林可霉素类抗生素

无菌空气 补加小料 培养基配制
斜面孢子或米孢子 → 一级种子罐 → 二级种子罐 → 发酵罐 → 预处理罐 →弃去滤液得到菌丝体 →丁醇浸提 → 浸提液 → 柱色谱除杂质、浓缩 →萃取、除杂质 → 浓缩 →结晶 →林可霉 素粗品
（3）发酵工艺： *由于林可霉素发酵生产过程中会出现菌体老化自溶， 导致生产能力衰退，影响林可霉素的产量。目前，国 内林可霉素生产工艺普遍采用分批补加小料的方式， 以达到延缓菌体老化，延长菌体产生抗生素的目的。 *实验证明，林可霉素的发酵过程中2次补加小料（葡 萄糖及硫酸铵）的最终发酵效价高于1次补加小料,3次 或多次补加能更均匀地为菌株补充营养物质，提高发 酵最终效价。但多次补料容易造成染菌和稀释发酵液， 对工业生产发酵单位的进一步提高不利，需综合考虑。
（4）发酵过程：（发酵周期约为190h） ①林可霉素的发酵可以分成以下几个阶段：
发酵初期（0-24h）：林可链霉菌迅速增长积累生物量的 时期。 发酵前期（24-40h）：林可链霉菌由初级代谢转向旺盛 次级代谢时期。 发酵中期（40-140h）：林可链霉菌保持较稳定的生理 活性并快速生产林可霉素的时期。 发酵后期（140h-发酵终点)：新生菌丝逐渐减少，林可 霉素的累积速率呈现下降趋势。
*由于本品可进入骨组织中，和骨有特殊亲和力，故特别适用于厌 气菌引起的感染及金黄色葡萄球菌性骨髓炎。 *本品尤其适用于对青霉素和红霉素过敏的患者。 *林可霉素的使用，除了直接作针剂用于临床外，目前更有前途的 是进一步制成半合成抗的克林霉素等。
二、菌种选育
1、产生菌简介

林可霉素产生菌是一种链霉菌，命名为林可链霉菌林可变种，是 美国普强公司研究所在1962年从美国尼布拉斯州林肯市附近土壤 中分离出来的。
化学结构：
林可霉素（Lincomycin)， 又叫洁霉素（Jiemycin) 或林肯霉素，是林可胺 类抗生素。它是由一个 氨基酸（丙基脯氨酸） 部分和一个糖分子（半 乳糖辛吡喃苷）以酞键 连接组成的。
盐酸林可霉素化 学结构式
作用机制：


不可逆性结合到细菌核糖体50S亚基，阻断转肽作用， 抑制蛋白质的合成，属速效抑菌剂。有研究表明，因 为林可酰胺与L-Pro-Met-tRNA和脱乙酰tRNA的3’端相 似，阻碍了蛋白质合成的延伸。 从分子水平上说，林可霉素的作用位点是细菌核糖体 的肽基转移酶中心，通过与核糖体50s亚基23s rRNA的 中心环相结合而抑制蛋白质生物合成过程中的转移定 位从而抑制蛋白质的合成，起到抑菌的作用。 林可霉素系抑菌药，但在高浓度时，对某些细菌也具 有杀菌作用。
5、PH的影响



PH是微生物生长和产物合成的非常重要的状 态参数，PH变化会影响各种酶的活性、菌体 对基质的利用速率和细胞的结构，从而影响细 胞的生长和产物的合成。 在分批补料发酵生产中，以补料方式加入葡萄 糖，以PH值为指标控制加糖量。将PH控制在 7.8-8.0之间，林可霉素可达到较高的发酵水平。 若PH高于8.0，可适当补些葡萄糖和硫酸铵； 若PH低于7.6时，可少补或停止补糖。 要注意控制葡萄糖和硫酸铵加入的时间和速度。
与水之间分配系数达到最大值。
3.离子交换法 林可霉素是碱性化合物，当pH<pKa时能解 离成正离子，故可采用阳离子交换树脂进行提 取。
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菌种选育的方法

（3）代谢产物控制育种
在生物化学和遗传学的基础之上，通过诱变育种 打破或者绕过微生物的正常代谢，获得有利代谢产物 大量合成积累的菌种。

（4）基因工程定向育种 利用基因工程技术，根据生产需要改造抗生素生 物合成基因簇，如插入强启动子或阻断某个基因的表 达，从而获得所需的工程菌。
三、发酵生产与影响发酵的条件

抗菌活性：

林可霉素主要对革兰氏阳性菌有效，特别是对 厌氧菌 、 金黄色葡萄球菌、链球菌（肠球菌 除外）、肺炎球菌等有良好抑菌作用。对革兰 氏阴性菌和支原体的作用较弱。

林可霉素的抗菌谱与红霉素相类似。
临床应用
* 口服适用于：葡萄球菌、化脓性链球菌、肺炎球菌及厌氧菌所致
的呼吸道感染、皮肤软组织感染、女性生殖道及盆腔感染和厌氧 菌所致的腹腔感染等。林可霉素注射液除上述指征外还可用于链 球菌和葡萄球菌所致的败血症、骨和关节感染、慢性骨和关节感 染的外科辅助治疗、葡萄球菌所致的急性血源性骨髓炎等。林可 霉素渗入脑脊液的浓度不能到达有效水平，不适用于脑膜炎的治 疗。
用补加玉米浆和CaCO3的策略对中后期及后期进行调控取得比较好的效 果。
3. 合成培养基的影响
在合成培养基中单独加入硫源（K2SO4）而不与其它微量金属配合，
或仅有微量金属缺乏硫源时，均不能提高效价。
在含硫源20％条件下比较亚铁离子、锌、镁、锰离子的作用，结
果是镁缺乏时大大影响发酵单位，除锌外，其它微量金属影响较 小。

形态特征：气生菌丝主要颜色为白色粉红色奶油色。孢子链 为直丝波曲形，含10～15个或更多的孢子，孢子表面光滑。而营 养菌丝则随培养基的不同，呈现不同的颜色，一般为黄色黄褐 色。
2、菌种选育的方法

（1）诱变育种
利用物理或化学的方法使得DNA发生突变，随机性 地筛选获得所需的突变菌。 （2）原生质体融合 通过两种具有互补性质的菌的原生质体融合，从 而达到基因重组的目的，获得具有两种菌株的优良性 状的杂交菌。

2.溶剂萃取（主要方式）
*林可霉素盐酸盐在室温下易溶于水，而游离碱在许多有机溶剂中 溶解度很大，可成功的采用溶剂萃取法进行提取，将林可霉素在 碱性条件下转入有机溶剂中，然后再反萃取到酸性水相。 *选择适宜的有机溶剂：与水的互溶度小，对林可霉素的溶解度大， 并具有较好的选择性，如丁醇、二氯乙烷、丁醇、氯仿等。同时 应注意pH的调节，如丁醇萃取，在pH为10左右，林可霉素在丁醇
（4）发酵过程
②发酵过程菌体的特性：
前期菌体新生菌丝较多，而中后期较少，特别在后期 菌体出现自溶对菌体生产林可霉素不利，通过补加小 料能一定程度上延缓菌体自溶，促进新生菌丝的生长， 提高发酵产量。而在发酵后期菌体老化，产素活性下 降，补加小料作用不明显。所以补加小料要把握好时 间。
（二）影响发酵的因素
搅拌速度对菌丝形态、溶氧、料液粘度以及发酵指数均有影响。
*林可霉素目前多采用通气搅拌型发酵罐，在通气量一定的情况 下严格控制搅拌器的直径和搅拌速度，以保障生产菌的供氧。
通气、搅拌的优化
所以可以通过对搅拌转速优化控制，依据发酵 过程中不同阶段的生产菌代谢特性，采用不同 阶段的变速控制搅拌速率，使前期菌丝形成良 好形态，中期菌丝衰老减缓，后期菌丝片段减 少，自溶减轻，延长分泌期，达到提高发酵指 数，减低电力消耗的目的。
（三）流加补料技术在林可霉素发酵中的 应用

葡萄糖是多种抗生素生产的主要碳源，但高浓度Glu 能抑制许多抗生素的生物合成。


前期摇瓶试验表明林可霉素发酵过程中存在葡 萄糖效应。
通过降低基础培养基中初始Glu浓度和中后期流加补 糖来解除林可霉素产抗阶段的Glu效应，同时通过自 动流加Glu和硫酸铵来减少因分批补料引起的糖氮、 溶氧和PH的频繁波动，为产生菌的生长及产抗提供相 对稳定的代谢环境。
若加入的氮源能导致发酵液pH呈碱性，则对林可霉素合成有利。
如加入NH4NO3或KNO3时，发酵液转为碱性，促进了林可霉素的生 物合成。
4. 磷酸盐的影响（P的调控）

在抗生素的发酵中，磷的浓度直接影响菌丝的浓度、合成速率，甚至改 变合成方向。一般情况下，抗生素合成期的磷浓度应控制在比较低的亚 适量水平更有利于抗生素浓度积累。
林可霉素
目录
1
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概述
菌种选育 发酵生产与影响发酵的条件 林可霉素的提取
一、概述


林可霉素是1962年由美国人Mason等从林肯 链霉菌的代谢产物中分离出来的。 林可霉素与已知的抗生素类药物不会表现交叉 耐药性，并且毒副作用较低，抗菌活性强，因 此林可霉素和它的衍生物盐酸林可霉素很快发 展成为临床应用上的主要抗生素。

流加补料技术解决了因代谢环境不稳定特别是 溶氧不足所引起的产生菌呼吸代谢受阻、菌丝 结团过于紧密、新老菌丝承接困难以及部分菌 丝断裂进而导致产抗后劲不足的问题。同时在 流加补料工艺中延长了发酵周期，使林可霉素 发酵放罐效价较分批补料工艺高。
四、林可霉素的提取
1、吸附法 林可霉素的碱性基团pKa值较小，当它以游 离碱形式存在时，极性较弱，水中溶解度小， 故可用吸附法提取，即依靠范德华力，林可霉 素以游离的分子状态吸附到吸附剂表面。
主要影响因素： ①通气与搅拌 ②PH ③碳源、碳源、硫源的影响 ④合成培养基的影响 ⑤磷酸盐的影响

（二）影响发酵的因素--发酵条件的优化
1. 通气、搅拌的影响
*发酵时单纯Байду номын сангаас气主要为气液间质的传递，而搅拌则主要为液固间
质的传递。林可霉素菌发酵时，液固间质的传递是影响林可霉素
生物合成的主要因素。 *林可霉素为林肯链霉菌深层液体发酵的代谢产物，为好氧发酵，
（一）发酵生产 1、生产菌种：林可链霉菌
菌种在葡萄糖天冬素琼脂培养基上培养，气生菌丝 乳脂粉红色，营养菌丝苍黄色，产生极微量的黄色可 溶性色素。孢子丝柔曲，孢子表面光滑。 菌种选育多采用诱变育种方法，用原生质体融合技 术获得融合子。
2、发酵
（1）发酵形式：
*林可霉素生产采用三级发酵形式，用溶媒萃取法提取产品。 （2）发酵流程：

无机磷酸盐对林可霉素产生菌的初级代谢转向次级代谢具有较强的抑制
作用，磷酸盐的耗尽与RNA合成的减少引发了次级代谢的开始，因此产 生菌对数生长期补入适量磷则抑制林可霉素合成，而在生产期开始后补
磷则不影响林可霉素的生物合成。（要注意把握磷酸盐加入的时间）