杂交技术
细胞杂交技术
细胞杂交技术
植物体细胞杂交技术的原理：
原理是利用细胞膜具有一定的流动性和植物细胞的全能性进行育种。
植物体细胞杂交是指将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。
杂交的原理：
植物体细胞杂交首先要使原生质体融合形成杂种细胞;其次要把杂种细胞经过植物组织培养技术培育成杂种植株。
细胞融合的原理是细胞膜具有一定的流动性，植物组织培养的原理是植物细胞的全能性。
因此，植物体细胞杂交的原理是：利用细胞膜具有一定的流动性和植物细胞的全能性进行育种。
简述杂交制种技术
简述杂交制种技术
1 杂交制种技术
杂交制种技术是修饰种子‘杂交’后生产种子，而生产出的新种子具有创新型的基因组成，能够产生更加优异的作物杂交品种。
是现代农业革命中应用较为广泛的一项科技，它的出现促进了作物的良种选育，使一些优良品种产量大大提高，带动了世界粮食产量的质量及数量的突飞猛进。
杂交制种技术的主要过程是先将不同的（杂交）作物结合起来，再进行封锁，最后进行育种，整个过程需要精确测量，严格控制，在制种过程中需要分析现有样本，了解各种基因的开放程度，以筛选出最符合条件的育种株系。
传统的育种方法是通过比较和克隆植物，而非遗传学和生物学原理，使得效率不高。
杂交制种技术采用更加准确的实验原理，以及先进的育种工具，在大大缩短了育种时间的基础上还能够保证育种的精准性和质量。
同时，杂交育种技术大大提高了作物的抗病扰能力和抗逆性，增加了种子的可持续性，减少了农民经营成本。
从现在的状况来看，杂交制种技术在农业中发挥着重要作用，在满足人类不断增长的食物需求方面具有无可比拟的重要意义，是解决人们生活中十分重要的问题。
杂交育种的技术流程
杂交育种的技术流程杂交育种是一种通过人工控制植物的交配，以获得更好的品种的育种方法。
它是现代农业中最重要的技术之一，可以提高作物的产量、抗病性、适应性等方面的性状。
下面我们来了解一下杂交育种的技术流程。
第一步：选取亲本杂交育种的第一步是选取亲本。
亲本是指用于交配的两个植株，一般分为母本和父本。
选取亲本的原则是要选择具有优良性状的植株，如高产、抗病、适应性强等。
同时，还要注意亲本之间的亲缘关系，避免近亲交配。
第二步：控制交配选好亲本后，就需要控制它们的交配。
一般来说，杂交育种有两种方法：人工授粉和自然杂交。
人工授粉是指将花粉从一个植株的花朵上取下，然后用刷子或者其他工具将花粉涂到另一个植株的花朵上。
自然杂交则是让植株在自然环境下进行交配。
第三步：筛选后代交配完成后，就需要筛选后代。
筛选的目的是找出具有优良性状的后代，同时排除不良性状的后代。
筛选的方法有很多种，如观察植株的生长情况、果实的大小、产量等。
同时，还可以通过分子标记技术等方法进行筛选。
第四步：选优留种筛选出优良后代后，就需要选优留种。
选优留种是指从后代中选出最好的植株，作为下一代的亲本。
选优留种的原则是要选择具有优良性状的植株，同时要注意亲缘关系，避免近亲交配。
第五步：繁殖新品种选好优良的亲本后，就可以进行新品种的繁殖。
繁殖的方法有很多种，如种子繁殖、组织培养等。
种子繁殖是指将优良的植株的种子进行繁殖，组织培养则是将植株的组织进行培养，以获得更多的植株。
杂交育种是一种通过人工控制植物的交配，以获得更好的品种的育种方法。
它的技术流程包括选取亲本、控制交配、筛选后代、选优留种和繁殖新品种等步骤。
通过这些步骤，可以获得更好的作物品种，提高农业生产的效益。
《杂交技术》课件
3
杂种优势的利用需要合理配置亲本，选择适当的 杂交方式，并对后代进行选择和培育。
03
CHAPTER
杂交技术的操作流程
选择亲本
总结词
选择亲本是非常关键的一步，直接影响到杂交后代的表现。
详细描述
在选择亲本时，需要考虑其遗传背景、生长表现、抗逆性、适应性等多个因素，以确保杂交后代能够 继承亲本的优良性状。同时，还需要注意亲本的健康状况和种质纯度，避免近亲繁殖和遗传疾病的发 生。
20世纪中叶以来，随着分子生物学和基因工程的快速发展，杂交技术得到了更广泛的应用和深入的研究 。
杂交技术的应用领域
农业领域
通过杂交技术培育高产、优 质、抗逆性强的农作物新品 种，提高农业生产效率和农 产品质量。
林业领域
利用杂交技术改良林木品种 ，提高木材产量和品质，同 时增强林木的抗逆性和适应 性。
CHAPTER
杂交技术在农业上的应用
提高作物产量
杂交技术通过优化作 物的遗传特性，提高 其产量潜力。
杂交后代经过适当的 育种和栽培管理，能 够实现比传统品种更 高的产量。
通过选择具有高产潜 力的亲本进行杂交， 可以获得具有更高产 量的后代。
改良作物品质
杂交技术可以改善作物的品质特 性，如口感、营养价值、加工性
加强安全管理
制定严格的法律法规和技术标准，确保杂交技术的安全应用和生态环境的保护。
加强基础研究
深入研究杂交作物的遗传机制和生态影响，为技术的优化和改进提供科学依据。
提高公众认知
加强杂交技术的科普宣传，提高公众对技术的理解和接受度。
促进技术推广
加强技术培训和交流，促进杂交技术在基层的推广和应用。
05
通过增强作物的抗逆性，可以降低生产风险，提高作物的稳定性和产量，减少环境 对生产的负面影响。
dna分子杂交技术
dna分子杂交技术
DNA杂交技术是一种用于比较两种不同DNA序列的技术。
它可以用于比较两个物种的DNA序列，以确定它们之间的相似性，也可以用于比较同一物种的不同个体的DNA序列，以检测变异。
DNA杂交技术的基本原理是将两条不同的DNA序列混合在一起，然后用酶将它们分解。
酶会将这些DNA 序列分解成具有不同序列的片段，这些片段有可能是来自同一条DNA序列，也有可能来自另一条DNA序列。
这些片段称为杂交片段。
接下来，将杂交片段放入电泳管中，并通过电泳将它们分离开来。
电泳可以根据片段的长度和电荷差异将它们分离出来。
最后，可以使用紫外光测序器来确定分离出的片段的DNA序列。
DNA杂交技术对于研究物种相似性、检测自然变异和基因组学研究等方面都很有用。
这种技术可以快速准确地比较两个物种的DNA 序列，从而更好地了解它们之间的关系，也可以帮助科学家检测自然变异，从而为基因组学研究奠定基础。
总之，DNA杂交技术是一种非常有用的技术，它可以用来比较不同物种的DNA 序列，检测自然变异，以及进行基因组学研究。
它的准确性和效率使它成为研究和比较 DNA 序列的理想选择。
分子杂交技术名词解释
分子杂交技术名词解释
分子杂交技术（Molecular Hybridization）是一种用于研究DNA或RNA序列的方法。
它通过将DNA或RNA样本与一个已知序列的探针进行杂交，然后利用探针的标记来检测目标序列是否存在。
这种方法可以用于许多应用，例如基因定位、基因诊断和基因组分析等领域。
在分子杂交技术中，探针通常是一条短的DNA或RNA序列，它与目标序列互补匹配，并且可以带有一种标记，如荧光素或辐射性同位素，以便于检测。
通过将样本与探针进行杂交，可以形成一个稳定的DNA或RNA双链，这种双链可以通过多种方法进行检测，例如放射性测量或荧光显微镜观察。
分子杂交技术的一种常见的应用是Southern blotting，它可以用于检测特定的DNA序列。
在Southern blotting中，DNA样本首先通过电泳分离，并转移到膜上。
然后，与目标序列互补的DNA探针与膜上的DNA进行杂交，形成一个稳定的DNA双链，这可以通过标记的探针进行检测。
另一种常见的分子杂交技术是Northern blotting，它用于检测RNA序列。
在Northern blotting中，RNA样本首先通过电泳分离，并转移到膜上。
然后，与目标序列互补的RNA探针与膜上的RNA进行杂交，形成一个稳定的RNA双链，这可以通过标记的探针进行检测。
总之，分子杂交技术是一种广泛应用于生物学和医学领域的方法，它可以用于检测和分析DNA和RNA序列。
它的应用范围包括基因定位、基因诊断、基因组分析和疾病诊断等领域。
第六讲 杂交技术
分子杂交技术Molecular Hybridization第一节杂交的基本原理一、核酸分子杂交的基本原理与分类（一）核酸分子杂交的基本原理1、变性（denaturation）（1）定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成无规则线团，双链解链成为单链。
（2）.引起核酸变性的因素酸碱热变性剂（尿素）有机溶剂（乙醇）（3）、变性核酸的特点：粘度下降沉降速度增加浮力上升紫外吸收增加2、Tm,融解温度(Melting Temperature)：定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。
影响Tm的因素：（1）DNA碱基的组成G-C含量越多Tm值越高A-T含量越多Tm值越低（2）溶液的离子强度低离子强度Tm值越低高离子强度Tm值越高（3）pH值pH值5-9 Tm值变化不明显pH<4 pH>11 不利于氢键形成（4）变性剂干扰碱基堆积力和氢键的形成3、复性(Renaturation)变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。
影响复性速度的因素：DNA浓度DNA片段的大小DNA片段复杂性合适的复性温度适当的离子强度4、杂交定义两条来源不同，但具有互补序列的核酸，按碱基配对原则复性形成一个杂交体，这个过程即杂交，或称分子杂交。
分类DNA-DNADNA-RNARNA-RNA二、核酸探针（一）探针的概念探针（probe）指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被特殊方法所检测的分子。
例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。
基因探针指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同位素标记）的核苷酸链。
（二）探针种类和选择1.探针种类（1）基因组DNA探针为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。
（2）cDNA探针以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA 链。
（3）RNA探针以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。
杂交制种技术PPT课件
双交 （A×B）×（C×D） A/B//C/D
特点：
（1）要进行两次或两次以上的杂交，杂交的数量和后代 群体规模相对大。 （2）遗传基础复杂。
（3）分离早，分离时间长，类型多。
复交举例
目前在园林中广泛栽培的杂种香水月季， 就是通过复交培育成的。
月月红×香水玫瑰 ↓
波邦蔷薇 × 法国蔷薇 ↓
杂种波邦×月月红 ↓
一般配合力是指某一亲本材料与其他若干亲本 材料杂交后，杂种后代在某个性状上表现的平均 值。
平均值高，一般配合力就好。
二、杂交育种技术
（一）杂交技术 （二）杂交方式
（一）杂交技术
1.制定杂交计划 包括杂交组合数、具体杂交 组合、每个杂交组合的花数等。 2.选择杂交种株及花朵 选具有该亲本典型性 状、健壮无病、发育良好的植株作为杂交种 株。在入选种株上选健壮的花枝和花蕾进行 杂交，疏去过多的、没有进行杂交的花枝或 花蕾，以保证杂交种子生长充实饱满。
某个目标性状；在育种时，轮回亲本必须是适应性强、 丰产性好、综合性状优良，只存在个别缺点，经改良 后有继续推广前途的品种。而非轮回亲本作为被改良 性状的来源，必须具备轮回亲本需要改良的目标性状， 且遗传力强。
回交举例
（丰产感病）农大183 × 伊利亚能（抗条锈）
↓
F1×农大183
↓
B1×农大183
2.至少应选择当地的推广品种作亲本之一 应重视地方品种（适应性强、丰产性好）。
3.注意选用遗传差异性大的亲本 选用生态类型、亲缘关系有较大差异，或地理上
距离较远的品种进行杂交。要通过遗传分析，选用遗 传差异较大的亲本进行杂交。
4.选用遗传力强且一般配合力好的品种做亲本
在选用杂交亲本时，要在品种本身性状表现优 良的基础上，考虑其一般配合力以及主要目标性 状的遗传力。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
③洗液：将膜上未与DNA杂交的及非特异 性杂交的探针从膜上洗去的过程。由于非 特异性杂交的杂交体稳定性较低，解链温 度较低，而特异性杂交体由于稳定而保留 在滤膜上。 注意，洗膜液要换几次，要用几种不同的 洗膜液。离子强度逐渐降低，而洗膜温度 逐渐上升（室温～37℃～65℃）。即逐渐 增加洗膜的强度。逐渐减少离子强度，为 下一步反应（检测）做好准备。
尼龙膜质地坚韧，不易损坏，操作方便， 可 进行多次重复杂交。 在低离子强度条件下，也可与核酸牢固 结合，因此适用于电转印迹法。 缺点：由于结合力强，非特异性吸附较 多，杂交信号本底较高，应注意封闭。
⑵ 印迹方法
①斑点或狭缝印迹
②虹吸印迹法 ③电转印迹法 ④真空转移法
Southern印迹法 Northern印迹法
3．杂交信号的检测
⑴放射自显影：探针标记了放射性核 素，如32P、35S、125I或131I。 其具体方法是：在暗盒里将杂交后的滤 膜放在暗盒里的X光片上，盖上暗盒， 置－70℃曝光一定时间。 经显影、定影后，可出现黑色曝光斑点， 根据斑点密度及大小，判断被检测核酸 是否有与探针相应序列及大小。
1.印迹技术
印迹技术是指将待测核酸分子转移并结 合到一定的固相支持物上的方法。 印迹技术主要包括两个关键因素： 选择良好的固相支持物； 有效的转移方法。
⑴ 固相支持物的选择
①具有良好的机械性能，如柔软性好，韧性 强，以便操作时不易损坏； ②具有较强的结合核酸分子的能力；结合的 稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程， 而不会脱落或脱落极少； ③结合后应不影响核酸分子与探针分子的杂 交反应； ④非特异性吸附较少，即使有，在洗膜时也 易被洗脱掉。
Tm值的影响因素：
①DNA的碱基组成，Tm值主要受G：C碱基 对数量多少的影响，有一个经验公式为： Tm＝(G+C)%×0.41＋69.3 ②溶液的离子强度，DNA链上的磷酸基团 带负电荷，在无盐的水中，DNA在室温条 件下就会变性，而加入盐后，正电荷离子 可以封闭磷酸基团的负电荷，使DNA双链 的稳定性增加，Tm值亦会升高。
2.探针的种类、选择及特点 种类：基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探
针、寡核苷酸探针
选择：寡核苷酸探针是指人工合成的短链核苷
酸片段，并带有标记物
特点：人为控制，杂交时间短，特异性高，可 以用于点突变检测；缺点是灵敏度低
设计寡核苷酸探针遵循的原则：
①探针长度：一般要求10～50bP。过短 则特异性降低，过长，则合成困难、杂交 时间延长，亦会出现非特异性杂交
第三节 核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术的基本原理
按碱基互补配对原则，具有一定同源性 的两条核苷酸单链在适宜条件下形成双链 杂交过程具有高度特异性（即使有一个 碱基不配对都不能杂交）。 通过检测探针是否发生了杂交及杂交量 多少，从而对待测核苷酸序列进行定性和 定量分析。 核酸分子杂交的成败，关键在于探针。
Yz 小时/Cot1/2＝ 5×10X Co＝单链DNA浓度，t1/2＝反应一半的时间 Y为探针DNA的复杂性，即片段大小（Kb） Z为杂交体系的体积(ml)。 经验杂交时间8～16h，过夜。
×2
⑥减少或抑制非特性杂交。一般在杂交前 先进行预杂交，以便将非特异性DNA位点封闭， 同时也将膜上非特异性吸附位点封闭。 ⑦促进杂交反应速度：硫酸葡聚糖 (dextran sulfate,Mw 500000)能促进DNA 链 间的缔合，其微粒表面可吸附DNA探针分子， 从而使DNA接触面积增大，有利于杂交反应， 促进杂交反应速度。 如10％硫酸葡聚糖可使杂交反应速度提 高10～100倍。
但RNA变性方法与DNA不同: 不能用碱变性，
因为碱导致RNA水解。
RNA的变性常与电泳同时进行，常有3种方法:
• • • 聚乙醛和二甲基亚砜变性电泳 甲醛变性凝胶电泳 甲基氧化汞电泳
RNA经变性电泳后，一般可进行转移 （印迹），其印迹方法与Southern方法 相同。
对含甲醛的凝胶，可用DEPC预处理水 漂洗，以去除甲醛。 固定方法，常用真空烘烤（80℃）2h
尼龙膜
•未经特殊处理的尼龙膜，叫普通尼龙膜。经 过了正电荷基团修饰的，又叫特殊尼龙膜。 •特殊尼龙膜带有正电荷，对核酸的结合力要 比硝酸纤维素膜强好多倍。 •经短波紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱 基可与膜上的带正电荷的氨基相互交联。因此 特别适用于小分子核酸片段的杂交。 •碱处理也可使核酸牢固地结合在尼龙膜上， 特别适用于菌落原位印迹法。
2．杂交（固－液相杂交）技术
DNA分子杂交实际上是双链DNA的变性 和具有同源序列的两条单链的复性过程。 RNA 分 子 杂 交 也 涉 及 变 性 和 复 性 过 程 （这种变性是单链RNA分子内部发夹结 构打开过程）。
因此以DNA分子杂交为例进行介绍。
（1）变性 即打开DNA双螺旋结构，变成 单链DNA的过程。 方法有：加热变性 有机溶剂变性 高浓度盐变性
（4）杂交操作步骤
①预杂交：将膜放在预杂液中，即不放 探针，预杂交液中主要含Dehardt液和鲑 鱼精DNA，主要是封闭膜上非特异性的杂 交位点。
②杂交：杂交液中除含封闭物质外，还 含有10％硫酸葡聚糖和探针。探针如果 是双链DNA，则需要进行变性处理。温度 68℃（不含甲酰胺），42℃（含50％甲 酰胺），杂交时间：8～16h过夜。
碱变性等
常用方法是加热变性和碱变性。
DNA变性时，在260nm处的紫外吸光度 增加，这种现象又称增色效应。 熔解温度（melting temperature Tm值） 当增色效应达到最大值的50%时温度 Tm值表明DNA溶液中一半的DNA双链 已解离为单链 Tm值反映了DNA变性的程度和难易， Tm值越大，变性越难 大多数DNA的Tm值在85～90℃左右。
慢和洗膜时去掉非特异杂交是至关重要的
因素。
一般认为杂交温度为：68℃（不含甲酰 胺）；当含50％甲酰胺时，在42℃进行 杂交。 洗膜温度一般认为55℃～65℃。 对于寡核苷酸探针的杂交温度，应根据 下列公式推算： Tm=4℃×GC＋2℃×AT 杂交温度一般比Tm值低5℃，55℃（20bp)
⑤杂交时间：一般应为Cot1/2的1～3倍。
③pH值，pH值在5～9之间范围内，Tm 值变化不明显，当pH值大于11.3时，所 有氢键均被破坏，DNA完全变性。这就 是碱变性的原理。 ④变性剂：变性剂可以干扰碱堆积力和 氢键的形成，因此可以降低Tm值。常用 的变性剂是甲酰胺和脲。
通常用50％的甲酰胺使Tm值降低30℃
（2）复性 单链核酸重新缔合成双链的过程。
3.探针的标记物与标记
一种理想的标记物应具备的特性：
①高度灵敏性； ②标记物不影响探针的碱基配对特异性、 杂交特异性、杂交稳定性及Tm值； ③高度特异性（发生杂交能检测到，否 则检测不到）；
3.探针的标记物与标记
④较高化学稳定性，保存时间较长； ⑤标记方法及检测方法简单； ⑥对人体无损伤，对环境无污染； ⑦价格低廉。
④离子强度：离子强度过低，不利于复性
⑤pH值：pH值在5～9范围内，不影响复性
速度，过低或过高则影响。 ⑥DNA分子的复杂性：DNA总量一定时，基 因组越复杂，其中特定顺序的拷贝数就越 少，互补顺序的浓度就越低，因而复性反 应速度越慢。
（3）杂交体系的建立要考虑以下几因素
①DNA浓度：DNA浓度越高，复性速度越 快。加入足够的DNA并尽量减少杂交的体积， 一般以每平方厘米滤膜面积加50～100μ l 杂交液为宜。
液相杂交
膜上印迹杂交的基本操作流程
用印迹技术将凝胶电泳分离的核酸片段转 移到特异的固相支持物上（转移后的核酸片 段将保持其原来的相对位置不变）。 再用标记的核酸探针与固相支持物上的核 酸片段进行杂交。 最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过 放射自显影等检测方法显示标记的探针的位 置及量的多少。
(一)探针的概念、种类及其选择、探针的标记
1.探针的概念：
•在化学及生物学意义上的探针(Probe)，是指 能与特定的靶分子发生特异性相互作用的分子， 并可被特殊的方法所探知 •核酸分子探针则是指带有标记物，能与互补核 酸序列退火杂交的特定已知核酸片段。 •探针的设计和选择影响核酸杂交实验结果的高 度特异性、正确性。
Southern印迹法
a.DNA分子经限制内切酶酶切。酶切变成 合适长度的DNA片段。一般理想是0.5～ 10Kb，因片段大小直接影响转移效率。 b.在琼脂糖凝胶中进行电泳。分离DNA片
段 ， 与 DNA 分 子 量 标 准 参 照 物 比 较
（Marker）, EB染色后观察DNA片段大小
c. 将 凝 胶 浸 泡 于 适 量 的 变 性 液 中 (1.5mol/L Nacl和0.5mol/L NaOH)室温1h，其目的使DNA 变性，即将双链DNA变成单链DNA。如果DNA片 段较大(大于15kb)，可在变性前，用稀盐酸 （0.2mol/L）处理10min,因为片段的大小直接 影响转移率速。小于15Kb，转移1h。
目前常用的固相支持物
硝酸纤维素滤膜 尼龙膜 化学活化膜
滤纸
硝酸纤维素滤膜
具有较强的吸附结合单链DNA和RNA的能力 特 别 是 在 高 盐 浓 度 ， 其 结 合 力 可 达 80μg/cm2～100μg/cm2。 这种结合主要靠疏水作用。
非特异性吸附核酸（探针）能力较弱，因此
杂交信号本底值较低。
d.印迹(转移)方法：虹吸印迹法，电转印迹法 和真空印迹法。不论采用哪种方法，均是将 DNA从凝胶转移到固相支持物上
e.固定，对于硝酸纤维膜，可真空下80℃烘烤 2h(亦可无真空)，对尼龙膜还可用短波紫外线 （波长254nm）照射几分钟理与Southern印迹相同
② G：C碱基对含量应占40～60％；过 少，则不易杂交，或杂交双链不稳定；过 多，则会产生非特异性杂交
③探针内部的互补碱基对不应大于4bP， 否则会形成探针内部的“发夹”结构。