第十章 电泳

影响聚合的主要因素

引发剂和增速剂的浓度：浓度小易导致聚合速度慢；浓度 过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制 使聚合过程在40~60分钟内完成。 系统pH值：酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最 佳pH值，以获得最佳的聚合结果； 温度：低温下聚合导致凝胶变脆和混浊；适当提高温度可 以使凝胶透明而有弹性； 分子氧：分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气 系统纯度：金属离子会影响凝胶的聚合；
特点：设备简单、操作简便、测定快速、重复
性高、样品无需纯化。
SDS-PAGE 的原理
蛋白质分子的解聚
– SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助 溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键， 使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三 级结构； – 而强还原剂，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能 使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
丙烯酰胺的聚合
丙烯酰胺的聚合通常是由化学或光化学过程完成
的，通常采用过硫酸铵、过硫酸钾或核黄素（引 发剂）来引发该过程；以N，N，N’，N’-四甲基 乙二胺（TEMED）为增速剂。
丙烯酰胺的化学聚合是由过硫酸铵在碱性条件下
，产生游离氧自由基引发单体丙烯酰胺成为自由 基状态，经过一系列的自由基反应得到的聚合物 ；
在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质
分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨 基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质SDS胶束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的 电荷量，消除了不同分子间的电荷差异； 同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同， 这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的 影响。
作为载体两性电解质应该具有以下特点：
– 应该是两性的，使它们在分离柱中也能达到一个平 衡位置； – 应该可以作为“载体”，两性电解质不能用于等电 聚焦，只有载体两性电解质，即具有好的导电性和 好的缓冲能力的化合物才能用于等电聚焦。
用于等电聚焦的主要载体两性电解质
Ampholine(瑞典LKB公司)
ห้องสมุดไป่ตู้
5 10 15
20
30~200 15~100 10~50
2~15
5 10 15
20
60~700 22~280 10~200
5~150
PAGE的具体操作过程

制胶：确定凝胶配方（凝胶、引发剂、增速剂的浓度和缓 冲液），使用灌胶模具灌胶； 样品准备：选择合适的样品缓冲液、确定合适的样品浓度 （1~2mg/L，考染），加样（溴酚蓝）；
载体两性电解质pH梯度等电聚焦
等电聚焦（isoelectrofocusing）, IEF 利用蛋白质分子或其它两性分子的等电点不同， 在一个稳定的、连续的、线性的pH梯度中进行蛋 白质的分离和分析。 利用等电聚焦技术分离、分析的对象仅限于蛋白 质和两性分子。 根据建立pH梯度的原理不同，梯度有分为载体两 性电解质梯度（Carrier ampholytes pH gradient ）和固相梯度。

凝胶浓度太大，孔径小于样品分子尺寸，电泳 时蛋白质分子不能进入凝胶，样品仍留在加样
位置；

凝胶浓度太小，孔径太大，样品中各种蛋白质
分子均随缓冲液推进，不能得到很好的分离；
凝胶浓度与分子量测定的关系
凝胶浓度 (C=2.6%) 分子量范围 (kDa) 凝胶浓度 (C=5%) 分子量范围 (kDa)
– 由许多脂肪族的多氨基多羧基的异构体和同系物组 成，它们具有连续改变的氨基与羧基比
Servalyte
(德国Serva 公司) (瑞典Pharmacia 公司)
– 产品Biolyte
Pharmalyte
– 产品分为九种pH范围
pH梯度的形成
在没有电场时，载体两性电解质的pH值大约是
该溶液pH范围的平均值，所有载体两性电解质 分子都荷电。
离子强度的选择
离子强度不宜过高，此时电导率低，产热少，电
泳速度快；但也不可过低，必须具有一定的缓冲 能力，过低的离子强度容易导致蛋白质絮凝。

一般选择缓冲液的离子强度为0.01~0.1 mol/L之间
凝胶浓度的选择


由于PAGE电泳分离不仅取决于蛋白质的电荷密度，而 且取决于分子的大小、形状。因此，与凝胶的分子筛 效应（即凝胶的孔径与电泳的分辨率、电泳速度）密 切相关。 根据凝胶孔径与被分离分子的大小和形状，可以将凝 胶分为： – 非排阻性凝胶（unrestrictive gel）:浓度0.7 ~1.0% 的琼脂糖凝胶； – 排阻性凝胶（restrictive gel）：浓度大于1%的琼 脂糖凝胶和常规PAGE

工作原理
蛋白质的等电点
蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不 同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是 在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该 蛋白的等电点（isoelectric point pI）。
蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象，
是一个物理化学常数。 可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析

电泳洗脱仪：回收样品 凝胶扫描和摄录装置：对电泳区带进行扫描，从而给 出定量的结果。
垂直电泳槽及灌胶模具
常规聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：

由于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是多孔介质，不仅 能防止对流，把扩散减少到最低；而且其孔径大小与 生物大分子具有相似的数量级，能主动参与生物分子 的分离，具有分子筛效应。
第十章 电泳技术 Electrophoresis
本章主要知识点
电泳的概念 电泳的基本原理 电泳技术的分类 常用的凝胶电泳技术有哪些？ 电泳装置的基本组成 聚丙稀酰胺凝胶电泳的一般过程
SDS-PAGE电泳的基本原理及过程
琼脂糖电泳的特点及其应用 等电聚焦电泳的基本原理 双相电泳的概念及其特点



电泳：4~6小时，待溴酚蓝前沿到达阳极底部；
检测：紫外扫描或染色（考马斯亮蓝R-250、银染色—灵 敏度比考染高100倍、荧光探针）； 照相、凝胶干燥： 定量测定：

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
主要用于测定蛋白质亚基分子量以及未知蛋白
质分子量的测定；
蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和 分子形状的改变
未知蛋白质分子量的测定
基于上述SDS-PAGE的原理介绍，我们可以利
用SDS-PAGE电泳进行未知蛋白质的分子量测 定；
– 以不同分子量的标准蛋白进行SDS-PAGE电泳得到不 同标准蛋白的电泳迁移率，制作标准校正曲线，然 后对未知蛋白在相同条件下进行SDS-PAGE电泳，测 定迁移率，从标准曲线得到相应的分子量；
载体两性电解质在电场中 形成pH梯度的模式图
等电聚焦的主要应用
同工酶分离、分析
pI
测定
实际应用当中，等电聚焦的操作过程要复杂得
与化学特性。
电泳迁移率

电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下 ，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。
d m tE
其单位是cm2· -1 · -1 sec V 电泳迁移率的不同提供了从混合物中分离不同物 质的基础

电泳的大致分类
依据电泳原理，现有三种形式的电泳分离系
统
– 移动界面电泳（moving boundary electrophoresis） – 区带电泳（zone electrophoresis ） – 稳态电泳（steady state electrophoresis ）

分子筛效应
+
-
A
B
C
图中A，B，C均为阳离子，在直流电场作用下电泳情况示意图 分子量大小依次为MA=MB>MC，所带电荷量相同QA=QB=QC。
琼脂糖凝胶的性能、结构与特点
其优点如下：

琼脂糖凝胶孔径较大，0.075%琼脂糖的孔径为800nm ，可以分析百万道尔顿分子量的大分子，但分辨率较 凝胶电泳低。 机械强度高：可以在浓度1%以下使用；
其中区带电泳是目前常用的电泳系统。
区带电泳的主要技术
区带电泳中的常用技术
– 载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、
聚焦电泳
– 无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳
凝胶电泳

作为电泳支持介质必须具有 化学惰性 不干扰大分子的电泳过程
化学稳定性好
均匀 重复性好 电内渗小等特性

凝胶电泳的支持介质： – 聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG） 由丙烯酰胺和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺在引发 剂和增速剂的作用下，聚合而成； – 琼脂糖凝胶： 从琼脂中精制分离出的胶状多糖，其分子结构大部 分是由1,3连接的β-D-吡喃半乳糖和1,4连接的3,6脱水αD-吡喃半乳糖交替形成的；
无毒； 染色、脱色程序简单，背景色较低；




热可逆性；
生物中性：一般不与生物材料结合； 电内渗（EEO）大：对于对流电泳有益
电泳系统的基本组成



电泳槽：是凝胶电泳系统的核心部分，管式电泳槽、 垂直板电泳槽、水平板电泳槽 电源:聚丙烯酰胺凝胶电泳200~600V，载体两性电解质 等电聚焦电泳1000~2000V，固相梯度等电聚焦 3000~8000V 外循环恒温系统:高电压会产生高热，需冷却； 凝胶干燥器:用于电泳和染色后的干燥； 灌胶模具：制胶，玻璃板和梳子； 电泳转移装置：利用低电压，大电流的直流电场，使 凝胶电泳的分离区带或电泳斑点转移到特定的膜上， 如PVDF膜
当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极
或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多 负电）将最快地向阳极移动；当它达到净电荷 为0的位置时才停止，这个位置靠近阳极，由 于它具有高的缓冲能力，使环境溶液的pH等于 分子本身的pI。