家蚕30K蛋白LP7的分离纯化及功能初探硕士学位论文
家蚕Bm8K蛋白的分离纯化及功能初探的开题报告
家蚕Bm8K蛋白的分离纯化及功能初探的开题报告
题目：家蚕Bm8K蛋白的分离纯化及功能初探
一、研究背景与意义
家蚕是重要的农业经济昆虫，其幼虫（蚕豆）可提供丝绸和蚕豆丰
厚的价值，因此在国内外育种、养殖和经济利益方面都有着重要的地位。
在蚕豆的生长和发育过程中，各种蛋白质的合成、分泌和代谢起着重要
的作用。
其中，Bm8K蛋白在家蚕幼虫的生长发育和免疫防御等方面具有重要作用。
因此，对Bm8K蛋白进行分离纯化和功能研究，对于深入了
解家蚕的生产性能，开发蚕豆的经济利用价值具有重要的意义和应用价值。
二、研究内容和方法
1. Bm8K蛋白的分离和纯化
本研究采用离心分离法、柱层析法和电泳等方法针对蚕豆的不同部
位进行Bm8K蛋白的分离和纯化。
2. Bm8K蛋白的结构和功能研究
通过质谱分析、氨基酸序列分析和蛋白质三维结构预测等方法对
Bm8K蛋白的结构和功能进行研究，探究其在家蚕幼虫生长发育和免疫防御等方面的作用。
三、预期结果和意义
预计通过本研究可以高效地分离纯化出Bm8K蛋白，并探究其在家
蚕幼虫生长发育和免疫防御等方面的作用，为家蚕蚕豆的生产性能和经
济利用价值提供理论基础和实验支持，同时也有助于家蚕产业的发展。
家蚕30K蛋白LP7的分离纯化及功能初探硕士学位论文
摘要硕士学位论文家蚕30K蛋白LP7的分离纯化及功能初探I西南大学硕士学位论文II学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。
除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。
作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。
本人授权大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。
涉密论文按学校规定处理。
作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日摘要摘要家蚕30K蛋白是在家蚕血液中大量表达的一类低分子量脂蛋白，也是桑蚕特有的一类蛋白质。
该类蛋白由脂肪体合成，并分泌到血液中，它们是家蚕生长发育过程中的主要存储蛋白之一，也是家蚕胚胎发育的重要能源物质。
30K蛋白成员众多，其氨基酸序列同源性较高，因此对这类蛋白进行分离纯化较为困难。
目前，已经分离纯化出的30K蛋白只有4种。
家蚕基因组框架图的完成为我们提供了大量的数据资源，利用这些数据预测到10个30K蛋白基因，这些基因所编码的氨基酸数目在246-271个之间，理论等电点在6.1-8.4之间，分子量在28-31kD之间，它们的氨基酸序列同源性都在60%以上。
本研究通过分析各类30K蛋白的理论等电点和分子量，设计并开展了30K蛋白的纯化工作，获得了一种新的30K蛋白，在此基础上对该蛋白进行了相关的分析和研究，主要结果如下：本研究首先参考了10个30K蛋白的理论分子量和等电点，设计了分离纯化的实验流程和实验条件。
通过硫酸铵沉淀和三种层析分离技术（阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水层析），对家蚕血液蛋白质进行分离纯化，最终获得一种30K蛋白。
蚕蛹蛋白论文：蚕蛹抗氧化多肽的制备及分离纯化研究
蚕蛹蛋白论文：蚕蛹抗氧化多肽的制备及分离纯化研究【中文摘要】人类许多慢性疾病及衰老现象均和人体内的自由基水平失衡有关,外源性抗氧化剂可以帮助人们维持体内自由基的平衡。
通过对具有抗氧化活性的天然食物进行研究、筛选和改性有可能开发出有效的抗氧化药物和保健食品蚕蛹蛋白是一种优质蛋白质资源,含有18种氨基酸,其中8种人体必需氨基酸含量超过氨基酸总量40%,其蛋白含量约为50%,是一种比大豆蛋白更具营养价值的优质蛋白质资源本论文研究了蚕蛹蛋白粉的提取,酶解工艺条件,多肽抗氧化活性的检测方法,以及蚕蛹多肽中具有DPPH·清除活性的多肽的分离纯化。
1.蚕蛹蛋白粉的脱脂及前处理。
选取常规溶剂正己烷,丙酮,乙酸乙酯,无水乙醇分别作为单一脱脂溶剂做脱脂优化,以脱脂率为指标,得到最佳脱脂溶剂为丙酮。
以超声细胞破碎法,微波破碎法,去离子水浸泡法三种方法对蛋白粉进行破碎处理,以上清液中蛋白含量为指标,得到最佳的破碎处理条件为超声波100HZ,间隔2sec,破碎10min2.建立了蚕蛹多肽体外抗氧化活性的检测方法。
检测了蚕蛹蛋白水解液的抗氧化能力,包括清除超氧阴离子、清除羟自由基、清除DPPH·、【英文摘要】Many chronic diseases and human aging phenomenon have something to do with the imbalance of free radicals inside human body. External antioxidants can help people to maintain the balance of free radicals inside body.It’s possible to develop effective antioxidant drugs and health foods on the base of the research, screening and modification of natural foods with antioxidant activity. Silkworm pupa is a high quality protein resources, containing 18 amino acids, including 8 essential amino acids, the content of which is more than 40%。
蚕丝蛋白制备工艺研究
蚕丝蛋白在化妆品领域的应用
肌肤修护
蚕丝蛋白富含胶原蛋白和氨基酸,能有效修 复受损肌肤,提升肌肤弹性和光泽。
保湿滋养
蚕丝蛋白分子能有效锁住皮肤水分,改善干 燥、粗糙的肌肤状况。
抗衰老
蚕丝蛋白具有强大的抗氧化能力,可中和自 由基,延缓肌肤老化过程。
改善痤疮
蚕丝蛋白具有抗菌和抗炎特性,有助于治疗 痤疮等皮肤病。
工艺参数优化
通过对蛋白提取、分离、纯化等关键步骤进行系统优化,确定最佳的工艺参数。
设备规模扩大
根据生产需求,选用合适的大型设备,如超滤膜系统、喷雾干燥塔等，实现工艺放大。
生产效率提升
优化生产流程、自动化水平和生产管理，确保在大规模生产条件下的高产出和高质量。
质量控制措施
建立完整的质量管理体系，对原料、中间产品和成品进行严格的检测和监控。
4 神经再生
研究发现蚕丝蛋白水胶可作为神经再生支 架,促进神经干细胞分化和神经轴突再生, 有助于治疗神经损伤。
蚕丝蛋白在食品领域的应用
营养增强
蚕丝蛋白含有高质量的蛋 白质、氨基酸和微量元素, 可添加到食品中提高营养 价值。
功能增强
蚕丝蛋白可改善食品的口 感、质地和保鲜性,有助于 开发健康营养的新型食品 。
生物酶修饰处理
利用特异性蛋白酶对蚕丝蛋白进行定向水 解和改性,调控其分子结构和性能。
膜分离技术优化
研发高效的纳滤、超滤等膜分离工艺,实现 蛋白的高纯度分离和浓缩。
连续化自动生产
建立全自动化的连续流生产线,提高制造效 率并确保产品质量的一致性。
蚕丝蛋白制备工艺的未来发展趋势
清洁生产技术
未来蚕丝蛋白制备 将进一步优化环保 型溶剂和分离工艺, 实现更加绿色、节 能的生产体系。
家蚕表皮多酚氧化酶的分离纯化及酶学性质研究
家蚕表皮多酚氧化酶的分离纯化及酶学性质研究马晓春,韩宏岩,许维岸*(苏州大学基础医学与生物科学学院,江苏苏州215123)摘要 [目的]分离纯化家蚕多酚氧化酶,并对其性质进行分析研究。
[方法]采用硫酸铵分级沉淀、凝胶过滤、蛋白质电泳等方法。
[结果]多酚氧化酶分子量约为81kD;最适温度为30℃;最适pH 值为7.0。
低浓度金属离子A g +、C u 2+、M n 2+、Z n 2+对多酚氧化酶有一定的激活作用,而高浓度有抑制作用。
[结论]金属离子对家蚕多酚氧化酶的影响很大,值得更深入的研究。
关键词 家蚕;多酚氧化酶;分离纯化;性质中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)17-07870-02S tud y on th e S ep a ra t ion,Pu rific a tio n an d En zym a t ic P rop e rt ie s o f P o ly ph en o lo x id a s e fromEp ide r m is o f B o m byx m o ri M A X ia o -ch u n e t a l (C o llege o f P reclin ica l M ed icin e and B io log ica l S cien ce ,S ooch ow U n iv ers ity ,S u zh ou,J ian g su 215123)A b s tra c t [O b jective]T h e re sea rch a i m ed to sepa ra te an d pu r ify po lyph en o lox ida se from B om by x m ori an d stu dy its prope r ties.[M e th od]T h e m e th ods o f am m on iumsu lfa te p recip ita tion ,ge l filtra tion,p ro te in e lec troph o re sis and so on w e re u sed.[R e su lt]T h e m o lecu la r w e igh t o f po lyph en o lox i da se w a sabou t 81kD.T h e op ti m umtem pe ra tu re w as 30℃an d th e op ti m umpH w as 7.0.T h e m e ta l ion s o f A g +,C u 2+,M n 2+an d Zn 2+a t low con cen tra tion h ad ce r ta in activ a tion on po lyph en o lo x idase an d th a t a t h igh con cen tra tionh ad inh ib ition.[C on clu sion ]T h e in flu en ces o f h eav y m e ta l ion s on po lyph en o lox ida se from B om byx m ori w e re g rea te r ,to be w o rthfu r th e r s tudy.K e y w o rd s B om byx m ori ;P o lyph en o lo x idase ;S epa ra tion an d pu rifica tion;P rope r tie s作者简介 马晓春(1982-),女,山西大同人,硕士研究生,研究方向:动物生理生化与分子生物学。
蛋白质的分离纯化与分析鉴定(改)
蛋白质的分离纯化技术联用及方法策略摘要：蛋白质的分离纯化方法是生命科学领域关注的热点。
而蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，往往采取几种方法联合使用。
在不了解目标蛋白情况下,应根据各种分离纯化方法的基本原理和应用情况,设计纯化程序，选择适宜的分离策略。
关键词：蛋白质，分离纯化，技术联用，分离策略正文：蛋白质分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要得目的蛋白质的方法。
生物体内的大部分生命活动如催化代谢反应、物质运转、运动的相互协调、兴奋的传导、生长与发育等，均是在蛋白质的参与下完成的。
因此,研究蛋白质对了解生命规律、指导工业生产、医药实践有着重大意义,而蛋白质的分离纯化是蛋白质研究中必不可少的一个环节。
必须要了解目的蛋白的分子量、等电点、溶解性及稳定性等基本性质才能制定出合理的分离纯化方法。
由于不同的蛋白质结构和性质不同,分离方法也不同,例如根据分子大小可使用差速离心、分子筛、超滤或透析等分离技术；根据溶解度大小的不同，使用盐析、溶剂抽提、分配层析、结晶等方法分离；根据所带电荷的不同，可采用电泳、等电点沉淀、离子交换层析等方法；根据结合亲和性，可用新和层析进行分离。
蛋白质的分离纯化技术种类是很多的而且发展很快某些技术如以前不多见的超滤分离方法,目前在国内应用已相当普遍，除此之外广泛使用的层析、电泳方面也不断出现新的技术和方法。
如层析方面,高压液相色谱是一种具有快速和分辨力的柱层析技术。
一、技术联用：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离，提纯和鉴定是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，往往采取几种方法联合使用。
如将等电聚焦电泳与SDS—聚丙烯酞胺凝胶电泳结合起来则可达到极高分辨率的分离效果。
家蚕30kDa载脂蛋白19G1前体的生物信息学分析及克隆表达
浙江理工大学学报,第26卷,第5期,2009年9月Journal of Zhejiang Sci2Tech U niversityVol.26,No.5,Sept.2009文章编号:167323851(2009)0520747207家蚕30kDa载脂蛋白19G1前体的生物信息学分析及克隆表达陈晓平1,2,于 威1,2,张耀洲1,2(1.浙江理工大学生物化学研究所,杭州310018;2.浙江省家蚕生物反应器和生物医药重点实验室,杭州310018) 摘 要:从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中发现了一条编码低分子量30kDa载脂蛋白19G1前体(low molecular mass30kDa lipoprotein19G1precursor)的EST序列(G eneBank登录号:A Y568957),在NCBI数据库中比对后得知该基因的ORF长为771bp,与基因组比对后发现该基因的ORF不含内含子,由单一外显子编码256个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白属于家蚕30K蛋白家族,预测分子量约为29.5kDa,等点电为7.29;信号肽分析显示该蛋白很可能存在信号肽。
根据该基因ORF进行引物设计,以家蚕基因组为模板,PCR扩增获得该基因,将其克隆到p ET228a(+)载体中并导入大肠杆菌BL21(DE3),IPT G诱导表达,裂解菌作SDS2PA GE分析,结果表明该蛋白前体成功表达,为研究其功能打下了基础。
关键词:家蚕;低分子量30kDa载脂蛋白19G1前体;30K蛋白;克隆;生物信息学分析中图分类号:Q591.2;Q513.5 文献标识码:A0 引 言家蚕血清具有抑制昆虫细胞凋亡的作用[1],在昆虫细胞培养基中添加家蚕血清,可以通过抑制宿主细胞的凋亡而提高杆状病毒表达系统中重组蛋白的产量[2]。
家蚕的血清还可以抑制哺乳动物细胞的凋亡,表明家蚕血清含有抑制凋亡的成分[3]。
研究表明家蚕血清中抑制凋亡的成分包括30kDa和70kDa两类蛋白质,对其中抑制凋亡作用最强的蛋白质进行质谱分析,发现该蛋白与一种功能未知的低分子量脂蛋白同源性高达95%[4]。
蚕蛹蛋白提取及其多肽生理功能研究进展
２１ 第 １ ０ ０年 Ｏ期
蚕 蛹 蛋 白提 取及 其 多肽 生理 功 能研 究进 展
李 勇， 王文 昕 （ 南大 学食 品科 学学院 ， 重庆 西
４０１ ） ０７ ５
摘 要 ： 蛹蛋 白是一种优 质 纯天然全价 蛋 白质 ， 蚕 目前 已有很 多有关蚕 蛹蛋 白研 究； 文主要 对蚕 该 蛹蛋 白提 取技术（ 脱脂 、 色、 臭） 脱 除 和蚕蛹 多肽 生理 功能（ 如抗疲 劳、 氧化 、 抗 降血压等 ） 进行 综述。
质及 色 素 脱 除 不彻 底 ， 别是 经 水 溶 胀 后 ， 味 和 色 泽 特 异 更为严重， 不易被大部分消费者所接受 “ ； 以， 所 对 蚕蛹蛋 白脱色和脱臭就显得 尤为重要。现将有关蚕蛹 蛋白提取工艺及其多肽生理功能研究进展综述如下。 １ 蚕蛹 蛋 白提 取
１１脱 脂 ．
蚕蛹蛋 白含油脂量较 高， 因此 首先除去其含有油 脂。 目前蚕蛹脱脂方法主要有机械压榨脱脂法 ， 机械离 心脱脂法和溶剂浸出法等。 机械压榨容易导致蚕蛹破碎； 机械离心脱脂残油率高至 ８ ％～１％， ２ 而溶剂浸 出残油 率在 ５ 以下， ％ 因此 当前蚕蛹脱脂主要采用溶剂浸出法。 浸出溶剂必须具备二个基本条件： 一是对蚕蛹脂肪有 良 好溶解性能 ， 而蚕蛹蛋 白不溶， 溶剂与蛋 白易分离； 二是 溶剂沸点适中， 能通过蒸馏方法脱除溶剂 ｕ 。 吴建一等认为， 影响脱脂主要因素是蚕蛹含水 量， 含 水量 越少， 脂率 越 高， 脱 干蚕蛹 脱 脂效果 越好 ； 其 次是溶剂 与原料 配比， 从脱 脂角度分析， 溶剂越多 ， 脱 脂效 果越好； 考虑溶剂 回收， 但 蚕蛹与溶剂 质量 比在 １： ．时， 过提 高浸 出温 度可达 到较 好脱脂 率 。 １ ５ 通
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摘要硕士学位论文家蚕30K蛋白LP7的分离纯化及功能初探I西南大学硕士学位论文II学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。
除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。
对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。
本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。
作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。
本人授权大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。
涉密论文按学校规定处理。
作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日摘要摘要家蚕30K蛋白是在家蚕血液中大量表达的一类低分子量脂蛋白，也是桑蚕特有的一类蛋白质。
该类蛋白由脂肪体合成，并分泌到血液中，它们是家蚕生长发育过程中的主要存储蛋白之一，也是家蚕胚胎发育的重要能源物质。
30K蛋白成员众多，其氨基酸序列同源性较高，因此对这类蛋白进行分离纯化较为困难。
目前，已经分离纯化出的30K蛋白只有4种。
家蚕基因组框架图的完成为我们提供了大量的数据资源，利用这些数据预测到10个30K蛋白基因，这些基因所编码的氨基酸数目在246-271个之间，理论等电点在6.1-8.4之间，分子量在28-31kD之间，它们的氨基酸序列同源性都在60%以上。
本研究通过分析各类30K蛋白的理论等电点和分子量，设计并开展了30K蛋白的纯化工作，获得了一种新的30K蛋白，在此基础上对该蛋白进行了相关的分析和研究，主要结果如下：本研究首先参考了10个30K蛋白的理论分子量和等电点，设计了分离纯化的实验流程和实验条件。
通过硫酸铵沉淀和三种层析分离技术（阴离子交换层析、阳离子交换层析和疏水层析），对家蚕血液蛋白质进行分离纯化，最终获得一种30K蛋白。
通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）检测，所获得的蛋白样品信号峰单一。
同时，通过MALDI-TOF-MS获得该蛋白的肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting,PMF)，利用GPMAW（General Protein/Mass Analysis for Windows）软件搜索家蚕蛋白质理论数据库，该蛋白被鉴定为30K蛋白基因Bmlp7编码的蛋白LP7，且其序列与已报道的所有30K蛋白序列均有较大差异。
利用多克隆抗体制备技术，将分离纯化获得的30K蛋白LP7作为抗原，采取多次皮下注射的方法对家兔进行免疫，颈动脉放血法采集血液，获得其抗血清。
通过饱和硫酸铵沉淀法粗提抗血清中的抗体，去掉了大量杂质和部分杂蛋白，最后获得了抗30K蛋白LP7的抗体粗品，达到下一步实验的要求。
通过Western blot技术，分别对家蚕5龄起、5龄第3天和羽化第3天的各个组织器官进行检测。
结果发现，5龄起时，只在血液中检测到LP7；5龄3天时，血液中的LP7杂交信号强度明显增加，此外，在头、脂肪体和生殖腺中均检测到LP7，体壁和中肠中也有少量LP7存在，而丝腺和马氏管中没有检测到任何杂交信号。
同时，分析家蚕5龄3天组织芯片数据，结果表明Bmlp7基因在头、脂肪体、体壁和生殖腺中表达，其中头的表达量最高，在丝腺和马氏管中只有微量表达，而在中肠和血液中没有表达。
因此，我们推测5龄第3天血液中增加的LP7蛋白是由脂肪体中合成后转移而来的；中肠的微量LP7可能从血液中转移而来；丝腺和马氏管中Bmlp7基因的表达量较低，导致蛋白水平上检测不到。
对羽化第3天的组织器官进行检测，发现所有组织中均存在LP7，但此时该蛋白在雌性生殖腺中的信号强度远远高于其他组织。
LP7蛋白在家III西南大学硕士学位论文蚕大量组织器官中的广泛存在，暗示该蛋白在家蚕的生长发育过程中起着非常重要的作用。
同时，利用Western blot技术对家蚕部分时期的血液与生殖腺进行对比分析。
发现在血液中，从5龄第3天开始检测到明显LP7杂交信号，并且随着生长发育的进行其强度逐渐增加，到化蛹第1天达到最大值，而后逐渐降低，羽化第3天时杂交信号已非常微弱；而在生殖腺中，5龄第3天的LP7杂交信号非常微弱，而后逐渐增加，蛾期达到最大值。
这一结果表明生殖腺中的LP7蛋白可能是由血液中转移而来，并参与了卵母细胞的形成，推测该蛋白在家蚕胚胎发育过程中起着一定作用，可能是胚胎发育的重要能源物质。
检测化蛹第6天的雌雄生殖腺，结果显示雌雄生殖腺中均存在LP7，表明该蛋白在家蚕生殖发育过程中具有重要作用。
进一步分析家蚕芯片时期表达谱，结果表明30K蛋白基因Bmlp7的表达量从5龄后期急速增加，吐丝前后达到最大，此后急剧下降，从上簇后的一段时间到化蛹4天，其表达又有缓慢上升的趋势，化蛹5天后表达量有所降低，到化蛾时又上升。
而已有的研究报道表明该基因在脂肪体中的表达只持续到化蛹第5天。
因此，推测30K蛋白LP7从血液转移到生殖腺的同时，其他组织中也可能合成该蛋白。
此外，利用玻璃毛细管注射器，将黑曲霉菌（一种真菌）注射到化蛹3天的蚕蛹体内，分别提取注射24h和48h后的血液，通过Western blot技术检测血液中30K蛋白LP7的变化情况。
发现在注射黑曲霉菌的家蚕蛹期血液中，LP7杂交信号有微弱增强，而对照组中，LP7杂交信号趋于降低。
注射黑曲霉菌后，血液中的LP7有增加的趋势，这可能是由于黑曲霉菌导致家蚕体内Bmlp7基因mRNA的表达量增加，也可能是外来物质在某种程度上阻止了血液中LP7蛋白的转移，从而导致血液中LP7蛋白含量增加。
这一结果暗示30K蛋白LP7可能与家蚕免疫系统相关。
综上所述，本研究从家蚕血液中分离纯化到一种新的30K蛋白LP7。
并制备了LP7蛋白的多克隆抗体，结合30K蛋白基因Bmlp7的芯片数据分析结果，对该蛋白的功能进行了初步研究。
为进一步研究LP7蛋白以及其他30K蛋白的功能创造了条件，同时为家蚕免疫机制的研究提供了新的切入点。
关键词：家蚕30K蛋白LP7分离纯化功能初探IVAbstractIsolation, Purification and Functional analysis of LP7, one member of 30K family in silkworm,Bombyx moriRaising of Special Economic Animal Liu HongliSupervisor Professor Zhao PingSupervisor Professor Xia QingyouAbstract30K proteins，a family of low molecular lipoprotein, express highly during fifth instar larvae of silkworm, which are specific lipoprotein in silkworm.They are synthesized in the fat body then secreted to hemolymph. 30K proteins are not only the main storage protein for growth, but also the important energy material of the development of embryo. Till now, the function about 30K protein is scarce and the function about physiological is not clear completely.30K proteins have multi-members, whose comparability is so high that is difficult to separate and purify. At present, 4 members of 30K proteins have been separated and purified sucessfully. How many kinds of 30K protein need to further study. After the complete of silkworm genome, we have predicted 10 genes of 30K family by utilizing the database. By analysis of the data, we found that the amino acid numbers encoded by those genes are around 246-271. The theoretical pI of them are between 6.1-8.4 and the molecular weight of them are between 28kD-31kD. What’s more, the similarity of the amino acid sequences is above 60%. These information offered important reference for research of 30K protein. Based on the result, we started purification of 30K protein, obtained a novel protein, and carried on further analysis and research.Considering the difference of the molecular weight and theoretical pI of the 30K proteins, we have designed the purified experiment procedure and experiment condition of separating. By Ammonium sulfate precipitation, and three separate technologies (cation ion-exchange chromatography, anion ion-exchange chromatography and hydrophobic chromatography), we separate the proteins of the hemolymph of silkworm sucessfully and got a single strip of 30K protein. By analysis using Assist matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), the single signal peak of this protein sample is obtained. It was proved that we had been succeeded in getting a single member of 30K protein in this research. Meanwhile, we got the PMF(peptide mass fingerprint map) of this protein and utilized GPMAW(General Protein/Mass Analysis for Windows) software to analyze in the silkworm protein database. We found that this protein is encoded by 30KIII西南大学硕士学位论文gene pared the amino acid sequences of this protein with 30K protein reported, We found this protein is a new protein of 30K protein LP7.Through polyclone antibody preparation, we obtained the antibody of LP7. Firstly, we regarded 30K protein LP7 as the antigen and injected it to the rabbit and carried on the immune program. Then, gathered the blood from the arterial, thus succeeded in getting antiserum. Utilized the saturation solution of ammonium sulfate to purify the antibody in antiserum, we removed a large number of impurity and other protein. So we succeed in getting the antibody of 30K protein LP7 which can meet the requirement of next experiment.By Western blot, we have investigated the 30K protein LP7 in every organization of some periods of silkworm. The result showed that in the 3th day of the fifth instar larvae, LP7 was detected in the hemolymph, head, fat body and gonad, and the level in the hemolymph is the highest.In addition, LP7 appeared faintly in skin and midgut, but never detected in the silk gland. At the same time, we analyzed the Gene Chip, and the result showed that gene Bmlp7 was expressed in head, fat body, skin and gonad。