疯牛病(TSE)检测的研究进展X
第六节 疯牛病
Ⅳ类
疯牛病的控制
TSE病原体是有传染性，但不是接触传染。也没 有确定CJD病是职业性感染。 TSE因子对外界灭活的抵抗力很强，对各种消毒 （煮沸、冷冻、高压灭菌、乙醇、双氧水、过锰 酸盐、碘、甲醛、紫外线外线、γ 射线等）均有 耐受性。 已污染TSE因子样品尽可能焚烧处理； 推荐使用≥132℃高压蒸汽灭菌至少2h； 利用5.25%次氯酸钠(未稀释的漂白粉)和氢氧化钠 (2mol/L或更浓)可降低其感染性；
1986年英国发现第一例疯牛病，之后 有149位疯牛病患者，120人死亡，约4000 人携带疯牛病毒。爱尔兰发现576例疯牛 病；西班牙513例。加拿大、美国、波兰、 德国、日本相继发现疯牛病患者。全世界 确诊有167人死于疯牛病。
朊病毒病的感染途径
朊病毒病感染有三种可能途径： 1、遗传突变，使朊病毒蛋白失去细胞型而易 于折叠成致病型 2、医源性感染，如角膜转移手术中的捐献者 为朊病毒的感染者，注射用的人生长激素和促 性腺激素是提取于朊病毒病患者的腺垂体 3、饮食感染，如食用朊病毒病患者的脑组织
朊病毒
疯牛病是1985年4月最早在英国出现的一种新病。 1996年确诊，1997年Weels等正式报道，疯牛病 的致病因子是朊蛋白（Prion）。 朊蛋白是一种以糖蛋白为主体的特殊病原因子， 其分子量很小。它是一种传染性蛋白因子，主要 成分是一种蛋白酶抗性蛋白（PrP）。
生物学特性：
可滤过性，增殖非常缓慢； 与已知病毒特征明显不同，不具有病毒结构，未 检出核酸； 对福尔马林、蛋白酶、加热、电离辐射、紫外线 抵抗力强；
受疯牛病危害的不仅是牛，人若食用了被 污染了的牛肉、牛脊髓等，也有可能染上致命 的新型克－雅氏症。患者脑部会出现海绵状空 洞，先是表现为焦躁不安，后导致记忆丧失， 身体功能失调，最终精神错乱甚至死亡。新型 克－雅氏症患者以年轻人为主，发病时间平均 为14个月。截至2003年底累计已有至少137人 死于新型克雅氏症，其中多数在英国。
疯牛病发生与防制新进展
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摘 要： 疯牛痛 （ ａ － ｏ ｉ ａｅ ， 牛 海绵状脑病（ ｏｉｅＳ ｏ６ｆ￣ ｎ ｅ ｈｌ ａ ｙ Ｓ 的俗称 ． Ｍ ｄ ｃｗ ｄｓ ｓ） ． ｅ ， ￣ Ｂ ｖ ｏｎ ｏ ａＥ ｃｐ ａ ｐｔ ， Ｅ） ｎ ｏ ｈＢ 是一种慢性 、 传
染性 、 死 性 的 中枢神 经 系 统疾 病 。 致 谊病 自 １８ ９ ５年 ４月首 点在 英 国发 现 以来 ． 至今 已在 许 多 国家都 有 发现 。目前 ， 界 世 上 有 １０多 个过 国家 面 临 着 严 重疯 牛 痛 的 成 胁 毒文 从 病 原 、 ０ 流行 病 学 、 生与 防 制 等 方 面对 疵 牛 病进 行 了综迷 发
ａ ｄ ｌｔ ａ ｄ ｓ ａ ｅ ｗ ｉ ｈ ｈ ｄ ｅ ｎ ｕ ｇ ｓｅ ａ ｓ ｄ ｂ ｐ ｏ ｓ ａ ／ ＇ ｋ ｎ ｆ ｄ ｓ ａ ｅ ｏ ｒ ． Ｓ ｎ ｅ ｔ ｓ ｉ ｓ ｎ ｅｈ ｌ ｉ ｓ ｈ ｃ ａ ｂ ｅ ｓ ｇ ｅ ｔ ｄ ｃ ｕ ｅ ｙ ｈ ｎ ． ｅ ｌ ｄ ｉｄ ｏ ｉ ｓ ｓ Ｒ ｓ ｅｒ ｅ ｅ ｉ ｃ ｉ ｗａ ｆ ｔ ｒ ｆ ｕ ｄ ｉ ｎ ｌ ｈ ｉ ９ ５ Ｂ Ｅ ｈ ｄ ｓ ｒ ａ ｅ ｎ ｏ ｎ ｒ ｓ Ａｔｐ ｅ ｅ ｔ ｏ ｅ ０ ｏ ｎｔ ｅ ｅ ｅ ｃ ｎ ｒ ｎ ｅ ｉ ｏ ｎ ｎ Ｅ ｇ ｉ ｐ １ ８ ， Ｓ ａ ｐ ｅ ｄ ｄ ｍａ ｙ ｃ ｕ ｔ ｅ ． ｓ ｉ ｒｓ ｎ ， ｖ ｒ １ ０ ｃ ｕ ｒ ｓ ｗ ｒ ｏ ｆ ｔ ｗ ｔ ｉ ｏ ｄ ｈ
疯牛病病原体的研究及我国防控体系的建设
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疯牛病的治疗进展和新的研究成果你需要知道
PART 04
疯牛病的预防和控 制
预防措施和健康指导
加强食品安全监管，确保食品质量和安全 提高公众健制度 推广健康饮食，避免食用高风险食品
添加 标题
合作：各国政府、科研机构和企业之间的合作，共同应对疯牛病问题
跨国合作的重要性和必要性
疯牛病是全球性问题， 需要各国共同应对
跨国合作可以共享资 源和信息，提高研究
效率
跨国合作可以促进技 术交流和合作，推动
治疗进展
跨国合作可以加强国 际合作和友谊，共同
应对全球性挑战
国际学术交流和研讨会的举办与参与
社会影响：公 众恐慌，影响 牛肉市场
政府负担：增 加医疗支出， 影响经济发展
国际影响：影 响国际贸易， 损害国家形象
01
02
03
04
疯牛病对经济发展的影响
社会支持和救助机制的建立与完善
添加 标题
政府和社会各界对疯牛病患者的关注和支持
添加 标题
建立和完善社会救助机制，提供医疗、心理、生活等方面的帮助
治疗效果和患者康复情况
治疗方法：药物 治疗、手术治疗、
心理治疗等
治疗效果：部分 患者病情得到控 制，生活质量提
高
患者康复情况： 部分患者康复， 但仍有部分患者
病情加重
新的研究成果： 新型药物、新型 治疗方法等，为 患者带来新的希
望
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
PART 03
疯牛病的新研究成 果
疯牛病的检测技术的研究进展
授提 出 的朊蛋 白学说 。该 学说 认 为疯牛 病是 由生物 体 内 的一种 正 常蛋 白发生 构 象 畸变 而引 起 的 ， 这 把
管分 泌 ，并 同时 注射 １ ／ 的 ８６合 剂加 等 量 的氯 ３量 ４
丙 嗪 以保 定动 物 。 根 据 资 料 ，符 合 雾 化 吸人 条 件 的抗 菌 药 物较
是 １８ ９ ５年 突然在 英 国 出现 的侵 害成 年牛 中枢神 经 系统 的一种 致死性 疾病 ， 属人 畜共 患传 染病 。 它
引起 牛脑 海 绵状病 变 ， 牛 大脑功 能 退化 ， 使 导致 牛精神错 乱 、 呆和死 亡 。牛 总是吃 了那些 羊制 品 痴
饲料感染而发病 ， 这些羊患有绵羊疯痒病。 疯牛病潜伏期较长 ， 一般 ４ ６ ～ 年。牛感染此病后 ， 起初 无 明 显症 状 ， 只是 体 重 减轻 ， 神 不好 ， 精 产奶 量 下降 ， 病后 烦躁 不 安 、 发 恐惧 ， 有 攻 击性 ， 济 失 具 共 调 ， 肉震颤 ， 肌 一般 在牛发 病后 ０５个 月至 ６个 月死亡 。 ．
种假 说 ， 大 多数 学 者赞 同美 国加州 大 学 Ｐｕｉ 但 ｒｓ ｎ教
种 不 含 核 酸 的蛋 白质 病 毒 ，宿 主对 其 无 免 疫 反
应 ， 染 动物 的血清 中无抗 体产 生 ， 感 因而 ， 常规 的 用 血清 学方 法无 法 检测 ， 也不 能用 像 鉴定 病 毒 和细 菌
（ 参考 文献从 略 ）
根据药物学资料 ， 似乎并不推荐地塞米松磷酸 钠作 为雾 化吸入 给 药 的药 物选 择 。但 与部分 资料介 绍 的那样 ， 笔者 在 混合 多 种药 物 雾化 吸 入 给药 时 常
・● ●
２ ” 年 第 ６期 ｏ
疯牛病的检测技术的研究进展
疯牛病又叫牛海绵状脑疾病(bo vine spo ng ifo rm e nce pha lo pa thy ,BS E),是1985年突然在英国出现的侵害成年牛中枢神经系统的一种致死性疾病,属人畜共患传染病。
它引起牛脑海绵状病变,使牛大脑功能退化。
导致牛精神错乱、痴呆和死亡。
牛感染此疾后,起初无明显症状,只是体重减轻,精神不好,产奶量下降,发病后烦躁不安、恐惧,具有攻击性,共济失调,肌肉震颤,一般在牛发病后0.5个月至6个月死亡。
P RP s CBS E 的致病因子,是机体内普遍存在的一种不含核酸的蛋白质病毒,宿主对其无免疫反应,感染动物的血清中无抗体产生,因而,用常规的血清学方法无法检测,也不能用像鉴定病毒和细菌等常用的微生物分离培养的方法及基于核酸杂交的方法进行检测,而最初用于BS E 检测的病理学方法也只能用于发病后期及死后的检测。
近几年,人们采用其它对朊病毒有敏感免疫反应的动物来制备特异性抗体,从而实现活体蛋白质分子的检测。
目前,较为有效的BS E 检测方法是基于抗原-抗体反应的免疫学方法和毛细管电泳及由此衍生的酶联标记、荧光扫描等方法。
1病原与致病机理20世纪中叶,人们在研究羊瘙痒病时发现,其致病因子对几乎所有微生物(包括病毒)的灭活手段都具有一定的抗性。
如可抵抗蛋白酶的降解及核酸的处理方法等,而且能通过阻止已知最小病毒的滤器,在宿主动物体内不引起炎症反应。
之后,牛因食用了含有此种致病因子的羊肉骨粉的饲料而受到了感染,从而导致了所谓的疯牛病。
基于大量的实验研究,对疯牛病的致病原因,科学家们提出了种种假说,但大多数学者赞同美国加州大学P rusin 教授提出的朊蛋白学说。
该学说认为疯牛病是由生物体内的一种正常蛋白发生构象畸变而引起的,把这疯牛病的检测技术的研究进展闫梦菲1,邢海权2(1.南京农业大学动物科技学院,南京210095;2.山西农业大学动物科技学院,太谷030801)摘要:疯牛病(ma d cow dis e a s e )又叫牛海绵状脑疾病(Bovine s pongiform e nce pha lopa thy ,BS E),是1985年突然在英国出现的侵害成年牛中枢神经系统的一种致死性疾病,属人畜共患传染病。
疯牛病研究概况
疯牛病研究概况邵翠丽 陈昌海 高式伟 (江苏省畜牧兽医总站,210024)王长美 (南京市玄武湖动物园)也落后;生物医药的开发也是刚刚起步,这类产品具有促生长、提高抗病能力、无毒性;无副作用等优势,我省应加强这方面的开发。
3.2.3 从开发猪鸡用药为主向畜禽、水产和其它特殊类动物药品并重方向转移 研制开发结构要与畜禽、水产等类动物结构相一致,在研究开发畜禽用区同时,要注重开发一些特种类、观赏类动物的专用药品和营养保健品。
要针对市场变化,全方位研究、多品种开发,使新药种类及数量有一个大有突破。
3.2.4 从传统用药向实用、安全、方便、稳定等多元化方向转移 注重药品剂型及工艺的完善和开发。
根据动物的不同饲养环境及生活习性,结合产品稳定性等因素,开发一些新剂型。
畜禽用药可注重可溶剂方面研究,蚕用消毒药应侧重产品稳定、用药方便等新剂型的研究,如喷雾剂、浇淋剂的开发。
抗生素类可开发一些口服剂型,中草药及中草药添加剂要着重开发一些提纯类及水剂等实用、有效剂型。
与此同时,还要加强透皮吸收剂、缓释剂等剂型的开拓和研制。
3.2.5 突破传统的兽药概念,开拓动物保健品的新领域 以往只重视治疗药物的开发,近年来在消毒剂、促生长添加剂上有甩发展,但还有很多方面尚未起步。
如改善饲烊适口性的诱食剂、调味剂;保证饲料品质的防霉防腐剂、防虫剂等;用于生产特种畜产品如高碘蛋、含硒蛋等方面添加剂,翥可进行研制与开发。
使我沂兽药新品开发由原来的传统型,低水平逐渐向多品种、高起点的方向发展,把我省兽药生产推向一个新的高潮。
自从英国政府3月20日正式承认疯牛病有可能伟染给人,因此,而困扰着英国的养牛业后,此问题一直是世界各国新闻媒体追踪报道的热点。
加之牛肉是世界上相当多国家人民的主要动物性食品,在全球人们议论纷纷,大有谈牛色变的感觉,引发了食用牛肉是否安全的恐慌。
本文旨在将已报道过的有关疯牛病研究概况进行综述,供各方面参考、研究、决策,提出新的防制措施。
疯牛病的发展近况与危害
疯牛病的发展近况与危害今年的3月27日，法国农业部宣布：法国中部地区又发现一例牛海绵状脑病（疯牛病）。
这是法国今年以来发现的第12头疯牛病病牛，法国已将病牛及112头同群牛全部扑杀销毁。
据报道，1999年法国共发现31例疯牛病病牛。
继英国后，法国已成为疯牛病高发国家，除外还有德国、比利时、卢森堡、爱尔兰、瑞士、葡萄牙、丹麦、意大利、荷兰、阿曼、加拿大等20多个国家发生过疯牛病。
牛海绵状脑病（Bovine spongiform encephalopathy，BSE）又称疯牛病，是牛的一种致命性神经系统疾病，是由非常规致病因子（prion简写prpc译称朊粒，亦称朊病毒）引起的一种亚急性海绵状脑病，这类病还包括绵羊的痒病、人的库鲁病（又称震颤病）、人的克一雅氏病（Greftzfeld?/FONT> Jakobdisease，CJD）（又称早老痴呆症）、人的格斯特曼氏病（Gerstman?/FONT>straussler?/FONT>schelnker syn－drome，GSS）、貂传染性脑病（Transmissible mink encephalopathy，TME）、糜鹿的慢性消耗性疾病以及最近发现的致死性家庭性失眠症。
现已证明疯牛病、绵羊的痒病和人的克一雅氏病、库鲁病都是通过食物传染而传播。
其中疯牛病是由于健康牛食入含有致病性朊粒的人工蛋白质饲料所致，这种人工蛋白质饲料含有病牛、病羊的脑和脊髓等脏器成分。
人的克一雅氏等病则是由于人吃了患疯牛病的牛肉及其制品以及牛脑、脊髓、扁桃体、胸腺、脾脏和小肠而传染发病。
疯牛病的病原体朊粒是传染性蛋白质颗粒，是不含有核酸的感染性蛋白因子，其主要成份是一种蛋白酶杭性蛋白，具有对蛋白酶的抵抗力，易溶于去污剂、有致病力和不诱发抗体等特性，给予患病动物及人类的诊断和防治带来很大麻烦，给予人类和动物的健康和生命带来严重的威胁。
该朊粒耐高温，加热到360℃仍有感染力，植物油的沸点（160℃一170℃）不足以灭活病原，疯牛病的脑组织匀浆，经134℃?/FONT>138℃高温维持1小时后，动物实验仍有感染力。
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疯牛病(TSE)检测的研究进展Ξ曾 明,漆文革3综述 雷殿良,李德富审校(中国药品生物制品检定所,北京 100050)摘 要:近年来,对TSE检测的研究发展非常迅速。
尽管朊病毒的分类本质尚不明确,但一些生物学特性已有研究,如传染性、抵抗力等,其检测技术包括:早期利用宿主动物牛或转基因小鼠的生物学方法;有多种免疫诊断方法可区分正常和异常的朊病毒蛋白,欧盟验证了三种免疫诊断方法,瑞士Prionics公司的免疫印迹法、爱尔兰En fer Scientific公司的E LIS A法和法国CE A和英国Bio2Rad公司开发的夹心免疫法,三种检测方法准确性为100%,因此,欧盟授权这三种检测方法用于欧洲检测疯牛病,此外,基于免疫荧光方法和毛细管免疫电泳的方法也有应用;研究人员还尝试通过对TSE感染过程中出现的相关蛋白、朊病毒的形态变化的检测来诊断TSE,也有针对TSE发病过程中,异常朊病毒蛋白在脑部出现聚集,采用不同手段用以诊断;在体外模拟感染性PrP(Sc)引起正常细胞表面蛋白PrP构象改变的过程也应用于TSE的检测。
对潜伏期的诊断试剂研究正在进行中,但目前并未取得满意的结果。
对朊病毒污染生物制品的可能性进行评估非常必要,对生产过程的监测非常重要。
相信未来3～5年将开发出高敏感性、高特异性和使用方便的TSE诊断方法。
关键词:疯牛病;TSE;检测中图分类号:S858.23 文献标识码:A 文章编号:100525673(2002)20320058204 在过去几年中,介入TSE诊断领域的公司急剧增加,主要原因在于潜在的巨大市场利润,一方面是对牛群是否感染的检测,欧盟要求对所有30月龄以上的牛进行检测;另一方面是对生物制品,主要是血液制品的检测,也包括疫苗生产原材料如小牛血清的检测。
基于投入力度的增加,TSE检测的研究发展非常迅速,相信在未来几年,多种敏感且特异的诊断方法将广泛应用。
现将其研究进展作一简要综述。
1 几个与疯牛病相关的名词Transmissible spongiform encephalopathy(TSE)可传播海绵状脑炎,由朊病毒引起的一类进行性、不可治愈的致死性疾病的统称,主要特征为痴呆,验尸时脑部有空洞;当一种哺乳动物食用另一种哺乳动物的脑或脊髓时可传播。
Mad cowldisease:疯牛病,TSE的俗称。
Prion:朊病毒,新型感染因子,通过链式反应摧毁神经细胞的感染性蛋白。
Creutz feldt2Jakob disease(C JD):克2雅氏病,发生于人的、自发的TSE。
Variant creutz feldt2Jakob disease(vC JD):新型克2雅氏病,食用污染牛肉而发生于人的TSE。
Bovine spongiform encephalopathy(BSE):牛海绵状脑炎,发生于牛的TSE。
Scrapie:羊骚痒病,发生于羊的TSE。
Chronic wasting disease(CW D):慢性消瘦疾病,发生于鹿或麋鹿的TSE。
2 TSE病原体的特点〔1,2〕1996年报道,认为新型克雅氏病(vC JD)来源于BSE,引起人们对通过食用污染的肉类而由牛到人种间传播的关注,有实验表明BSE和vC JD的病原体是一致的。
TSE为非传统意义上的病原体,数十年的研究已为我们提供了大量的信息,但仍有几个关键性的问题并未解决,如病原体的分类本质(如病毒/朊病毒/细菌/或其他;传播途径;最小感染量;)。
对TSEs病原体的解释包括感染性蛋白(朊病毒理论);非传统/慢病毒或细菌;自身免疫学说等;最为广泛接受的是朊病毒学说,即一种新型的无核酸感染性蛋白粒子引起的,PrP(朊病毒蛋白)是一种正常细胞蛋白构象改变的类型,一般宿主中不存在。
正常和异常蛋白的差异见表1〔1〕。
在实验动物中去除PrP基因可使小鼠完全抵抗感染。
病原体的传播能力受多种因素的影响,包括:途径、剂量、种属和中间屏障的有无;如脑内途径比静脉的感染性高10Ξ江西民星集团,南昌 330046作者简介:曾明(19662),男,博士,副研究员,主要从事微生物学与免疫学工作。
倍,而种间屏障则可减少1000倍,朊病毒在动物缩主间传播时可进行修饰,所以,一羊骚痒型在通过牛的传递后可对人产生威胁。
潜伏期长短取决于感染途径,可有数年和数月不等。
表1 朊病毒蛋白PrP的正常和异常类型特点对比〔1〕正常PrP 异常PrP 称为PrPsen或PrPc称为PrPres或PrPsc对蛋白酶敏感对蛋白酶相对不敏感与动态平衡相关与TSEs相关,推测为其感染因子在几种组织和细胞类型中发现脑、中枢神经组织和其他非神经组织细胞表面糖蛋白大型聚集体和淀粉样纤维可溶于温和清洁剂不可溶于温和清洁剂大多为螺旋结构大多为折叠结构自然蛋白有神经毒性 一般来说,TSE病原体对一系列物理和化学方法具有强抵抗力,干热(160℃,24小时无影响;360℃1小时后有感染能力),高压灭菌(126℃1小时后仍有感染性);抗UV和碘照射;适应广泛的pH范围(2～10);抗酒精以及酚类消毒剂。
3 首次有诊断意义的突破性研究最早应用的生物学方法为,将所怀疑已感染的动物材料接种至正常宿主动物,若干月或年之后,出现结果,显然这一方法不可能在实际诊断中应用。
1997年,加利福尼亚大学的学者建立了一株超表达小牛朊病毒蛋白PrP的转基因小鼠〔3〕。
正常小鼠对于BSE有一定抗性,加入小牛PrP基因后导致小鼠不仅敏感,甚至比自然宿主—牛还要敏感,转基因小鼠感染后几个月即死亡,而牛一般几年出现死亡。
这一研究的意义显然不仅仅在于提供了一种较为快速的检测方法,同时为研究BSE提供了重要实验手段,并且可确定感染牛组织中较为精确的朊病毒浓度。
4 免疫学诊断TSE诊断的实际应用需要更加快速并且可同时检测大量样本的方法,目前有多种免疫诊断方法可区分正常和异常的朊病毒蛋白,可以满足这一需求。
欧盟验证了三种免疫诊断方法,瑞士Prionics公司的免疫印迹法、爱尔兰En fer Scientific公司的E LIS A法和法国CE A和英国Bio2Rad公司开发的夹心免疫法〔2,4〕验证研究包括检测300份感染BSE牛脑组织样本,1000份来自正常牛样本,结果表明,三种检测方法准确性为100%,无假阳性和假阴性,因此,欧盟授权这三种检测方法用于欧洲检测疯牛病。
Pronics公司的Pronics Check法采用Western blot 法检测朊病毒蛋白,全程需要24小时,自1999年初已为瑞士和英国授权用于牛的过筛检测,并可对处于潜伏期动物进行BSE检测。
其推荐使用的Invit2 rogen公司生产的蛋白电泳凝胶NuPAGE最近已获美国专利。
Prionics公司最近与R oche公司签定了协议,一方面推广其产品,另一方面合作开发对活动物进行血液检测的试剂,鉴于血液中所含朊病毒少,这一研究预计需要较长时间。
CE A/Bio2Rad公司的Platelia试剂采用夹心免疫法,约4小时出结果,尤其适用于有大量样本的情况下,该产品预计将有每月1百万的生产量,目前在德国等欧洲国家的销售良好。
该方法最近与传统接种动物的方法平行对比,检测感染BSE牛脑组织稀释样本,结果表明至少其准确性良好,有可能用于检测处于潜伏期的标本。
目前该公司同样着力于对血液标本检测的研究和开发。
En fer的产品为E LIS A法,24小时可出结果,通过采用自动化仪器可用于高通量检测。
目前主要在爱尔兰使用,用于检测宰杀后人用牛脊髓和感染BSE牛的检测。
其他一些公司也在着力开发免疫诊断试剂。
如EGG Wallac的基于免疫荧光方法的Delfia试剂,敏感性非常高,也经过了欧盟的评价,因结果不理想而未获欧盟授权使用,但英国农渔食品部(M AFF)同意将其用于检测英国的牲畜以进行确证,并推荐由欧盟进行再次评估。
目前欧盟正考察其他5种检测方法,并欢迎其他研究者的检测方法。
M AFF对一种毛细管免疫电泳(ICE)方法颇感兴趣,它可通过血样检测羊骚痒病和类似的麋鹿慢性消瘦病,这一方法是朊病毒与荧光标记的人工合成的正常朊病毒蛋白竞争结合抗体,然后通过毛细管免疫电泳分离和分析,如果能应用于牛将是一重大突破,然而BSE和羊骚痒病有很大差异,并且人们尚不了解血流中最终和感染各阶段有多少朊病毒存在。
5 其他方法研究人员还尝试通过对TSE感染过程中出现的相关蛋白、朊病毒的形态变化的检测来诊断TSE。
德国的研究人员发现〔5〕,朊病毒对神经细胞产生毒性的原因在于引起神经细胞的凋亡,这一过程中出现的特异性相关蛋白可作为检测的目标,脑脊液中的142323蛋白被证明是朊病毒引起神经细胞凋亡的标记,目前已开发一种敏感方法检测这一蛋白,有可能用于诊断。
此外针对TSE发病过程中,异常的朊病毒蛋白在脑部出现聚集,也有研究者采用不同手段用以诊断疯牛病。
G iese等〔6,7〕应用共聚焦双染色荧光相关光谱的方法,开发了一种对脑脊液标本进行检测的高敏感诊断方法,这一技术甚至可以检测到单一分子。
首先用染料标记的特异抗体与朊病毒蛋白聚集体结合,得到高荧光强度的靶位,然后进行测量和分析,在这一系统中可检测约2m ol/L浓度的PrP蛋白,比免疫印迹法还要敏感,可为TSE诊断提供快速、特异的检测方法。
S oborio等〔8〕在体外模拟感染性PrP(Sc)引起正常细胞表面蛋白PrP构象改变的过程,应用一种类似于PCR扩增的方法,少量PrP(Sc)与PrP共同孵育形成聚集体,超声波破碎成多个较小单位,继续形成新PrP(Sc),最终在样本中获得97%以上的蛋白酶抗性PrP。
这一方法可用于诊断当前组织和体液中的朊病毒感染因子,也可能为确定PrP(Sc)复制是否能在体外引起感染提供帮助。
6 潜伏期及死亡前(Pre2mortem)诊断〔2〕尽管各公司都宣称或正尽力开发对潜伏期的诊断试剂的研究,但目前并未取得满意的结果。
任何用于潜伏期检测的方法都应该通过用已故意感染BSE的动物进行确证,如果检测出阳性,下一步则确定感染的那一阶段可获得可靠结果。
1998年,兽医实验室的科学家们故意用BSE感染200头牛,每三个月杀感染和对照组的牛,取组织样本冻存,这是迄今为止唯一必须用于潜伏期诊断评价的生物材料。
目前用于死动物脑组织的检测方法难以应用于活动物血液标本,但其他方面的研究也有一些进展,如瑞士科学家研究显示,朊病毒可与血液中血纤维蛋白溶酶原结合,对于这一结合蛋白的检测可能作为血检的基础。
目前有多家公司正着力开发这类产品,如Caprion公司正探索以形态漂移(Shape2shift2 ing)蛋白作为诊断目标。
Wadsw orth JD等〔9〕应用磷酸钠沉淀组织中PrP(Sc),并通过增强化学发光提高了免疫印迹的敏感性,这一方法用以调查和分析PrP(Sc)蛋白4例vC JD病人组织中的分布情况,结果表明,除脑组织外,扁桃体,脾和淋巴节都为阳性,其中扁桃体一致表现为最高的浓度,同时在视网膜、视神经上检出PrP(Sc),并在其中一例的直肠、肾上腺、胸腺中检出PrP(Sc),阑尾和血液用本方法检测均为阴性。