1株髓细胞瘤型J亚群禽白血病病毒感染性克隆的构建与病毒拯救

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鸽源新城疫病毒JS0704Pi株感染性分子克隆的构建及病毒拯救1

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病毒学报２８卷
４引物设计参照ＧｅｎＢａｎｋ上公布的鸽源新城疫Ｐｒｅｍｉｅｒ５．０引物设计软件设计引物，引物由上海生工病毒ＪＳ／０７／０４／Ｐｉ株全序列，在全基因组序列单酶切生物技术有限公司合成，其中在Ｐ１Ｆ和Ｐ９Ｒ分别添位点分析基础上，将基因组分成九段，然后用Ｐｒｉｍｅｒ加与ＴＶＴ７／Ｒ载体相连的ＢｓｍＢⅠ酶切位点（表１）。
用ＤＮＡｓｔａｒ中的ＭｅｇＡｌｉｇｎ软件找出各段保
真质粒并确定连接方向。首先Ｐ１、Ｐ２、Ｐ９首尾相连于ｐＣＲ２．１上，再经ＢｓｍＢⅠ 酶切与经ＢｂｓⅠ 酶切后的转录载体ＴＶＴ７／Ｒ相连，构建了重组质粒Ｔ１２９；片段Ｐ３～Ｐ８扩增的６个片段依次相连构建出Ｐ３８；Ｐ３８经ＡｇｅⅠ和ＭｌｕⅠ酶切后回收大片段与经同样酶切的Ｔ１２９相连，构建出含ＪＳ／０７／０４／Ｐｉ基因的ｃＤＮＡ全长转录载体ＴＶＴ／０７１２０４（图１）。
ｃＤＮＡ克隆，并进行了病毒的拯救。
材料与方法
１毒株、细胞株、鸡胚、单抗 Ⅵｂ亚型鸽源新城疫病毒ＪＳ／０７／０４／Ｐｉ株由本室从江苏发病鸽体内分离并保存，该毒株的鸡胚平均致死时间（ＭＤＴ）为８８．２ｈ，１日龄雏鸡脑内接种致病指数（ＩＣＰＩ）为１．２，６周龄静脉接种致病指数（ＩＶＰＩ）为０．８９，在两月龄肉鸽上的ＩＶＰＩ为１．１［４］；稳定表达Ｔ７ＲＮＡ聚合酶的ＢＳＲ－Ｔ７／５细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所步志高研究员惠赠；ＳＰＦ种蛋购自山东省ＳＰＦ实验种鸡场；抗ＮＤＶ血清由本室制备并保存；抗Ｆ蛋白的单克隆抗体由本室研制并保存。２质粒和菌株转录载体ＴＶＴ７／Ｒ（０．０）由美国Ａｌａｂａｍａ大学Ｌ．ＡｎｄｒｅｗＢａｌｌ教授惠赠；ｐＣＲ２．１载体购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；宿主菌Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α为本室保存；表达ＮＰ和Ｐ基因的真核表达质粒（ｐＣＩ－ＮＰ和ｐＣＩ－Ｐ）由刘玉良等构［５］建，表达Ｌ基因的真核表达质粒（ｐＣＩ－Ｌ）由胡顺林等构［６］建。３主要试剂高保真ＤＮＡ聚合酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、Ｔｒｉｚｏｌ、ＡＭＶ反转录酶购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；转染试剂ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ为Ｒｏｃｈｅ公司生产；质粒抽提试剂盒（ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉＰｒｅｐＫｉｔ）为Ｑｉａｇｅｎ公司产品；各种限制性内切酶均购自Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ生物工程公司；Ａｍｐｉｃｉｌｉｎ、Ｘ－ｇａｌ、ＩＰＴＧ购自Ｓｉｇｍａ公司；新生胎牛血清购自Ｔｈｅｒｍｏ公司；ＤＭＥＭ培养基购自美国ＧＩＢ－ＣＯ公司；ＦＩＴＣ标记的羊抗鼠ＩｇＧ购自Ｓｉｇｍａ公司。

禽白血病病毒多重PCR检测法的建立及初步应用

禽白血病病毒多重PCR检测法的建立及初步应用管宏伟;吴润;赵春林;刁小龙;罗鹏;何轶群【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2012(047)005【摘要】根据GenBank中登录的禽白血病病毒A、B、J亚群的核苷酸序列设计合成了3对引物,各对引物可分别扩增出大小约为195、260、924 bp的核苷酸片段；经优化建立禽白血病病毒多重PCR检测法,并进行其敏感性试验及对马立克病病毒(MDV)、火鸡疱疹病毒(HVT)、新城疫病毒(NDV)、传染性囊病病毒(IBDV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和DF-1细胞基因组的特异性试验；应用该方法对1294份临床样品进行禽白血病病毒检测,对阳性检出样品抽样进行测序鉴定.结果表明:该方法的最小检出拷贝数为103,特异性试验均为阴性,检出临床样品中的核苷酸片段与参考毒株核苷酸序列的同源性达98％以上,符合率100％,具有良好的特异性、敏感性和符合率,可为禽白血病病毒感染的临床诊断及流行病学调查研究提供有效借鉴.【总页数】6页(P12-17)【作者】管宏伟;吴润;赵春林;刁小龙;罗鹏;何轶群【作者单位】甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,甘肃兰州730046;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.H5、H9亚型禽流感病毒及鸭坦布苏病毒多重 PCR 检测方法的建立及初步应用[J], 李海琴;傅光华;黄瑜;韦启鹏;唐维国2.猪瘟病毒猪细小病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒猪伪狂犬病病毒多重PCR方法的建立以及初步应用 [J], 赵耘;秦玉明;张广川;赵启祖;宁宜宝;戴志红;谢磊3.A、B、J和K亚群禽白血病病毒多重PCR检测方法的建立及应用 [J], 俞燕;周生;李建梅;高明燕;程旭;姜逸;赵秀美;徐步4.猪δ冠状病毒、猪流行性腹泻病毒和猪萨佩罗病毒多重RT-PCR检测方法的建立及初步临床应用 [J], 丁庆文;闫晓光;张红垒;李倩倩;张云飞;舒祥力;单法;李林姣;胡慧5.J亚群禽白血病病毒TD-PCR检测方法的建立及初步应用 [J], 杭柏林;秦爱建;钱琨;金文杰;沈海玉;吴晓平;仇钰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

J亚型禽白血病病毒的拯救与鉴定

J亚型禽白血病病毒的拯救与鉴定王超;缪华先;谢宝婵;张伟伟;吴润;刘光清【摘要】为鉴定含J亚群禽白血病病毒(ALV-J)全长cDNA分子克隆(pBlALV)的感染性,首先将pBlALV转染CEF细胞,拯救出病毒(rALV),然后连续传代3次,对拯救病毒进行增殖培养.分别利用RT-PCR、western blot、IFA等方法,对拯救病毒进行鉴定,并应用实时荧光定量PCR方法对拯救病毒的复制动力学进行了测定.研究结果证明,本研究成功拯救出了具有感染性的rALV-J,为研究禽白血病的致病机理和探讨新的防制措施等提供了良好的ALV的反向遗传操作技术平台.%To confirm the infectivity of the fiill-length cDNA clone (pBlALV) of subgroup J avian leucosis virus (ALV-J) HPRS103 strain, pBlALV was transfected into chicken embryo fibroblast (CEF) cells and the ALV was rescued. The rescued ALV (rALV-J) was identified by RT-PCR, western blot and indirect immunofiuorescence assay, respectively. Besides, the real-time PCR was applied to evaluate the replication dynamic of the rescued virus. The results showed that the rALV-J was able to well replicate in CEF. This study provides an useful platform for investigation of the pathogenesis and molecular biology of ALV-J.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2011(033)011【总页数】4页(P837-840)【关键词】J亚群禽白血病病毒;ALV-J;感染性克隆【作者】王超;缪华先;谢宝婵;张伟伟;吴润;刘光清【作者单位】甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;惠州出入境检验检疫局,广东惠州516001;惠州出入境检验检疫局,广东惠州516001;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;甘肃农业大学动物医学院,甘肃兰州730070;中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241【正文语种】中文【中图分类】S852.65禽白血病是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)和禽肉瘤病病毒(Avian sarcoma virus，RSV)引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称[1]。

一种番鸭细小病毒感染性克隆的构建及拯救方法[发明专利]

专利名称：一种番鸭细小病毒感染性克隆的构建及拯救方法专利类型：发明专利
发明人：王建业,黄钰,王志仙,凌珏怡,朱国强,孟霞,朱礼倩
申请号：CN201710299948.5
申请日：20170502
公开号：CN107012170A
公开日：
20170804
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种番鸭细小病毒(Muscovy duck
parvovirus,MDPV)感染性克隆的构建和拯救方法。

该方法是将MDPV的完整基因组克隆入载体质粒pBSKN，获得重组质粒；将重组质粒与转染试剂混合后，通过绒毛尿囊膜途径接种非免疫番鸭胚，重组质粒在番鸭胚中得到拯救；所述pBSKN载体，是将商品化质粒pBluescript II(SK)多克隆位点原有的EcoRV酶切位点用NcoI位点替换而得到。

产生的感染性病毒可致死番鸭胚，拯救病毒与亲本病毒对雏番鸭具有相近的致死率。

该拯救方法操作简便高效，避免了转染原代细胞带来的繁琐和低效问题，在MDPV反向遗传学研究和疫苗创制上具有潜在应用价值。

申请人：扬州大学
地址：225009 江苏省扬州市大学南路88号
国籍：CN
代理机构：南京知识律师事务所
代理人：卢亚丽
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猪圆环病毒1型感染性克隆的构建与病毒拯救

ＬｉＣｈａ－ｉ，ＷＥＩＹａＷＵ，ＬＵｄｎｇｍｎｇｎ－Ｙｕｅｈａ，ＺＨＡＮＧａ－ａ－ｕＺｈｏｘｉ，ＹＵＡＮｉ，ＨＵＡＮＧ・ｎｇＪｎｇＬｉｐｉ
（ｖｓｎｏｗｉｅＩｆｃｉｕｓａｅＮａｉｎｌｙＬｂｒｔｒｆｔｒａｙＢｏｅｈｏｏｙＨｒｉｅｅｉａｙＤｉｉｉｆｏＳｎｎｅｔｓＤｉｓ，ｔａａｏａｏｏｅｎｒｉｔｃｎｌｇ，ａｂｎＶｔｒｒｏｅｏＫｅｙＶｅｉｎ
ＴｗｏｃｐｅｆｔｅｇｎｍｅｗｅｅｌａｅｎｔｎｅｔｏｓｕｔａｆｃｉｕｌｎｆＰＶＡａｒｓｒｃｉｎｅｚｍｅｓｅｗａｏｉｓｏｅｏｒｉｔｄｉａｄｍｏｃｎｔｃｎｉｅｔｓｃｏｅｏＣ１ｈｇｒｎｏ．ＳｌＩｅｔｉｔｎｙｉｓｏｔ
中图分类号：￥５．５８２６文献标识码：Ａ文章编号：１０．５９２０）３０６．４０８０８（０８０．１１０
Ｃｏｓｒｃｉｎａｄｖｒｓｒｓｕｆａｎｅｔｕｎｔｕｔｎｉｅｃｅｏｎｉｆｃｉｓｏｕｏｃｏｅｏｏｃｅｃｏｉｓｔｐｌｎｆｐｒｉｉｖｙｅ１ｎｒｃｒｕ
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第３０卷第３期
２０年３月０８
中国预
防兽
医学报
Ｖｏ．０．１３Ｎｏ．３Ｍａ．２８ｒ００
ＣｈｎｓｏｒａｆＰｅｅｔｅＶｅｅｉａｙＭｅｉｉｅｉｅｅＪｕｎｌｒｖｎｉｔｒｒｄｃｎｏｖｎ

LTR对J亚群禽白血病病毒感染的影响

LTR对J亚群禽白血病病毒感染的影响冯少珍;李娇;吴晓婵;曹伟胜;廖明【摘要】为探讨LTR基因在骨髓瘤病变型J亚群禽白血病病毒(ALV-J) NX0101致病中的作用,利用反向遗传将血管瘤病变型ALV-J HN06株中两端LTR元件替换至NX0101株的相应位置,拯救出重组病毒NX-HNLTR株.人工接种7日龄SPF雏鸡,分别检测NX0101株和NX-HNLTR株对鸡体的影响.感染鸡生长都较慢.感染NX0101株的鸡,胸腺指数和腔上囊指数明显比对照组低,脾脏指数与对照组相比波动较大,骨髓和脾脏在攻毒后3周可检测到病毒整合到基因组中,胸腺和腔上囊在攻毒后6周才检测到.感染NX-HNLTR株的鸡脾脏指数明显比对照组低,攻毒后2周可检测到病毒整合到脾脏基因组中,骨髓和胸腺分别在攻毒后3周和6周检测到.结果提示,LTR对NX0101株感染鸡的免疫器官有一定的影响.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2012(048)003【总页数】4页(P3-6)【关键词】J亚群禽白血病病毒;骨髓瘤病变型;长末端序列;病毒基因整合【作者】冯少珍;李娇;吴晓婵;曹伟胜;廖明【作者单位】华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642;华南农业大学兽医学院,广东广州510642【正文语种】中文【中图分类】S852.65+9.3J亚群禽白血病病毒（Subgroup J avian leukosis virus，ALV－J）属于禽α反转录病毒属。

Payne等在1991年首次在肉鸡中发现 ALV－J［1］，我国在1999年证实 ALV－J的存在［2－3］，2002年，首次发现蛋鸡存在J亚群禽白血病［4－5］。

但不到10年的时间，全国已有相当多的鸡场发现该病，其主要临床表现为骨髓瘤、血管瘤、淋巴瘤、纤维肉瘤等多种肿瘤［6］，造成鸡群免疫抑制，并成为其他疾病的诱因。

禽J亚群白血病的PCR鉴定与病理学分析

山东畜牧兽医
２１年第３卷０２３
禽Ｊ亚群白血病ｆＰＲｌＣ鉴定与病理学分析ｔＪ
刘峰董辉（省济南市长清区文昌畜牧兽医站２００）山东５３０
摘要对山东济南某蛋鸡养殖场送检的５只发病鸡，通过ＰＲｃ方法进行实验室诊断并进行病理组织学分析。结果发
蛋鸡（５日龄）１０，引物由大连ＴＫＲａａａ生物工程有限公司合
成，组织ＤＮ取试剂盒、Ｔｑａ酶购自上海生工，常规石蜡切片所需材料由山东农业大学临床病理实验室提供。１禽白血病ＰＲ．２Ｃ鉴定取病死鸡肝脏、肺脏、骨髓等
病料研磨组织匀浆液，１００／ｎ心１ｍｉ，取上清２０ｒｍｉ离０ｎ液，用试剂盒提取总ＤＮＡ样本。参照曲悦等方法，设计
［６２】郑浩，高飞，徐晔等．应用上海乳房炎检测法检测奶牛隐性乳房
炎【】Ｊ．畜牧与兽医，０６３（）４－８２０，８１：７４．［７２】欧阳五庆，光武，文平等．牛羊隐性乳房炎快速诊断法研究唐席
［］Ｊ．黑龙江畜牧兽医，９５（）１－４１９，５：２１．
ＰＲ。ＰＲ步骤参考李宏民［略作修改：反应体系分别ＣＣ６
加入ｔｍｐａｅＤｅｌｔＮＡ１，１ｘＣｕｆｒ５ｌＮＴｌ０ＰＲｂｆｅｕ、ｄＰｐ、
山东济南某蛋鸡养殖场，养殖商品蛋鸡５０套，于００
１０日龄左右开始零星发病，一个月内死亡约ｌ只，送１０Ｏ只病鸡到山农业大学动物临床病理实验室进行疾病诊断。ＰＲ鉴定后进行病理组织学观察。Ｃ

J亚群禽白血病病毒感染DF-1细胞的蛋白质组学研究的开题报告

J亚群禽白血病病毒感染DF-1细胞的蛋白质组学研究的开题报告一、选题的背景和意义：白血病是一种常见的疾病，其发生率不断增高，尤其是在家禽群体中的发生越来越严重。

白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的一种疾病。

ALV是一种肿瘤病毒，能够引起家禽血液病理学、免疫学变化和造成家禽免疫抑制等症状。

该病毒属于反转录病毒，且具有极强的致癌性和快速变异的特点。

目前，在家禽养殖业中，白血病对养殖业的发展造成了很大的威胁和影响。

因此，了解ALV感染后细胞的生物学变化对于研究ALV致病机理以及研究相关的治疗手段都具有重要意义。

蛋白质组学作为一项高通量技术，在研究ALV感染后的细胞生物学变化方面具有广泛的应用潜力。

当前，利用蛋白质组学技术可以对ALV感染后的细胞进行全面的蛋白质组分析，以发现新的标志蛋白和病毒生物学行为的调节蛋白，并对其功能进行初步研究，为进一步研究ALV的致病机理和疗效评价提供基础数据。

二、研究的主要内容和方法：（1）主要内容：本研究旨在应用蛋白质组学技术研究ALV感染后DF-1细胞的蛋白质组学变化，探索ALV感染调控蛋白质的变化和功能，为后续研究ALV的致病机理和疗效评价提供基础数据。

（2）研究方法：通过纯化ALV感染后DF-1细胞的总蛋白，应用蛋白质分离、鉴定和功能分析等技术手段对ALV感染后DF-1细胞蛋白质组学进行系统研究并分析相关蛋白质的功能。

具体包括：1.纯化ALV感染后DF-1细胞的总蛋白。

2.应用二维凝胶电泳对ALV感染后DF-1细胞的总蛋白进行分离。

3.利用液相色谱质谱技术（LC-MS/MS）鉴定分离出的蛋白质并建立蛋白质质量数据库。

4.利用蛋白质组学分析软件对LC-MS/MS 数据进行定量分析和生物信息学分析。

5.设计和实施RNA干扰等技术对表达差异蛋白的功能进行深入研究。

三、研究的预期目标和意义：（1）预期目标：1. 研究ALV感染后DF-1细胞的总蛋白质组学变化；2. 提供ALV感染调控蛋白质的变化和功能基础数据；3. 为后续研究ALV的致病机理和疗效评价提供基础数据。

J亚群禽白血病病毒分离株HLJ09SH01株感染性克隆的构建及其致病性研究

ＨＬＪ０９ＳＨ０１ｉｓｏｌａｔｅｄｉｎＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇｐｒｏｖｉｎｃｅａｎｄｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｃｌｏｎｅｏｆｐＢｌｕｅ — ＨＬＪ０９ＳＨ０１ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｖｅｃｔｏｒ
ｏｆｈｅｒｓａｎｄｂｒｏｉｌｅｒｓ，ｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｔｈｅｐｒｏｖｉｕｓｒｅＤＮＡｏｆＡＬＶ— ＪｗａｓａｍｐｌｉｉｆｅｄｂｙＰＣＲｆｒｏｍＡＬＶ— Ｊ
ＪＩＸｉａｏ－ｌｉｎ， Ⅵ ，ＡＮＧＱｉ，ＧＡＯＹｕ－ｌｏｎｇ，、７ｌ，ＡＮＧＹｏｎｇ－ｑｉａｎｇ，ＱＩＮＬｉ — ｔｉｎｇ，ＱＩｘｉａｏ — ｌｅ，
ＧＡＯＨｏｎｇ一１ｅｉ．ＷＡＮＧＸｉａｏ — ｍｅｉ
ｄｏｉ：１０．３９６９￣．ｉｓｓｎ．１００８－０５８９．２０１３．１３．０４
Ｊ亚群禽白血病病毒分离株ＨＬＪ０９ＳＨ０１株感染性克隆的构建及其致病性研究
纪晓琳，王琦，高玉龙，王永强，秦立廷，祁小乐，高宏雷，王笑梅
中图分类号：￥８５２．６５文献标识码：Ａ文章编号：１００８．０５８９（２０１３）０１．００１５．０４

一种重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒及其制备方法和应用[发明专利]

专利名称：一种重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒及其制备方法和应用
专利类型：发明专利
发明人：廖明,赖汉漳,曹伟胜,张贺楠,辛朝安
申请号：CN200910213800.0
申请日：20091215
公开号：CN101899465A
公开日：
20101201
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒及其制备方法和应用。

本发明是将J亚群禽白血病病毒前病毒基因两端的长末端重复序列替换为E亚群禽白血病病毒前病毒基因两端的长末端重复序列，将其插入载体中，以此构建了重组J亚群禽白血病病毒感染性克隆质粒，得到序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明重组J亚群禽白血病病毒克隆质粒经转染得到的重组病毒株的复制能力和致病性明显弱于自然的J亚群禽白血病病毒，但可表达J亚群禽白血病病毒的结构蛋白，具备J亚群禽白血病病毒的抗原性，可被J亚群禽白血病病毒特异性单克隆抗体JE9所识别。

本发明病毒克隆质粒为制备J亚群禽白血病病毒弱毒性活疫苗提供了材料和方法借鉴。

申请人：华南农业大学
地址：510642 广东省广州市天河区五山华南农业大学
国籍：CN
代理机构：广州粤高专利商标代理有限公司
代理人：林丽明
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犆狅狀狊狋狉狌犮狋犻狅狀犪狀犱犞犻狉狌狊犚犲狊犮狌犲狅犳犐狀犳犲犮狋犻狅狌狊犕狅犾犲犮狌犾犪狉犆犾狅狀犲狊狅犳犛狌犫狉狅狌犵狆犑犃狏犻犪狀犕犲犾狅犻犱犔犲狌犽狅狊犻狊犞犻狉狌狊狔
５期
林艳等：１株髓细胞瘤型Ｊ亚群禽白血病病毒感染性克隆的构建与病毒拯救
７５５
，ｔｅｄｎａｍｅｄｒＳＣＧＳ１ａｎｄｒＣＧＳ１． △Ｓ：；；；犓犲狑狅狉犱狊ｍｅｌｏｉｄｌｅｕｋｏｓｉｓｓｕｂｒｕｖｉａｎｌｅｕｋｏｓｉｓｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｅｍｏｌｅｃｙｇｏｐＪａ狔；ｕｌａｒｍａｒｋｅｒｖｉｒｕｓｒｅｓｃｕｅ，是ａｖｉａｎｌｅｕｋｏｓｉｓｖｉｒｕｓＡＬＶ）禽白血病病毒（［］１在鸡群中普遍存在的一种反转录病毒。经典的鸡少数白血病主要由外源性ＡＬＶ的Ａ、Ｂ亚群引起，病例由Ｃ、Ｄ亚群引起
收稿日期：２０１２１１２１基金项目：教育部《长江学者和创新团队发展计划》创新团队项目（）ＩＲＴＯ８４８作者简介：林艳（），女，羌族，四川绵阳人，硕士研究生，主要从事家禽传染病研究，：１９８６Ｅｍａｉｌｌｉｎａｎ１０２＠１２６．ｃｏｍｙ黄勇，：：Ｅｍａｉｌｈｏｎ６０１＠１６３．ｃｏｍ，Ｔｅｌ０８３５２８８６１１７通信作者：ｙｇ
１１１１１１，，，ＬＩＮＹａｎＸＩＡＪｉｎＺＯＵＮｉａｎｌｉＧＵＯＭｉｎｉｎＡＮＧＦｕａｎＺＨＡＯＹａｎｇ，ｇｐｇ，Ｗｙｇ，１，２１，２１，２，，ＨＵＡＷＥＮＸｉｎｔｉａｎＣＡＯＳａｎｉｅＮＧＹｏｎｊｇ
［］２
１材料与方法
１．１毒株与细胞髓细胞瘤型ＡＬＶＪ四川分离株ＳＣＧＳ１（Ｇｅｎ由本实验室从四川某种Ｑ３９６３０２）Ｂａｎｋ登录号为Ｊ［］９鸡场分离保存；抗ＡＬＶＪ血清、ＤＨ５ α感受态细胞由本实验室制备并保存。１．２主要试剂琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；ＴＲＩｚｏｌ总ＲＮＡ提取试剂，ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｔｐ，ＭａｓｔｅｒＭｉｘＰｒｅｍｉｘＬＡ犜犪ＭＤ１９ＴＳｉｍｐ狇酶，，限制性内切酶等购自宝生ＵＣ１９质粒，ｌｅＶｅｃｔｏｒｐｐＴＭ物工程（大连）有限公司；Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉ
１株髓细胞瘤型犑亚群禽白血病病毒感染性克隆的构建与病毒拯救
２林艳１，夏静１，邹年莉１，郭明萍１，王富妍１，赵扬１，文心田１，，２２曹三杰１，，黄勇１，
（雅安６１．四川农业大学动物医学院，２５０１４；２．四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室，雅安６）２５０１４摘要：为构建髓细胞瘤型Ｊ亚群禽白血病病毒（，）ａｖｉａｎｌｅｕｋｏｓｉｓｖｉｒｕｓＡＬＶＪＳＣＧＳ１株前病毒ｃＤＮＡ分子标记感染性克隆，根据Ｓ分３段进行全序列Ｐ顺次连接至ｐ构建ＳＵＣ１９，ＣＧＳ１全基因测序结果，ＣＲ扩增，ＣＧＳ１株前病毒；通过重叠Ｐ在４６ｃＤＮＡ感染性克隆ｐＣＲ方法对ＳＣＧＳ１基因组进行沉默突变，８４位点引入犛犪犾ＵＣＳＣＧＳ Ⅰ 位点，构建Ｓ；以ｐＣＧＳ１株分子标记感染性克隆ｐＣＧＳＣＧＳ重组质粒转染ＣＥＦ进行病毒拯ＵＣＵＣＳＣＧＳ和ｐＵＣ △Ｓ △Ｓ救，并通过Ｐ间接免疫荧光与双抗体夹心Ｅ成功构建ｐＣＲ、ＬＩＳＡ进行拯救病毒检测。结果显示，ＵＣＳＣＧＳ与ｐＵＣ转染后盲传第３代、第４代细胞与上清中均检测到拯救病毒；间接免疫荧光与抗原ＥＣＧＳ重组质粒，ＬＩＳＡ方法 △Ｓ。分别在ＣＥＦ细胞和上清中检测到ＡＬＶＪ抗原。成功拯救获得分子标记ＡＬＶＪ关键词：髓细胞瘤型；感染性克隆；分子标记；病毒拯救Ｊ亚群禽白血病病毒；中图分类号：（）Ｓ８５２．６５９．３文献标志码：Ａ文章编号：０３６６６９６４２０１３０５０７５４０６
］４胞瘤性白血病［，给世界养禽业造成巨大损失。［］１９９９年中国首次报道证实商品肉鸡中存在该病５。基因组是单链正义ＡＬＶ属于反转录病毒，
ＲＮＡ。由于反转录病毒的ＲＮＡ聚合酶相对缺乏［］６７校对机制，同时在病毒复制过程中其基因组会与宿主基因组重组，从而造成ＡＬＶＪ在遗传上的多变性，这对研究ＡＬＶＪ的致病机理造成了巨大的困难。因此，寻求单一起源的ＡＬＶＪ对于研究病毒遗致病机理等非常重要。而反向遗传技术构传特性、建的感染性克隆所拯救出的病毒，就是单一起源的病毒群体。同时，通过构建病毒的感染性克隆，可以实现Ｒ敲除、替换等操作，被广ＮＡ病毒基因修饰、
畜牧兽医学报２（）：０１３，４４５７５４７５９
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