PCR仪温度校准的必要性及方法
PCR仪校验规程
PCR仪校验规程
PCR仪校验规程
1.目的：
确保本仪器的功能和运行正常，检测数据正确，特制定本规程。
2.技术指标
加热范围：可调式热盖，控制温度范围从30℃~110℃。
温度精度：0.1℃
热均一性：15秒内温度均一性0.3℃。
升温、降温速度：最快升温速度4℃/秒，最快冷却速度3.0℃/秒。
电压：100～240V
频率：50～60Hz/相
功率：250W
存储量：程序最多可有1000个，每个最多99步，总步骤可达1500步。
3.自校步骤
3.1打开电源开关，电源指示灯亮，仪器自校。
3.2进入控制面板，利用各种操作键编制程序。
3.3放入加好样品的Eppendorf管，关好热盖，启动程序。
3.4待程序运行结束后，取出Eppendorf管，将产物进行电泳，并与标准Marker 进行比较，观察其是否与预期设计的片段大小相符。
4.结果判定
将自校结果与上述各项技术指标进行比对，如二者相符，则仪器检定合格，可以正常使用；否则应及时与厂家联系维修。
5.校验周期
一年。
6.参考文件
JJF 1071国家计量校准规范编写规则
JJF 1001 通用计量术语及定义
GBT/T 8170 数值修约规则与极限数值的表示和判定7.记录表格
《测试设备校验记录表》。
基因扩增仪(PCR仪)温度校准
link appraisement陕西中检计量测试技术有限公司图1 内部结构示意图CHINA SCIENCE AND TECHNOLOGY INFORMATION May.2021·中国科技信息2021年第10期10万～30万◎室或样品池中孔温度进行测量、在装有反映缓冲液的PCR管中安置温度传感器用于对反应缓冲液温度进行测量，是PCR仪现有的两种主要校准方法。
前者能将加热室或样品池中各点温度、均匀度直接获取，然而却无法将PCR管内反应体系温度反映；后者能获取可将PCR反应中各阶段温度更精确、真实反映的温度参数，然而PCR管质量却会对其构成巨大影响。
综合来看，采用后者展开测量，相对而言更加合理、科学。
PCR仪温度校准项目稳定的温度循环，是PCR得以成功实现的基础条件之一。
温度准确性、升降速度及温场均匀性和最大超调温度等温度控制的动、稳态特性，会对PCR扩增结果的准确性构成严重影响，温度准确性作为PCR仪关键性能指标之一的温度准确性，如果处于较低水平会引起非特异性扩增的情况，更有甚者会导致扩增结果出错，构成假阴性和假阳性。
现有PCR仪性能主要指标中，有关准确度方面的指标多以±0.5℃为主，个别PCR仪性能较好，能实现±0.3℃的温度准确度。
所以，有必要测试 PCR仪控温准确度。
在计算校准实验平均温度时，可采用公式：n ttnii∑==1，式中ti代表各个测量点实际温度值；i代表检测中使用的温度探头序号；n代表检测中使用的温度探头数量。
温场均匀性因PCR仪加热器难以均匀加热的缘故，PCR仪模块上各孔间会有适量温差存在，进而影响试验结果。
PCR仪边中间区域温度通常高于边缘点，因此PCR仪性能指标之一的均匀性也很重要，普遍规定在±0.5℃，个别性能较好的 PCR仪能实现±0.3℃的温度均匀度。
校准试验中，挑选16个孔板中的特殊反应位置用于温度测量，能将孔板温度均匀性获取。
pcr仪校准标准
pcr仪校准标准
一、目的
本标准规定了PCR仪的校准方法、校准项目和校准周期，以确保PCR仪的准确性和可靠性。
二、适用范围
本标准适用于各类PCR仪的校准，包括实时荧光定量PCR仪、普通PCR仪等。
三、校准方法
1.实时荧光定量PCR仪校准方法
（1）选定标准品：选择已知拷贝数的标准品，用于校准PCR仪的荧光定量检测系统。
（2）设置仪器参数：按照仪器说明书设定PCR仪的参数，包括退火温度、延伸时间、循环数等。
（3）运行PCR反应：将标准品DNA加入到PCR反应液中，按照设定的参数进行PCR反应。
（4）数据分析：记录PCR仪生成的荧光信号数据，使用标准曲线法计算标准品的拷贝数。
将计算结果与已知拷贝数进行比较，评估仪器的准确性。
2.普通PCR仪校准方法
（1）温度校准：使用温度计测量PCR仪的加热块温度，观察是否与设定温度一致。
可以参考仪器说明书中的温度校准表进行校准。
（2）灵敏度校准：使用已知浓度的模板DNA进行PCR反应，观
察是否能够正确检测到目标基因。
可以参考仪器说明书中的灵敏度校准表进行校准。
四、校准项目
1.实时荧光定量PCR仪校准项目：荧光信号稳定性、荧光信号准确性、拷贝数计算准确性等。
2.普通PCR仪校准项目：加热块温度准确性、灵敏度检测准确性等。
五、校准周期
1.实时荧光定量PCR仪校准周期：建议每季度进行一次校准。
2.普通PCR仪校准周期：建议每年进行一次校准。
PCR仪温度校准的研究
Science &Technology Vision科技视界0引言PCR 技术是一项在短时间内体外大量扩增特定的DNA 片段的分子生物学技术[1],PCR 仪的工作原理在于为DNA 实验制造不同的温度环境,使DNA 变性、退火、引物链延伸,其实质为一台精密温度控制仪。
其温度的准确性和稳定性、波动性直接影响DNA 反应3个阶段过程中基因片段的扩增质量。
但是目前国内PCR 仪器的校准规程里并未对温度校准装置的响应速度及温度测量位置进行详细阐述,为此本文针对PCR 仪试样环境温度的测量装置及测温位置进行探讨。
1PCR 仪简介1.1PCR 仪简介目前市面上PCR 仪的主流方向为半导体式PCR,其内部结构示意图如图1所示:在快速导热金属质地的基座上设有多个试管孔,并由下方的半导体片进行加热制冷控温。
图1半导体式PCR 仪内部结构示意图1.2PCR 仪校准用温度传感器PCR 仪使用的基座按孔数分有48孔、60孔、96孔,按孔的大小也分为0.2ml、0.5ml 等。
根据PCR 仪的特殊结构,若采用一般铂电阻的形状及大小无法与基座完全接触,且粗大的铂电阻数据线使得在校准过程中带闭盖结构的PCR 仪顶盖无法闭合,加强了空气对流,破坏了基座温度场分布,影响校准结果。
目前市面上主流的国外PCR 温度检测装置其测量传感器使用固定测点间距及探头大小的检测系统,其普适性低,不适用于检测对象具有多样性的计量检测机构。
此外,以DRIFTCON 的PCR 实时检测系统为例,其温度探头(如图2所示)虽能和基座试管孔完美贴合,但尺寸较大直接影响其热容值,导致热响应速度减慢,不能满足快速检测的需求,在校准PCR 仪升降温速率时偏差较大。
(1)(2)图2BIOplastics 的温度传感器图2温度测量2.1标准器装置1)温度采集利用本院自主研发的Vtest-1101温湿度试验设备自动检定系统的18CH 温度数据采集器(如图3所示),对温度数据进行自动快速采集。
pcr仪测温方法
pcr仪测温方法
PCR测温服务
PCR是分子生物学领域的关键技术。
不管是在基础研究还是临床诊断领域，
PCR 的应用越来越广泛。
一个稳定的温度循环是成功实现PCR所必须的，
在PCR反应过程中
对温度控制的要求很高，
良好的温度控制
是PCR仪质量好坏的关键。
为什么要对PCR仪进行测温
1、PCR仪的温度条件和状态对于PCR试剂盒的研发和应用来说，是必不可少的条件之一
2、根据测温的结果可以避免某些试剂盒对某些特定品牌型号仪器的依赖，拓宽试剂盒的应用范围
3、在合格的仪器上做实验可以极大的节约人力物力
4、对于拥有老旧仪器和高强度使用的实验室来说，节省效果尤为明显
5、良好的实验室管理中包含了对仪器的定期质控
6、定期对PCR仪进行温度测定可以完善实验室的质量管理体系
PCR仪测温服务对象：
大专院校
科研院所
国家各级疾控中心（CDC）
国家各级检验检疫部门
企业用户
内六角的PCR仪温度检测服务
内六角科技提供的PCR仪温度检测服务，采用国际主流的15通道实时动态温度记录的温度检测系统，结合自主研发的温度分析软件，创新的在传统的分析温度准确性、均匀性等基础上，对温度过冲的过程进行了详细的分析，并尝试推出了PCR仪温控状态的分类标准和对每台检测过的PCR仪进行温度和时间值修正指导的服务。
内六角的PCR仪温度主要检测项目：
●升降温速率
●准确性
●当匀性
●过冲情况
●个性化检测要求
内六角的PCR仪测温服务特色15通道实时动态温度记录。
基因扩增仪(PCR仪)测温系统校准规范
JJF ××××─201×基因扩增仪（PCR仪）测温系统校准规范1 范围本规范适用于48孔或96孔孔板结构的测量范围为（0～120）℃的多通道基因扩增仪（PCR仪）测温系统或者单通道基因扩增仪（PCR仪）测温仪的的校准，其他孔板结构和温度范围的基因扩增仪（PCR仪）测温系统的温度校准可以参考本规范。
2引用文件本规范引用下列文件：JJF 1071-2000 《国家计量校准规范编写规则》JJF 1007-2007 《温度计量名词术语及定义》JJF 1527-2015 《聚合酶链反应分析仪校准规范》YY/T 1173-2010《聚合酶链反应分析仪》ITS-90 1990年国际温标凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本规范；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本规范。
3术语3.1 基因扩增仪（PCR仪），即聚合酶链反应分析仪polymerase chain reaction analyzer基于PCR（聚合酶链反应）技术原理，模拟DNA或RNA的复制过程，在模板、引物、校验和没等存在的条件下，特异扩增已知序列，对其进行检测分析的仪器设备。
[YY/T 1173-2010 3.2]3.2 基因扩增仪（PCR仪）测温系统temperature measuring system for Polymerasechain reaction analyzer用于基因扩增仪（PCR仪）的专用温度校准装置。
3.3 温度校准专用等温块与配件isothermal block and accessory for temperaturecalibration与标准恒温槽配套使用并提供基因扩增仪测（PCR仪）温系统温度校准的洁净温场的辅助装置。
3.4 温度校准专用等温块测试孔testing hole for temperature calibration模拟基因扩增仪控温块内的结构，提供基因扩增仪（PCR仪）测温系统探头布放插孔的专用等温块。
pcr校准规程
1、温度校准
温度控制是PCR仪的核心功能之一，必须确保加热和冷却均匀、准确。
通常使用温度计或红外线测温仪来检查PCR仪内部不同位置的温度是否稳定，并与设置温度进行比较，以确保其精度和准确性。
2、时间校准
时间控制是PCR过程中的另一个重要因素。
在PCR过程中，各个步骤的时间应该严格控制，以确保反应的准确性。
通过使用标准计时器或电子计时器，在不同时间段内测试PCR仪的时间精度和准确性。
3、光强度校准
PCR仪的光强度检测系统需要被校准以确保准确读取荧光信号。
为此，校准PCR仪前需要检查光源和检测器是否正常工作。
然后，使用标准荧光素材，如SYBR Green等，对PCR仪进行校准，以确保光强度检测系统的精度和准确性。
4、热平衡校准
热平衡是指PCR仪内部所有区域的温度达到稳定状态。
为了保证PCR反应的可靠性和准确性，必须确保PCR仪的各个区域在温度上达到平衡。
通常使用热敏电阻或热电偶来检查PCR仪不同位置的温度是否均匀，并进行调整以确保热平衡。
5、压力校准
PCR反应管需要在PCR仪中得到牢固的支撑，以保持其位置不变，并避免在高速旋转时移位。
因此，压力校准也是PCR仪校准过程中非常重要的一步。
通过检查PCR反应管架的压力和精度，确保PCR反应管可以正确地放置并安全运行。
PCR仪确认方案
PCR仪确认方案PCR仪是一种用于扩增DNA片段的仪器，是分子生物学实验室中常用的设备之一、为了确保PCR仪的准确性和可靠性，需要进行PCR仪的确认方案。
下面是一个详细的PCR仪确认方案，包括仪器准备、性能测试和验证步骤。
一、仪器准备1.确定确认PCR仪的固定条件，例如温度范围、时间设置等。
2.准备PCR仪所需的耗材，包括PCR试管、PCR反应物、引物等。
3.清洁PCR仪的工作台面和内部，确保无灰尘和杂质。
二、性能测试1.温度精确度测试a.使用温度计分别测量PCR仪的加热块和冷却块的温度，记录温度值。
b.以设置的温度为目标值，在PCR反应槽中设置温度计，进行温度稳定性测试。
c.比较目标温度和实际温度之间的差异，计算温度偏差。
2.温度一致性测试a.在PCR反应槽中放置数个PCR试管，每个试管中加入相同的反应物。
b.设置PCR仪的温度循环程序，进行温度一致性测试。
c.检查各个PCR试管中的反应物扩增结果，评估PCR仪温度循环的一致性。
3.温度均匀性测试a.在PCR反应槽中设置多个温度计，测量不同位置的温度。
b.运行PCR仪的温度循环程序，观察和记录各个位置的温度。
c.比较各个位置的温度差异，计算温度均匀性。
4.反应时间测试a.在PCR反应槽中放置PCR试管，设置不同的扩增时间。
b.完成PCR反应后，分析PCR试管中的扩增结果，评估PCR仪的反应时间准确性。
三、验证1.重复性验证a.准备相同的PCR反应物和程序，分别在不同的PCR仪上进行PCR扩增。
b.比较各个PCR仪之间的扩增结果，评估其重复性。
2.敏感性验证a.准备不同浓度的DNA样品，分别加入PCR反应槽进行PCR扩增。
b.比较不同浓度DNA样品的扩增结果，评估PCR仪的敏感性和线性范围。
3.特异性验证a.准备包含目标基因和非目标基因的PCR反应槽，进行PCR扩增。
b.检查PCR试管中的扩增产物，确认PCR仪的特异性。
四、记录和分析结果1.记录每个测试项目的结果，包括温度精确度、温度一致性、温度均匀性、反应时间等。
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浅谈PCR仪温度校准的必要性及方法
————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：
浅谈PCR仪温度校准的必要性及方法
朱晨彬，朱毅晨，姚丽芳，张丽萍，陈宇，朱学平
（上海市计量测试技术研究院）
摘要：本文分析了PCR仪使用的现状及其进行温度校准的必要性。
提出了PCR仪温度校准的方法和校准项目（温度准确性，温场均匀性，升降温速率，最大超调温度）以及数据处理方法，并分析了每一校准项目的重要性。
关键词：PCR仪，温度校准，温度准确性，温场均匀性，升降温速率，最大超调温度
一、引言
PCR是聚合酶链反应(polymerase chain reaction)的简称，是在短时间内体外大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。
自动完成聚合酶链反应，提供DNA扩增的温度条件而设计的仪器称为PCR仪。
PCR仪主要用于DNA片段的放大，可将DNA分子或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，在这过程中主要是3个特征温度循环：
1．高温变性：把样品加热至90～95℃让DNA模板变性变成单链。
2．低温退火：让样品的温度迅速下降至50～65℃,引物就可以结合到模板上去。
3．适温延伸：让样品的温度上升至70～75℃,DNA聚合酶就可以从引物开始用底物复制出新链。
因此，在PCR反应过程中对温度控制的要求很高，良好的温度控制是PCR仪质量好坏的关键。
二、PCR基因扩增仪校准的现状
PCR仪的控温精度、升降温速率以及温场的均匀性等直接影响DNA片段扩增的结果。
PCR仪经使用后，其温度传感器的计量特性会发生变化，作为计量设备一般须经定期校准后方能继续使用。
几乎进行聚合酶链反应试验的实验室（如基因判别、亲子鉴定、DNA个体识别）都会使用多台扩增仪以满足实验需求。
而且，实验室内的基因扩增仪都是常开常用，使用频率高，很难保证其性能指标符合实验要求。
各实验室对PCR仪的质量控制还停留在自检自校和依赖于厂商的售后支持。
我院于2006年编写了基因扩增仪（PCR仪）的校准规范JCJ/E111025.1/0-2006，早已开展PCR仪的温度校准项目。
使用标准装置：
装置名称（PCR仪）校准仪
特点加热槽温度动态实时检
测
适用工况任何工况
测温通道数16
温度测量范围（0-110）℃
系统分辨率0.01℃
测温准确度±0.10℃
采样频率2Hz
由于需要PCR仪升降温速率较快, 故要求温度传感器的热惯性小(滞后要小)，反应灵敏。
因此，校准过程使用热敏电阻作为测温传感器。
标准测试程序为：
序号温度点持续时间
步骤1 30°C1:00 分钟
步骤2 95°C3:00 分钟
步骤3 30°C 2:00 分钟
步骤4 90°C 3:00 分钟
步骤5 50°C 3:00 分钟
步骤6 70°C 3:00 分钟
步骤7 60°C 3:00 分钟
步骤8 30°C 1:00 分钟
通过专用软件进行数据处理及分析，并绘制温度循环测试曲线。
见图一
图一pcr温度循环测试曲线
三、PCR仪温度校准的项目及必要性
一个稳定的温度循环是成功实现PCR 所必需的。
其中温度控制的动、稳态特性是影响PCR 扩增结果正确与否的最重要因素之一, 这包括温度准确性、升降温速度、温场均匀性、最大超调温度。
（一）、温度准确性
温度准确性是PCR 仪最重要的性能指标，如温度准确性低可直接造成非特异性扩增，甚至是错误的扩增结果，造成假阳性和假阴性。
市场上各家厂商考核基因扩增仪（PCR 仪）性能的主要指标，一般厂家的企业指标为±0.5℃，一些性能较好的产品可以实现的温度准确度为±0.3℃。
故需对PCR 仪控温准确度进行测试。
校准实验平均温度的计算公式为：
1
i
i t
n
=∑
I —参加检测的温度探头序号；n —参加检测的温度探头的数量 （二）、温场均匀性
由于PCR 仪加热器加热不均匀，导致PCR 仪模块上各孔存在一定温差。
造成试验结果偏差。
一般PCR 仪边缘点的温度低于中间区域，所以均匀性为PCR 仪重要的性能指标。
一般厂家的企业指标规定均匀性为±0.5℃，一些性能较好的产品可以实现的温度均匀度为±0.3℃。
校准实验时，通过选取孔板中16个特殊反应位置（如图2所示）来测量温度，并得出孔板的温度均匀性。
均匀性为各个探头在同一时刻最大温度与最小温度的差值。
均匀度计算公式为：t max -t min （t max =最大温度；t min =最小温度）
图二 96孔板探头布点示意图 （三）、升降温速率
PCR扩增产物数量的多少决定了PCR的效率。
为了在短时间内获得尽可能多的产物，需要仪器在升降温段具有按照预设升降温速率快速升温和降温的能力（最大升温速率达15~20℃）。
一个完整的PCR过程，是由若干个升温→恒温→降温循环构成的。
因为“变性”，“退火”和“延伸”3个阶段是必须要保证的。
因此，只有使升降温的过程尽可能地迅速，才能缩短每个PCR循环以及整个PCR 过程所需时间。
一般厂家的企业指标规定升温速率为±3℃/sec。
仪器校准实验时，升温速率为温度从40℃到90℃的时间；降温速率为温度从70℃到35℃的时间。
详见图三
图三PCR降温速率计算示意图
（四）、最大超调温度
当温度从一定点温度调节到另一定点温度,就会产生温度的超调。
超调温度过大同样会对试验产生影响，所以校准实验时，需要计算最大超调温度和平均超调温度。
见图四
图四温度曲线超调温度部分
四、结束语
聚合酶链反应（PCR）技术由于其极高的检测灵敏度和特异性已经越来越多地应用于临床检验、司法鉴定等工作中。
有多种原因会造成PCR扩增的错误结果，排除实验过程中人为因素造成的误差，PCR仪温度控制系统工作性能的优劣是造成检验结果出现偏差甚至错误的至关重要因素。
通过对PCR仪的定期校准可以极大的避免PCR过程中假阳性或假阴性结果的产生，提高PCR试验的准确性和稳定性。
参考文献
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[2] 陈居德,杨明. PCR扩增基因检测中的温度控制[J]. 仪器仪表用户, 2004, (01) .
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[4] 陈居德,杨明. PCR扩增基因检测中的温度控制[J]. 仪器仪表用户, 2004, (01) .
[5] 薛生虎,李东升,叶子弘,俞晓平,方荣瑞. 基于多传感器融合技术的PCR仪温度校准系统[J]. 仪
器仪表学报,2011,(06)
Introduction to the necessity and method of temperature calibration for
PCR instrument
Zhu Chenbin，Zhu Yichen，Yao Lifang，ZhangLiping，Chen Yu，Zhu Xueping Abstrat:The situation of using PCR intrument and the nessity of its temperature calibration is introducted. The mathod of PCR instrument’s temperature calibration is given by this article. The temperature calibration items for PCR instruments that contain the temperature accuracy, temperature uniformity ,velocity of temperature change,max overshoot temperature and mathods of data analysis are also introducted. So is the temperature analysis of each calibration items
Key words: PCR instrument；temperature calibration；temperature accuracy；temperature uniformity；velocity of temperature change；max overshoot temperature。