色谱分析平面色谱法
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展开距离 随行标准及点样次序 显色均匀度及稳定性
第四节 纸色谱法
以纸做载体的色谱法，分离原理属于液-液分配色谱法，操作 与薄层法类似。 选纸 →点样 → 展开 →显色(定性)/洗脱(定量) ✓ 固定相：纸纤维吸附的水 ✓ 流动相：与水不互溶的有机溶剂（水饱和正丁醇） ✓ 分离机制：同液-液分配色谱 ✓ 定性参数： Rf 原点 原到 点组 到分 溶斑 剂点 前 心质 沿 的量 的 距中 距 离 dLs离
吸附剂与展开剂的选择
▪ 吸附剂的选择：根据被测物极性和吸附剂的吸附能力
被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂
▪ 展开剂的选择：根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性
图18－3
三、操作方法
（一）薄层板的制备 定性分析——窄条 定量分析——10×20cm
硅胶G——自含粘和剂 硅胶H——不含粘和剂，铺板时另加入CMC 硅胶FH254——含荧光剂，254nm紫外光照发绿光 硅胶FH365——含荧光剂，365nm紫外光照发光
➢ 讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分→易保留，Rf 小（流动相极性↑， Rf ↑） 非极性组分→易流出，Rf大（流动相极性↑，Rf ↓）
本章小结
• 掌握: 平面色谱法的基本分离原理及相关参数的计算（比移 值、相对比移值，分离度）；薄层色谱法的特点；吸附薄层 色谱中吸附剂和展开剂的选择原则。
ds2
图18－1
Rf1
d s1 L
L
ds1
Rf2
d s2 L
2. 相对比移值Ris
RisR Rff（ （si） ）原 原点 点到 到参 组考 分物 斑 中 心 斑 点 心 的 点 质 的 距 质 量 距 离 ddsi量 中 离
✓ 讨论 • 参考物与被测组分在完全相同条件下展开
可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性； • 参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 • 相对比移值Ris与组分、参考物性质及色谱条件有关，范
Rapid determination of thermo-stability of phospholipids by TLC
1.Thin-layer chromatography of standard PL samples Fig.1
Description: The thermo-stability of phospholipids and lysophospholipids was determined by one dimensional thin-layer chromatography (TLC). A chloroformmethanol-28% aqueous ammonia solvent system (65:35:8, v/v) provided clear separation of major phospholipids (PL) and their lyso forms. The 5% (w/v) dodecamolybdophosphoric acid solution in ethanol was used as spray reagent. The thermo stability of phospholipids was evaluated by compare the spots density and area of PL samples with varying heat treatment.
毛细作用，展开剂（流动相）上行。
-----吸附色谱
▪ 薄层电泳法：荷电组分样品负载于惰性支持介质（纸、纤维素、聚
丙烯酰胺凝胶等），在电场作用下进行分离。
二、平面色谱法的基本流程
• 确定样品的预处理方法 • 选择吸附剂和展开剂 • 制备层析用薄板 Baidu Nhomakorabea 点样 • 层析分离 • 显色 • 定性或定量分析 • 分析结果，给出结论
（5μm或10μm），用喷雾法制成高效薄层板。常用的有硅胶、氧 化铝、纤维素和化学键合相预制薄层板。
六、薄层扫描法
• 薄层扫描法是用一定强度光束照射薄层上的斑点，用仪器测量照射前 后光束强度的变化，从而求得物质含量的方法。
• 检测方法 紫外-可见吸收测定法和荧光测定法 • 测量方法 投射法和反射法 • 扫描方式 单波长和双波长 • 影响薄层扫描定量的因素 均匀度
概述
1．TLC定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上， 形成薄层而进行色谱分离和分析的方法
2．操作过程： 铺板 →活化 →点样 → 展开 →定位(定性)/洗脱(定量)
3．分离机制：吸附* 、分配*、离子交换、空间排阻 4．特点；分离能力强、灵敏度高、展开时间较短、显色
方便。 5．应用：药物杂质检查、纯度测定、定性及定量等。
二、吸附剂与展开剂
(一）吸附剂 1. 硅胶：硅胶H------不含黏合剂
硅胶G------含煅石膏（13-15%） 硅胶F254--- 既含煅石膏，又含荧光指示剂 2. 氧化铝：可分为中性（pH7.5)、碱性（pH9.0）和酸性（pH4.0）
（二）展开剂 常用的有： 石油醚<环己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<乙醚<氯仿< 乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<酸<水
（三）容量因子k’与比移值Rf的关系
• 容量因子： k’=ts/tm
ts 、 tm 分别为组分在固定相和展开剂中的保留时间
保留值的定义：
Rf
tm ts tm
Rf
1 1 k'
（四）分离参数
1、分离度(resolution; R) 两相邻斑点中心的距 离与两斑点平均宽度的比值 R=2(ds2-ds1)/(W1+W2) =2d/(W1+W2)
b2
点样
s
b1
b2
s
b1
第一次展开
b2
s
b1
第二次展开
定量分析
• 1. 目视比较半定量 • 2. 测量斑点面积 • 3. 洗脱法 • 4. 薄层扫描法
五、高效薄层色谱法
• 高效薄层色谱法（high performance thin layer chromatography； HPTLC) 所用的吸附剂颗粒很小
（二）点样：用毛细管或微量注射器，几微升，2~4mm （三）展开：见续页 （四）显色方法：日光、紫外光(254、365nm)显色剂等
展开方式
连续展开：层析缸，预饱和，防止边缘效应浸入展开剂深度 0.51.0cm，展开至整板3/4距离,标记。
前沿
原点
2.0cm
123
•••
1.5-2.0cm
1 , 2样品 3 标准品
• 熟悉: 薄层色谱法的主要操作步骤。 • 了解: 薄层扫描法的应用及技术；纸色谱法的分离原理及实
验条件。
参考书及文献
1.《分析化学》（第四版）下册，孙毓庆主编，人民卫生出版社 2．周同惠等．纸色谱和薄层色谱。分析化学丛书．第三卷．第五册．北京：
科学出版社，1989． 3．林珍安等译．高效薄层色谱．上海：上海科技出版社，1984． 4. 孙毓庆主编．薄层扫描法及其在药物分析中的应用．北京，人民卫生出版
lnc，1990。 7. Sherma J and Fried B．Handbook of Thin-Layer Chromatography. New York：
Marcel Dekker lnc，1991.
谢谢观赏
围可以大于或小于1
（二）面效参数
与展开剂的速率常数、组分在展开剂中的扩散系数、吸附剂的平均 粒径及其粒度分布等因素有关。
• 1、理论塔板数 N=16(ds/W)2 ds:原点到斑点中心的距离 W：组分斑点的纵向宽度 • 2、塔板高度 H=ds/N=(Rf L)/N ds：原点到展开剂前沿的距离 N越大，H越小。
展开方式
• 二维展开——在两个垂直的方向上进行展开。将样品 点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂， 再将薄层板以与原展开方向成90 的方向进行展开。 2
1 原点
四、定性和定量分析
定性分析
• 利用保留值 • 测定Rf值 • 测定相对Rf值，即Ris值。 • 利用二维色谱（改变色谱条件，比较Rf值是否一致）
社，1990． 5. Fried Band Sherma J．Thin-layer Chromatography．New York：Marcel Dekker
lnc，1982． 6. Grinberg N．Modern Thin-layer Chromatography．New York：Marcel Dekker
一、主要类型
• （一）吸附薄层色谱
固定相为吸附剂的薄层色谱。利用吸附剂对不同组分的吸附能 力差异而实现分离.经过吸附、解吸、再吸附、再解吸……最后混 合物得到分离.K大，Rf值小，移动慢；K小，Rf大，移动快。
• （二）分配薄层色谱
固定相为液体，吸留在载体上的薄层色谱。利用被分离组分在固 定相与流动相中的分配系数不同而被分离。常用的是反相薄层色 谱法，固定相是烷基化学键合相，展开剂是水及与水相溶的有机 溶剂。
一般薄层板的分离数为 7~10，高效薄层板可达10~20。SN是衡量分 离容量的重要参数。
第二节 薄层色谱法
Thin Layer chromatography TLC
• 一、主要类型 • 二、吸附剂与展开剂 • 三、操作方法 • 四、定性与定量分析 • 五、高效薄层色谱法 • 六、薄层扫描法 • 七、应用实例
第五章 平面色谱法
• 定义：平面色谱法(plane chromatography)是在平面上 进行分离的一种色谱方法。
• 一、平面色谱法的分类和原理
分类
▪ 纸色谱法：滤纸为载体，纤维素的羟基与水结合形成液-液分配色谱 固定相，展开剂由于毛细作用沿滤纸向上运动。---分配色谱
▪ 薄层色谱法：将吸附材料均匀固定在载板上，由于吸附剂颗粒间的
• ds1 、ds2 :分别为原点至两半斑点中心的 距离， W1、W2斑点的宽度。
2.分离数(separation number; SN)
定义：相邻斑点分离度为1.177时，在Rf=0(原点)到Rf=1(溶剂前沿)之 间能容纳的色谱斑点数。
SN L 1
W(1)o W(1)1
2
2
W(1/2)0, W(1/2)1为实验测得的某组分色谱峰的半峰宽对ds作图外推至在原点处 和溶剂前沿处的半峰宽。
三、平面色谱法参数
（一）定性参数 1. 动比相移移值动Rf距(r离eta之rd比ation factor; Rf) 溶质移动的距离与流
Rf 原点原到点组到分溶斑剂点前质 心 沿量 的 的中 距 距离 离dLs
Rf范围：
0< Rf <1 Rf = 0.2~0.8（常用） Rf = 0.3~0.5（最佳）
第四节 纸色谱法
以纸做载体的色谱法，分离原理属于液-液分配色谱法，操作 与薄层法类似。 选纸 →点样 → 展开 →显色(定性)/洗脱(定量) ✓ 固定相：纸纤维吸附的水 ✓ 流动相：与水不互溶的有机溶剂（水饱和正丁醇） ✓ 分离机制：同液-液分配色谱 ✓ 定性参数： Rf 原点 原到 点组 到分 溶斑 剂点 前 心质 沿 的量 的 距中 距 离 dLs离
吸附剂与展开剂的选择
▪ 吸附剂的选择：根据被测物极性和吸附剂的吸附能力
被测物极性强——弱极性吸附剂 被测物极性弱——强极性吸附剂
▪ 展开剂的选择：根据被测组分、吸附剂和展开剂本身的极性
图18－3
三、操作方法
（一）薄层板的制备 定性分析——窄条 定量分析——10×20cm
硅胶G——自含粘和剂 硅胶H——不含粘和剂，铺板时另加入CMC 硅胶FH254——含荧光剂，254nm紫外光照发绿光 硅胶FH365——含荧光剂，365nm紫外光照发光
➢ 讨论：Rf与组分性质、流动相及溶解度有关 极性组分→易保留，Rf 小（流动相极性↑， Rf ↑） 非极性组分→易流出，Rf大（流动相极性↑，Rf ↓）
本章小结
• 掌握: 平面色谱法的基本分离原理及相关参数的计算（比移 值、相对比移值，分离度）；薄层色谱法的特点；吸附薄层 色谱中吸附剂和展开剂的选择原则。
ds2
图18－1
Rf1
d s1 L
L
ds1
Rf2
d s2 L
2. 相对比移值Ris
RisR Rff（ （si） ）原 原点 点到 到参 组考 分物 斑 中 心 斑 点 心 的 点 质 的 距 质 量 距 离 ddsi量 中 离
✓ 讨论 • 参考物与被测组分在完全相同条件下展开
可以消除系统误差，大大提高重现性和可靠性； • 参考物可以是后加入纯物质，也可是样品中已知组分 • 相对比移值Ris与组分、参考物性质及色谱条件有关，范
Rapid determination of thermo-stability of phospholipids by TLC
1.Thin-layer chromatography of standard PL samples Fig.1
Description: The thermo-stability of phospholipids and lysophospholipids was determined by one dimensional thin-layer chromatography (TLC). A chloroformmethanol-28% aqueous ammonia solvent system (65:35:8, v/v) provided clear separation of major phospholipids (PL) and their lyso forms. The 5% (w/v) dodecamolybdophosphoric acid solution in ethanol was used as spray reagent. The thermo stability of phospholipids was evaluated by compare the spots density and area of PL samples with varying heat treatment.
毛细作用，展开剂（流动相）上行。
-----吸附色谱
▪ 薄层电泳法：荷电组分样品负载于惰性支持介质（纸、纤维素、聚
丙烯酰胺凝胶等），在电场作用下进行分离。
二、平面色谱法的基本流程
• 确定样品的预处理方法 • 选择吸附剂和展开剂 • 制备层析用薄板 Baidu Nhomakorabea 点样 • 层析分离 • 显色 • 定性或定量分析 • 分析结果，给出结论
（5μm或10μm），用喷雾法制成高效薄层板。常用的有硅胶、氧 化铝、纤维素和化学键合相预制薄层板。
六、薄层扫描法
• 薄层扫描法是用一定强度光束照射薄层上的斑点，用仪器测量照射前 后光束强度的变化，从而求得物质含量的方法。
• 检测方法 紫外-可见吸收测定法和荧光测定法 • 测量方法 投射法和反射法 • 扫描方式 单波长和双波长 • 影响薄层扫描定量的因素 均匀度
概述
1．TLC定义：将固定相均匀涂布在表面光滑的平板上， 形成薄层而进行色谱分离和分析的方法
2．操作过程： 铺板 →活化 →点样 → 展开 →定位(定性)/洗脱(定量)
3．分离机制：吸附* 、分配*、离子交换、空间排阻 4．特点；分离能力强、灵敏度高、展开时间较短、显色
方便。 5．应用：药物杂质检查、纯度测定、定性及定量等。
二、吸附剂与展开剂
(一）吸附剂 1. 硅胶：硅胶H------不含黏合剂
硅胶G------含煅石膏（13-15%） 硅胶F254--- 既含煅石膏，又含荧光指示剂 2. 氧化铝：可分为中性（pH7.5)、碱性（pH9.0）和酸性（pH4.0）
（二）展开剂 常用的有： 石油醚<环己烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烷<苯<甲苯<二氯甲烷<乙醚<氯仿< 乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<吡啶<酸<水
（三）容量因子k’与比移值Rf的关系
• 容量因子： k’=ts/tm
ts 、 tm 分别为组分在固定相和展开剂中的保留时间
保留值的定义：
Rf
tm ts tm
Rf
1 1 k'
（四）分离参数
1、分离度(resolution; R) 两相邻斑点中心的距 离与两斑点平均宽度的比值 R=2(ds2-ds1)/(W1+W2) =2d/(W1+W2)
b2
点样
s
b1
b2
s
b1
第一次展开
b2
s
b1
第二次展开
定量分析
• 1. 目视比较半定量 • 2. 测量斑点面积 • 3. 洗脱法 • 4. 薄层扫描法
五、高效薄层色谱法
• 高效薄层色谱法（high performance thin layer chromatography； HPTLC) 所用的吸附剂颗粒很小
（二）点样：用毛细管或微量注射器，几微升，2~4mm （三）展开：见续页 （四）显色方法：日光、紫外光(254、365nm)显色剂等
展开方式
连续展开：层析缸，预饱和，防止边缘效应浸入展开剂深度 0.51.0cm，展开至整板3/4距离,标记。
前沿
原点
2.0cm
123
•••
1.5-2.0cm
1 , 2样品 3 标准品
• 熟悉: 薄层色谱法的主要操作步骤。 • 了解: 薄层扫描法的应用及技术；纸色谱法的分离原理及实
验条件。
参考书及文献
1.《分析化学》（第四版）下册，孙毓庆主编，人民卫生出版社 2．周同惠等．纸色谱和薄层色谱。分析化学丛书．第三卷．第五册．北京：
科学出版社，1989． 3．林珍安等译．高效薄层色谱．上海：上海科技出版社，1984． 4. 孙毓庆主编．薄层扫描法及其在药物分析中的应用．北京，人民卫生出版
lnc，1990。 7. Sherma J and Fried B．Handbook of Thin-Layer Chromatography. New York：
Marcel Dekker lnc，1991.
谢谢观赏
围可以大于或小于1
（二）面效参数
与展开剂的速率常数、组分在展开剂中的扩散系数、吸附剂的平均 粒径及其粒度分布等因素有关。
• 1、理论塔板数 N=16(ds/W)2 ds:原点到斑点中心的距离 W：组分斑点的纵向宽度 • 2、塔板高度 H=ds/N=(Rf L)/N ds：原点到展开剂前沿的距离 N越大，H越小。
展开方式
• 二维展开——在两个垂直的方向上进行展开。将样品 点在薄层板的一个角上，展开适当距离后，挥干溶剂， 再将薄层板以与原展开方向成90 的方向进行展开。 2
1 原点
四、定性和定量分析
定性分析
• 利用保留值 • 测定Rf值 • 测定相对Rf值，即Ris值。 • 利用二维色谱（改变色谱条件，比较Rf值是否一致）
社，1990． 5. Fried Band Sherma J．Thin-layer Chromatography．New York：Marcel Dekker
lnc，1982． 6. Grinberg N．Modern Thin-layer Chromatography．New York：Marcel Dekker
一、主要类型
• （一）吸附薄层色谱
固定相为吸附剂的薄层色谱。利用吸附剂对不同组分的吸附能 力差异而实现分离.经过吸附、解吸、再吸附、再解吸……最后混 合物得到分离.K大，Rf值小，移动慢；K小，Rf大，移动快。
• （二）分配薄层色谱
固定相为液体，吸留在载体上的薄层色谱。利用被分离组分在固 定相与流动相中的分配系数不同而被分离。常用的是反相薄层色 谱法，固定相是烷基化学键合相，展开剂是水及与水相溶的有机 溶剂。
一般薄层板的分离数为 7~10，高效薄层板可达10~20。SN是衡量分 离容量的重要参数。
第二节 薄层色谱法
Thin Layer chromatography TLC
• 一、主要类型 • 二、吸附剂与展开剂 • 三、操作方法 • 四、定性与定量分析 • 五、高效薄层色谱法 • 六、薄层扫描法 • 七、应用实例
第五章 平面色谱法
• 定义：平面色谱法(plane chromatography)是在平面上 进行分离的一种色谱方法。
• 一、平面色谱法的分类和原理
分类
▪ 纸色谱法：滤纸为载体，纤维素的羟基与水结合形成液-液分配色谱 固定相，展开剂由于毛细作用沿滤纸向上运动。---分配色谱
▪ 薄层色谱法：将吸附材料均匀固定在载板上，由于吸附剂颗粒间的
• ds1 、ds2 :分别为原点至两半斑点中心的 距离， W1、W2斑点的宽度。
2.分离数(separation number; SN)
定义：相邻斑点分离度为1.177时，在Rf=0(原点)到Rf=1(溶剂前沿)之 间能容纳的色谱斑点数。
SN L 1
W(1)o W(1)1
2
2
W(1/2)0, W(1/2)1为实验测得的某组分色谱峰的半峰宽对ds作图外推至在原点处 和溶剂前沿处的半峰宽。
三、平面色谱法参数
（一）定性参数 1. 动比相移移值动Rf距(r离eta之rd比ation factor; Rf) 溶质移动的距离与流
Rf 原点原到点组到分溶斑剂点前质 心 沿量 的 的中 距 距离 离dLs
Rf范围：
0< Rf <1 Rf = 0.2~0.8（常用） Rf = 0.3~0.5（最佳）