用 工具 。 肝素 琼脂 糖 柱 中 的配
体是 自然存在的硫酸化糖胺聚糖 ，肝素由交互的糖醛酸
和 Ｄ一 葡 糖 胺 单 位 组 成 ，其 中 大 多 数被 一 个 或 两 个 硫 酸 基 团取 代 。 固定 化 的 肝索 与乳 铁 蛋 白具 有 两种 主 要 的相
１ 材料 与 方法
蛋 白含 量 较 人 乳低 较 多 ］ 。 因此 ，通 过 研 究 向婴 Ｌ ｉ ｎ ｇ 方 １ ． １ 仪 器
奶粉 中添加 从 牛 初乳 中分 离 纯化 获 得 的乳 铁 蛋 白 ，使 其 母乳 化 ，将 使母 乳化 奶 粉 的研 究上 一个 新 的台 阶 。 目前 ，文献 报 道 的乳铁 蛋 白的检 测技 术 主 要有 ：随 机 免 疫扩 散 法 、放 射免 疫分 析 法 、酶联 免 疫法 、高 效 毛 细管 电泳 法 、反 相 高效 液相 色 谱 法
Ｃ１ ８ 、Ｃ ４ 、Ｃ ８ 等 反相 色 谱 柱 是 高 效 液 相 色 谱 法分 磷 酸盐 缓 冲液 的流 动相 一 致 ，不会 引入 新 的物 质 。 离 乳铁 蛋 白的常 用色 谱柱 ，用 它们 分 离成 分 相对 简 单 的 乳铁 蛋 白标准 品和婴 儿配 方奶粉 样 品色谱 图如 图１ 和
２ ． １ ． ２ 流动 相 的确 定 肝 素 琼脂 糖 亲 和 柱在 ｐ Ｈ为５ ～ １ ０ 范 围 内是稳 定 的 ， 适 用 于所 有缓 冲 溶 液 ， 因此选 用 ｐ Ｈ ７ ． ０ 的磷 酸缓 冲 溶 液 作 为结 合 缓 冲 溶 液 ，在 进 样前 ，用５ ～ １ ０ 倍 柱 体 积 的此
色 谱 柱 为 Ｈｉ Ｔ ｒ ａ Ｐ ＨｅＰａ ｒ ｉ ｎ肝 素 琼 脂 糖 亲 和 柱 缓 ； 中 溶液 平 衡柱 子 。根 据 乳铁 蛋 白和 肝 素琼 脂 糖 亲和 柱 （０． ７ Ｘ ２． ５ Ｃ ｍ 。１ ｍ Ｌ ）， 柱 温 ３０℃ ， 检 测 波 长 的结 合特 性 ，增 加 离 子强 度 ，可 以把 乳 铁蛋 白从柱 上 洗 ２ ３ ０ｎ ｍ ，进 样 体 积 ５ ０ ｕ Ｌ，流 动 相 Ａ为５０ ｍｍｏＩ ／ Ｌ的 脱 下 来 ，因此 在流 动 相 Ｂ 中加入 Ｎ ａ ＣＩ ，采用 梯 度洗 脱 ， Ｎａ ２ ＨＰＯ４ 溶 液 （Ｐ Ｈ７ ． ０ ０ ），流 动 相 Ｂ为５ ０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的 逐 渐增 加 离子 强度 ，最 终 把乳 铁蛋 白洗 脱 下来
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ５ — ０ １ — ０ ８
生 物科 技有 限公 司。
基 金项 目 ： 石家 庄市 科技 支撑 计划 项 目 （ 编号 ： １ ４ １ １ ７ １ ２ ０ １ Ａ） 。 作者简介 ： 贾云 虹 （ １ ９ ７ ４ 一】 ，女 ，河 北 人 ，工 程 师 ，主要 从 事 乳 制品 及其 检测 方法 开发 工作 。
安 捷伦 １ １ ０ ０ 高 效 液相 色 谱仪 （ Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ ），带 紫外 或 二极 管 阵列 检 测器 ，分 析 天平 ，ｐ Ｈ 计。
２ 试 剂
磷 酸氢 二 钠 、氯化 钠 、磷酸 ：均 为分 析纯 。 乙醇 ：
、分 光 色 谱纯 。 乳铁 蛋 白标 准 品 ：纯 度９ ８ ％，产地 日本 ，上 海惠 诚
白含 量 迅速 下降 ，到 达 常乳 时 趋于 平稳 。人 初乳 中的 乳 趋 势 。 铁 蛋 白质 量 浓度 为５ —７ ｇ ／ Ｌ ，常乳 中为 １ — ３ ｇ ／ Ｌ ，牛 初乳 中为０ ． ８ ｇ ／ Ｌ 左右 ，牛 常乳 中为０ ． １ ～ ０ ． ４ ｇ ／ Ｌ 。 牛乳 的乳 铁
为两个方面 ：一是作为氨基酸的食蛋 白源 ，二是有利于 铁的生物利用。此外其还有利于改善婴儿 的肠道菌群 、
一
种方便快捷、准确可靠 、精 密度高、重现性好的检测
方法 。以满 足 生产 企业 和 职 能监 督 部 门的 需要 ，本研 究
提高机体免疫力 、减少疾病等作用。人与牛的初乳 中乳 采用的免疫亲和高效液相色谱法正符合这一特点 ，而且 铁蛋 白含量较高 ，随着泌乳过程的进行 ，乳 中的乳铁蛋 仪 器 便 于普 及 ，是 婴Ｊ Ｌ ｉ ￣ ｇ 方奶 粉 中乳铁 蛋 白检 测 的 发展
时间 （ ａｉ ｒ ｎ ）
０ １ ５ ２ ２ ２ ２ ． １
２ ８
选 择乳 铁 蛋 白标 准溶 液 ，用 二极 管 阵列 检 测器 进 行 光 谱 扫描 ，发现 其最 大 吸 收波长 在 ２ ２ Ｏ ｎ ｍ左右 ，有强 末
端 吸 收 ，但 在该 波 长 时 ，基线 不 平稳 ，噪 声较 大 ，而 在 ２ ３ ０ ｎ ｍ时 ，基 线 噪声较 小 ，灵敏 度高 ，因此 选择 ２ ３ ０ ｎ ｍ
容 量 瓶 中 ，过 滤 ，滤 液用 ０ ． ４ ５ ｕｍ微 孔 滤膜 过 滤 至 液 相 ２ ． ２ 样 品 处理 方 法 的 选择 色 谱 进样 瓶 中 ，然 后注 射 进 ＨＰ Ｌ Ｃ。 根 据标 样 峰 面 积 和
婴 儿 配 方 奶 粉 成 分 复 杂 ，蛋 白种 类 多 ，各 种 物 质 干 扰 大 ， 为 了得 到 比较 纯 净 的样 品 ，分 别采 用 ６ ０ ％乙醇 沉 淀 、磷 酸 调 ｐ Ｈ 沉 淀 、硫 酸 铵 盐 析 法 进 行 试 验 ，结 果
乳制品
柚
２ ． “ 婴 儿配 方奶扮 样 品 ｐ 乳铁 蠢 白分蕈 的ｊ 州定
本 研究 选 取 了市 售 的几 种婴 Ｊ Ｌ ｉ ！ ｉ Ｉ 方奶 粉 ．对 其 中 的 乳铁 蛋 白含 量 进 行 了测定 ，结 果 如表４ 。
浓 度建 立标 准 曲线 。从 而计 算样 品中乳 铁 蛋 白含 量 。
２ 结 果与讨 论
２ １ 色谱 务件 的 确 定
２ ． １ ． １ 色 谱柱 的选 择
发 现 用 乙醇沉 淀和 硫酸 铵 盐析 法 制备 样 品 ，稳 定 性 差 。
回收 率低 ，而 用 磷酸 调 ｐ Ｈ为４ ． ６ ，除 去酪 蛋 白后 ，再 过 滤 ，操 作 简 单 ， 回收 率 高 。 而 且 采 用 磷酸 调 ｐ Ｈ 值 ，与
粉 中乳铁 蛋 白，操作 简单 ，结果准确可靠 ，精 密Байду номын сангаас 高 ，重现性好 。
关键词 ：婴Ｊ Ｌ ｉ ￣ ｅ 方奶粉 ；高效 液相 色谱 ；乳铁蛋 白 ；肝素 琼脂 糖
乳铁 蛋 白又称 “ 乳转 铁蛋 白” ，是 可 结合 铁 的糖 蛋 光度 法 、表 面 等离 子共 振 技术 等 ，这些 检 测技 术 各 有 白质 ，为铁 蛋 白 的一 种 。 乳铁 蛋 白是 人 乳 中 的４ 种 主 要 优 缺 点 。婴 Ｊ ｔ ｉ ￣ ｇ 方 奶粉 中乳铁 蛋 白的检 测 目前还 没 有 国 蛋 白质 之 一 ，约 占人 乳 总蛋 白的２ ０ ％ ，其 营养 价值 主 要 家标 准 和行 业 标准 。婴儿 配 方奶 粉 成分 比较 复杂 ，需要
互作用模式。肝素可作 为亲和配体 ，和乳铁蛋 白相互作
用 ，由于 肝 素具 有 阴离 子 的硫 酸 基 团 ，所 以其 还 是高 容
＊ 口ＨＲ
图１ 乳铁蛋白标准品色谱图
Ｉ ５ ０
卞 国 ｊ ！ ｝２ ０ １ ５ ・ １ ３ 乳 与
Ｍ Ｉ Ｉ Ｋ ＡＮ １ ） １ Ｉ Ｉ Ｋ ＰＲ０ Ｊ １ ） Ｕ ｒ ｒ
１ ． ３ 标 准溶 液 配制
乳 铁蛋 白标 准 贮 备 液 （ １ ． Ｏ ｍｇ ／ ｍＬ）：准 确 称 取 乳
４ ９ Ｉ
Ｉ 乳制品 卞 圈 码 片２ ０ １ ５ ・ １ ３
Ｍ Ｉ ＬＫ ＡＮ Ｉ ）Ｍ Ｉ Ｉ １ － （ＰＲＯ ＤＵＣＴ
乳 与ｊ
铁 蛋 白标 准 品 １ ０ ｍｇ 于１ ０ ｍＬ 容量 瓶 中 ，用超 纯 水溶 解 定 量 的阳离 子 交换 剂 。 因此 ，选 择 肝 素琼 脂糖 亲 和柱 ，可 容 至刻 度 。
中图分 类号 ：Ｔ Ｓ ２ ５ ２ ． １ 文献标识码 ：Ａ 文章编号 ：１ ０ ０ ４ — ４ ２ ６ ４（ ２ ０ １ ５） １ ３ － ０ ０ ４ ９ — ０ ３
摘 要 ：本研 究建立 了一种 用 高效 液相 色谱测 定婴 儿配方奶 粉 中乳铁 蛋 白的方 法。 色谱 条件 ：色谱 柱为Ｈｉ
样 品确 实 能 得 到 较 好 的 效 果 ，但 婴 儿 配 方 奶 粉 成 分 复 图２ 。所 以样 品 中的其他 蛋 白质 由于 不 与肝 素琼脂 糖免 疫 杂 。且 乳铁 蛋 白含 量 低 ，各 种 杂蛋 白干扰 较 大 ， 以上 方 亲 和柱结 合 ，所 以保 留 时间短 ， 早 早地 流 出色谱柱 。
以使 乳铁 蛋 白特异 性 地与 其 结合 ，而不 受奶 粉 中其 他 蛋
乳铁 蛋 白标 准工作 液 ：将乳铁 蛋 白贮备液 用磷酸 氢二 白质 的干 扰 。
钠缓 冲溶液稀释 成０ ． ２ ｍｇ ／ ｍＬ 、０ ． １ ｍｇ ／ ｍ Ｌ 、０ ． ０ ５ ｍｇ ／ ｍＬ 、
Ｏ ． ０ ２ ｍｇ ／ ｍＬ 、０ ． ０ １ ｍｇ ／ ｍＬ ｆ ￣ ９ ， 标 准溶 液 系列 ，经０ ． ４ ５ ｕ ｍ 微７ Ｌ ／ ］ ￣ 过滤 ，滤液 供进 样 用。 ｌ 一 ｝ 色谱 备 什